Orientador: Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T11:39:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DellaColleta_HeloisaHelenaMithie_M.pdf: 7792651 bytes, checksum: ff84cc76671c0361c593dd32f633470a (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: o Fator Necrosante Citotóxico do tipo 2 (CNF 2) foi obtido através do rompimento celular bacteriano por ultra-som. Após a extração, purificou-se o CNF 2 por precipitação com sulfato de amônia, cromatografia em resina de troca aniônica Q­ Sepharose Fast Flow e em resina de gel filtração molecular Superdex 200. A atividade específica do CNF 2 purificado foi de 2.925 e o grau de pureza do material aumentou em tomo de 8.000 vezes. Ensaios de caracterização sorológica foram realizados com antissoros de coelho e camundongo. Os antissoros produzido_ contra CNF 2 foram capazes de inibir o efeito citotóxico de CNF 1 e CNF 2, sendo. que o título neutralizante foi maior contra o seu homólogo. Os antissoros, porém, não inibiram as atividades biológicas de VT 1, VT 2 e L T I. Em ensaios de imunodifusão radial, os antissoros reconheceram tanto CNF 1 como CNF 2, apresentando identidade parcial entre eles. Quando o antissoro foi absorvido com extrato sonicado de CNF 1, este passou a não mais reconhecer CNF 1. Nos ensaios de ELIS_ "wersten-blot" e "dot-ELISA" os antissoros não se mostraram específicos, reconhecendo além de CNF 2, CNF 1, VT 1, VT 2 e L T I. Foram realizados ensaios de caracterização do efeito biológico de CNF 2, que revelaram que esta toxina foi capaz de causar necrose em pele de coelho e em pata de camundongo. O efeito de multinucleação celular foi observado em células Vero e em células HeLa, sendo que em células Vero este efeito foi mais claramente observado; nas células HeLa foi possível observar aumento de células multinuc1eadas, que já eram observadas nos controles. Foi possível observar também, que a toxina leva ao acúmulo de RNA nos núcleos e à formação de grandes vacúolos ao redor do núcleo. Em ensaios de marcação dos componentes do citoesqueleto, foi possível verificar que, após 8 horas de tratamento com CNF 2, as células apresentam alterações dos filamentos de actina, com formação de fibras de estresse. Esse efeito aumenta conforme o teste é prolongado. Quanto aos microtúbulos, não foram observadas alterações claras. Parece ocorrer apenas uma adaptação destes filamentos à presença de mais de um núcleo. o estudo epidemiológico revelou que havia produção de CNF em 19,05% das amostras isoladas de fezes de bezerros e que, das amostras produtoras de CNF, 30,77% produziram também et.-hemolisina / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Mauro Faber de Freitas Leitão / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-27T02:47:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Manhani_MariaRaquel_M.pdf: 18520155 bytes, checksum: 830e7262a88a35f98894c3dc5dffee65 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A etapa inicial deste trabalho consistiu na avaliação da resistência de uma cepa de Escherichia colí 0157:H7 e da microbiota contaminante de queijo Minas frescaI a antibióticos utilizados para conferir seletividade a meios de isolamento dessa bactéria. Observou-se que E colí 0157:H7 mostrou sensibilidade a concentrações de novobiocina superiores a 30 mg/L, sendo desaconselhável o uso de 100 mg/L, conforme preconizado em alguns meios de isolamento. Como o microrganismo mostrou-se menos tolerante à combinação de três antibióticos (cefixima a 0,05 mg/L, cefsuloqina a 10 mg/L e vancomicina a 8 mg/L) do que a microbiota contaminante do queijo frescal, tornou-se questionável a indicação do uso desses antibióticos para conferir seletividade aos meios de isolamento da bactéria. Em outra etapa foram avaliados os meios seletivos MacConkey sorbitol modificado, HC de acordo com 8zabo et aI. (1986), Rainbow 0157, EMB modificado e 8039 modificado, suplementados ou não com cefixima (0,05 mg/L) e telurito de potássio (2,5 mg/L), na contagem de Ecolí 0157:H7, inoculada experimentalmente em amostras de queijo Minas frescal e de leite, submetidas ou não a tratamento térmico. Os resultados revelaram a inadequação de todos esses meios nas contagens de amostras apresentando elevada contaminação (sem tratamento térmico). Nas amostras com contaminação baixa (tratadas termicamente), os meios HC e 8039 modificado, ambos suplementados, revelaram desempenho superior na análise de queijo (95,9 e 95,0 % de recuperação, respectivamente). Na análise de leite, o HC foi o mais eficiente, levando a 85,3% de recuperação. A técnica do Número Mais Provável revelou-se deficiente e pouco prática na contagem de E colí 0157:H7 em amostras de queijo, não representando, portanto, uma alternativa recomendável. Na avaliação qualitativa de Ecolí 0157:H7 foram avaliados os enriquecimentos em caldo BPW + 3 antibióticos, segundo Blanco et aI. (1996), em meio mEC+n segundo Okrend & Rose (1989), em meio mT8B segundo Padhye & Ooyle (1991), além do método proposto pelo FOA (1998) e o método imunoenzimático TECRA@. Na análise de amostras de queijo Minas frescal inoculadas experimentalmente, nenhum dos sistemas revelou desempenho altamente satisfatório. No entanto, entre as metodologias clássicas testadas, a do FDA mostrou-se superior, enquanto o método TECRA@foi aquele que, comparativamente, possibilitou a maior porcentagem de isolamentos e menor índice de resultados falso-negativos. Na análise de 60 amostras de queijo Minas frescal, submetidas ou não a inspeção federal, nenhuma delas revelou a presença de E. coli 0157:H7. Os resultados obtidos indicaram a necessidade de se aperfeiç.oar a metodologia para a pesquisa deste patógeno em alimentos, principalmente naqueles cuja microbiota contaminante apresenta-se em números elevados / Abstract: In a first experiment, it was evaluated the tolerance of Escheríchía colí 0157:H7 and natural contaminants found in Minas frescaI cheese to antibiotics used in selective culture media. It was noticed that E. colí 0157:H7 exhibited low tolerance to novobiocin concentrations above 30 mg/L, although the use of 100 mg/L is indicated in some isolation media. The microorganism was less tolerant to antibiotic combination (cefixime at 0,05 mg/L, cefsulodin at 1O mg/L and vancomincin at 8 mg/L) when compared to the natural contaminant cheese microflora what could be a drawback concerning the use of these agents in selective culture media. In a second experiment, the selective media MacConkey sorbitol (modified), HC according to Szabo (1990), Rainbow 0157, modified EMB and modified S039, supplemented or not with cefixime (0,05 mg/L) and potassium telurite (2,5 mg/L) were evaluated for E. colí 0157:H7 counting, with the bacterium inoculated in Minas frescal cheese and milk samples, both submitted or not to thermal treatment. Ali the tested media were inadequate when used for bacterial counts in the samples with high natural contamination (without thermal treatment). However, when the cheese samples with lower contamination were analyzed, the media HC and modified S039, both supplemented, showed superior performance (95,9 and 95,0% recovery, respectively). In milk analysis, HC medium was the most efficient (85,3% recovery). The Most Probable Number technique showed an inadequate performance for E. colí 0157:H7 counts. For the qualitative evaluation of E. coli 0157:H7 it was evaluated BPW+3 antibiotics broth according to Blanco et a/. (1996), mEC+n (Okrend & Rose, 1989), mTSB (Padhye & Ooyle, 1991), FOA proposed method (1998) and the immunoenzimatic method TECRA@.None of the tested methods showed superior performance for E. calí 0157:H7 recovery in inoculated cheese samples in the presence of the natural microflora. However the FDA method was the most efficient among the classical ones, while the TECRA@ assay was the best concerning E. calí 0157:H7 recovery and no false negative results. The results suggest the need for improvment in the methodology for E. calí / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador : Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T21:10:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Penatti_MarioPauloAmante_M.pdf: 2606360 bytes, checksum: d5aff3af7c7d005e94ec179b684a471b (MD5) Previous issue date: 2001 / Mestrado

