La dysplasie fibromusculaire artérielle (DFM) est un groupe de pathologies vasculaires non inflammatoires, et non athéromateuses de la paroi artérielle. Elle est caractérisée par la sténose, l'occlusion, l’anévrisme ou la dissection des artères de petit et moyen calibres, en particulier les artères rénales et le tronc supra-aortique. La DFM est un facteur de risque de l’hypertension et de l’accident vasculaire cérébral. Elle touche essentiellement les femmes (80% des cas) de moins de 50 ans. La prévalence en population générale est inconnue et les estimations varient de 0.4% pour les formes cliniques à 4% dans une cohorte de donneurs de reins. Une agrégation familiale a été démontrée et une composante génétique suggérée. L'objectif de mon travail de thèse était de caractériser les bases génétiques la DFM. Dans la première partie, nous avons analysé des variants génétiques rares générés par séquençage d'exomes chez 16 cas apparentés de DFM issus de 7 fratries. Aucun gène majeur n’était muté pour l’ensemble des fratries ou pour au moins 3 fratries sur 7. Cependant, nous avons pu mettre en évidence puis validé un enrichissement en variants rares à fort potentiel fonctionnel de quatre gènes candidats pour la DFM (MYLK, OBSCN, DYNC2H1, RNF213) en combinant l’approche de séquençage d’exomes et l’étude d’association gène entier de 62767 variants rares (MAF < 5%) générés par génotypage avec la puce Exome-chip chez 249 cas non apparentés de DFM et 689 témoins. Cependant, l’implication de ces gènes dans la DFM doit être confirmée dans d’autres familles, et par des études de validations fonctionnelles. Dans la seconde partie, nous avons étudié l'association avec la DFM de 25606 variants fréquents (MAF ≥ 5%) de l’Exome-chip. Les résultats majeurs obtenus ont été répliqués dans une première étude (402 cas de DFM et 2537 témoins) puis dans 3 autres études incluant 512 cas de DFM et 669 témoins. La méta-analyse de l’ensemble a permis d’associer à la DFM le polymorphisme rs9349379-A situé dans l’intron du gène PHACTR1 (OR=1,39 [1,39-1,54] ; P=7,36 ×10-10). Ce variant est aussi un facteur de risque pour la maladie coronaire, la migraine et la dissection de l’artère cervicale. Des études complémentaires conduites chez 2458 volontaires non malades ont permis de montrer que l’allèle à risque pour la DFM, rs9349379-A est associé avec une augmentation de l’épaisseur intima média (P=1,97×10-4) et du rapport de la paroi sur la lumière artérielle (P=0,002), deux paramètres décrits comme augmentés chez les cas de DFM dans des études antérieures. Ensuite, PHACTR1 a été détecté par immunohistochimie dans l’endothélium et les cellules musculaires lisses de carotides dysplasiques et non dysplasiques avec une expression augmentée de PHACTR1 pour les porteurs de l’allèle à risque de DFM dans des cultures primaires de fibroblastes humains (N=86, P=0,003). Enfin, l’invalidation de Phactr1 chez le poisson zèbre conduit à une dilatation des vaisseaux indiquant un défaut du développement vasculaire. Ce travail confirme le caractère multifactoriel et hétérogène de la DFM et ouvre de nouvelles perspectives pour évaluer l’ensemble de la variabilité génomique des patients de DFM par des approches massives de génétique épidémiologique. / Fibromuscular dysplasia (FMD) is a group of nonatherosclerotic and noninflammatory vascular diseases leading to stenosis, aneurysm, dissection and/or occlusion of medium-sized arteries, in particular the renal and extracranial cervical arteries. Clinical manifestations of FMD are hypertension, dizziness, pulsatile tinnitus, transient ischemic attack or stroke, according to the involved arterial beds. FMD occurs predominantly (80% of cases) in females under 50 years with a variable prevalence estimation from 0.4% for asymptomatic clinical relevant forms to 4% in potential renal donors. The pathogenesis of FMD is unknown and a genetic origin is suspected given its demonstrated familial aggregation. The aim of my thesis work was to characterize genetic basis of FMD. In the first part of this thesis, we analyzed whole exome sequencing data in 16 related FMD cases from seven families. No gene harbors variants that were shared by all affected members in at least three out seven families. Using combined strategy of whole exome sequencing and gene based association study of 62,767 rare variants (MAF < 5%) generated by Exome‐chip arrays in 249 unrelated FMD cases and 689 controls, we have identified and validated an enrichment of rare and putatively functional variants in four candidates genes (MYLK, OBSCN, DYNC2H1 and RNF213). This results need to be validated in other FMD families and by functional analysis. In the second part, we analyzed 25,606 common variants (MAF ≥ 5%) generated by Exome‐chip array. Top loci were replicated in first replication study (402 cases and 2,537 controls) and in 3 others studies (512 cases and 669 controls). Meta-analysis of all including 1,154 unrelated FMD cases and 3,895 controls allowed identification of association between FMD and rs9349379-A (OR=1.39 [1.39-1.54]; P=7.4×10‐10). rs9349379 is intronic to PHACTR1, a risk locus for coronary artery disease, migraine, and cervical artery dissection. The analyses of geometrical parameters of carotids from 2,458 healthy volunteers indicated higher intima media thickness (P = 1.97×10‐4) and wall to lumen ratio (P = 0.002) in rs9349379‐A carriers, suggesting indices of carotid hypertrophy as previously described in carotids of FMD patients. Immunohistochemistry detected PHACTR1 in endothelium and smooth muscle cells of FMD and normal human carotids. The expression of PHACTR1 by genotypes in primary human fibroblasts showed higher expression in rs9349379‐A carriers (N=86, P=0.003). Phactr1 knockdown in zebrafish resulted in dilated vessels indicating subtle impairment of vascular development. This work confirms the multifactorial and heterogeneous genetic architecture of the FMD and opens new opportunities to evaluate all of genomic variability of FMD patients with massive genetic epidemiology approaches.

No description available.

Les récepteurs de type Toll (TLR) sont des récepteurs cellulaires jouant un rôle pivot dans le déclenchement de la réponse immunitaire après une infection ou une blessure, c'est-à-dire une inflammation. L'activation de la signalisation TLR a été associée à l’épilepsie. Dans ce projet, j'utilisai trois modèles distincts pour étudier comment le déclenchement des TLR contribue à l'épileptogenèse. Il existe une corrélation entre les malformations corticales développementales telle la dysplasie corticale focale (FCD) et convulsions fébriles dans les enfants de bas âge. Récemment, une réponse neuro-inflammatoire fut identifiée dans les lésions FCD. Nous postulâmes que l'inflammation induite par le FCD peut augmenter la sensibilité aux crises (chapitre 2). Nous modélisâmes FCD en induisant une congélation-lésion corticale chez le rat néonatal. La lésion corticale déclencha des effecteurs en aval de TLR4, spécifiquement le précurseur de la cytokine Caspase-1, dans l'hippocampe ipsilatéral à la lésion. Les rats lésés développèrent des crises fébriles expérimentales nettement plus rapidement que les rats témoins. Le blocage de l'activité de la Caspase-1 prolongea significativement la latence des crises chez les rats lésés. Nos résultats impliquent l'inflammation médiée par la Caspase-1 en tant que déclencheur des crises fébriles chez les enfants avec FCD préexistante. Des études antérieures déterminèrent que l'activation systémique de la cascade TLR4 abaisse le seuil de crise. Nous étudiâmes si la pénétration des cellules immunitaires périphériques dans le cerveau pendant la stimulation TLR4 favorise l'activité ictal en stimulant la voie TLR4 dans les leucocytes prélevés sur la rate de rat (splénocytes). Ensuite, nous co-cultivâmes des splénocytes avec des coupes organotypiques dérivées du cerveau in vitro (chapitre 3). L'ajout de splénocytes stimulés par TLR4 donna lieu à une neuro-inflammation et à une excitation neuronale accrue. L’ajout de splénocytes non-stimulés n’eut aucun effet pro-inflammatoire ou pro-excitateur dans les coupes organotypiques. De plus, l'inhibition de la Caspase-1 dans des coupes organotypiques co-cultivées avec des splénocytes stimulés diminua la neuro-inflammation et l'hyperexcitabilité neuronale. Nos résultats suggèrent que l'infiltration de leucocytes activés par TLR4 dans le cerveau augmente la prédisposition aux crises via les mécanismes médiés par la Caspase-1. Précédemment, des rapports montrèrent que l'activation de la signalisation TLR3 facilite l'évolution des crises. L'introduction d'un agoniste synthétique TLR3 chez la souris in vivo et des coupes organotypiques hippocampiques in vitro produisirent des mécanismes anti-inflammatoires dépendants de la dose et du temps (chapitre 4). La stimulation TLR3 supprimait les crises d'hippocampe in vivo et réduisait l'excitabilité synaptique dans le réseau hippocampique à la fois in vivo et in vitro. Nous avons déterminé que les effets anticonvulsivants médiés par TLR3 étaient principalement provoqués par les cascades en aval IRF3 / IFN-β. Ainsi, nos données suggèrent que l'activation de TLR3 peut protéger le cerveau contre les crises par la production d'IFN-β. Nos résultats donnent un aperçu des nouveaux mécanismes cellulaires sous-jacents à la modulation inflammatoire de l'excitabilité neurale. Notre découverte des rôles de la Caspase-1 et de l'IFN-β dans l'influence du seuil de crise améliorera notre compréhension des fondements moléculaires de la génération de crises ce qui pourraient améliorer le traitement de l'épilepsie. / Toll-like receptors (TLRs) are cellular receptors that play a pivotal role in initiating immune response following infection or injury, i.e. inflammation. Nevertheless, activation of TLR signaling has been associated with seizure manifestation. In this research, I employed three distinct models to study how triggering TLRs contributes to ictogenesis. There is a correlation between developmental cortical malformations, e.g. focal cortical dysplasia (FCD), and fever-provoked, i.e. febrile, seizures in young children. Recently, neuroinflammation was reported in FCD lesions. Therefore, we posited that FCD-induced inflammation may increase seizure susceptibility (Chapter 2). To recapitulate FCD pathology, we induced a cortical freeze-lesion in neonatal rats. Lesioning the cortex triggered TLR4 downstream effectors, specifically the cytokine precursor Caspase-1, in the hippocampus ipsilateral to the lesion. Further, lesioned rats developed experimental febrile seizures markedly faster than sham control rats. Strikingly, blocking Caspase-1 activity prior to seizure induction significantly prolonged seizure latency in lesioned rats. Our results implicate Caspase-1-mediated inflammation as a main driver of febrile seizures in children with pre-existing brain malformations. In addition, previous reports determined that systemic activation of TLR4 cascade lowers seizure threshold. Hence, we developed an in vitro model to investigate whether penetration of peripheral immune cells into the brain during TLR4 stimulation promotes ictogenic activity (Chapter 3). First, we stimulated TLR4 pathway in leukocytes harvested from rat spleen, i.e. splenocytes. Thereafter, we co-cultured splenocytes with brain-derived organotypic slices in vitro. Adding TLR4-stimulated splenocytes gave rise to neuroinflammation and enhanced neuronal excitation, whereas adding unstimulated splenocytes failed to evoke pro-inflammatory or proexcitatory effects in organotypic slices. Moreover, Caspase-1 inhibition in organotypic slices cocultured with stimulated splenocytes diminished neuroinflammation and neuronal hyperexcitability. Our findings suggest that infiltration of TLR4-activated leukocytes into the brain elevate seizure predisposition via Caspase-1-mediated mechanisms. Beside TLR4 pathway, it was previously shown that activation of TLR3 signaling facilitates seizure evolution. In chapter 4, introducing a synthetic TLR3 agonist to mice in vivo and to hippocampal organotypic slices in vitro yielded anti-inflammatory mechanisms in a dose- and time-dependent manner. Also, we found that TLR3 stimulation suppressed hippocampal seizures in vivo and reduced synaptic excitability in the hippocampal network both in vivo and in vitro. Finally, we determined that TLR3-mediated anticonvulsive effects were chiefly driven by IRF3/IFN-β downstream cascades. Thus, our data suggests that TLR3 activation may protect the brain from seizures through production of IFN-β. Altogether, our findings provide insight into novel cellular mechanisms underlying inflammatory modulation of neural excitability. Furthermore, our discovery of the roles of Caspase-1 and IFN-β in influencing seizure threshold will improve our understanding of the molecular underpinnings of seizure generation, which may ultimately have therapeutic benefits for epilepsy treatment.

Contexte : Près de 2,5 millions de nouveau-nés meurent chaque année et plus de 80 % d'entre eux ont un petit poids à la naissance (PPN). Le PPN est une entité clinique complexe impliquant le retard de croissance in utero (RCIU) et la naissance prématurée (NPM). Les nouveau-nés survivants sont exposés à un risque élevé de morbidités périnatales graves (telles que la dysplasie broncho-pulmonaire, l'entérocolite nécrosante, l'encéphalopathie néonatale) en raison des effets dévastateurs de l'inflammation utéro-fœtale sur les organes fœtaux vulnérables. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace pour la protection fœtale ante partum. Parmi les nombreux médiateurs pro-inflammatoires, l'IL-1β se distingue par ses effets délétères. Notre laboratoire a conçu un nouvel antagoniste allostérique du récepteur de l'IL-1, Rytvela, qui s'est avéré efficace contre la NPM lorsqu'il est administré en prophylaxie. Objectif : Cette étude vise à mieux caractériser Rytvela en évaluant son efficacité dans la prévention de la NPM et du RCIU lorsqu'il est administré après l'insulte inflammatoire initiale selon un cadre clinique plus réaliste. Méthodes : Des souris gravides CD-1 ont reçu une injection d'agents pro-inflammatoires/pro-travail, soit l’IL-1β (1 μg i.u.) ou le LPS (10 μg i.p.) aux jours 16-17 de la gestation. Rytvela (2 mg/kg/jour s.c.) a été administré à différents intervalles de temps (0,5h, 2h, 4h, 6h) après l’induction inflammatoire. Le taux de NPM, la survie et le poids des souriceaux ont été évalués. Des analyses histologiques des poumons, intestins et cerveau des nouveau-nés ont été réalisées. Résultats : Toutes les grossesses traitées avec Rytvela ont été menées à terme dans le modèle de l’IL-1β, alors que le taux de NPM était de 57 % dans le groupe non traité. La survie, la croissance et le poids des souriceaux ont été considérablement améliorés avec Rytvela administré 0,5 h post-inflammation (avec une survie presque doublée des portées). L'analyse histologique a révélé dans tous les modèles une morphogenèse fœtale protégée, y compris une alvéolarisation pulmonaire préservée, des villosités intestinales intactes et un arbre cérébrovasculaire protégé associé à une masse cérébrale préservée. Conclusion : Rytvela est efficace dans la prévention de la NPM et du RCIU lorsqu'il est administré en post-inflammatoire. Il présente un effet maximal lorsqu'il était administré rapidement (0,5 h après IL-1β/LPS) et maintenait des effets protecteurs fœtaux significatifs avec une administration retardée (jusqu'à 6 h après IL-1β/LPS). Rytvela améliore la survie et la santé néonatale en préservant l'intégrité et la croissance des tissus fœtaux. Par conséquent, Rytvela est un nouveau prototype thérapeutique prometteur et sécuritaire pour le traitement de la NPM et du RCIU. / Background: Over 2.5 million newborns die yearly and more than 80% of them are of low birthweight (LBW). LBW is a complex clinical entity involving fetal growth restriction (FGR) and preterm birth (PTB). Surviving neonates face a higher risk of serious perinatal morbidities (such as bronchopulmonary dysplasia, necrotizing enterocolitis, neonatal encephalopathy) due to the devastating effects of utero-fetal inflammation on vulnerable fetal organs. There is currently no efficient treatment for fetal antepartum protection. Among the many proinflammatory mediators, IL-1β stands out for its detrimental effects. The host lab has designed a novel allosteric IL-1 receptor antagonist, Rytvela, which has been shown to be effective against PTB when administered prophylactically. Objective: This study aims to further characterize Rytvela by evaluating its efficacy in preventing PTB and FGR when administered after the initial inflammatory insult according to a more realistic clinical setting. Methods: Pregnant CD-1 mice were injected with proinflammatory/prolabour agents, either IL-1β (1 μg i.u.) or LPS (10 μg i.p.) on days 16-17 of gestation. Rytvela (2 mg/kg/day s.c.) was administered at different time intervals (0.5, 2, 4, 6 h) after initial inflammatory insults. PTB rate, neonatal survival, and weight were assessed. Histological analyses of the lungs, intestines, and brain of the neonates were performed. Results: All pregnancies treated with Rytvela were carried to term in the IL-1β model, while the PTB rate was 57% in the untreated group. Pup survival, growth and weight were considerably improved with Rytvela administered 0.5h post-inflammatory insults (with a nearly 2-fold increase in litters survival). Histological analysis revealed in all models a protected morphogenesis of vulnerable fetal organs including preserved lung alveolarization, intact intestinal villi integrity, and protected cerebrovascular tree associated with preserved brain mass. Conclusion: Rytvela is efficient in preventing PTB and FGR when administered post-inflammatory insults. It exhibited maximum effect when administered promptly (0.5h post-IL-1β/LPS) and maintained significant fetal protective effects with delayed administration (up to 6h post- IL-1β/LPS). Rytvela improved birth outcome by preserving fetal tissue integrity and growth. Hence, Rytvela is a promising new and safe therapeutic prototype for treatment of PTB and FGR.