Orientador : Wanderley Dias da Silveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T20:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_TatianaAmabilede_M.pdf: 4297447 bytes, checksum: c078f5098bf0b5358810269be795f8b0 (MD5) Previous issue date: 2002 / Mestrado

Orientador : Antonio Fernando Pestana de Castro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T14:05:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Penteado_AdrianadeSousa_D.pdf: 4795467 bytes, checksum: 364853d1fabfe642be1badec07bbada3 (MD5) Previous issue date: 2002 / Doutorado

Orientadora: Laura Maria Mariscal Ottoboni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:10:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Orsi_RenatoHohl_M.pdf: 4854669 bytes, checksum: 67d18ea04dea6cb272654a5aefb0afc0 (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:38:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stehling_ElianaGuedes_D.pdf: 4279256 bytes, checksum: 060a8c82e3c0a43c76a25979525911e0 (MD5) Previous issue date: 2003 / Doutorado

Orientadores: Antonio Fernando Pestana de Castro, Jorge Blanco Alvarez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:21:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ugrinovich_LeilaAidar_D.pdf: 8373928 bytes, checksum: aa5a6acc9829d07ea484dd4d083b5fa2 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Foram isoladas 98 amostras de Escherichia coli, portadoras dos genes eae, stx, ou ambos, entre 264 bezerros diarréicos e 282 bezerros sadios, com idade entre 4 a 5 meses. Uma vez positivas em PCR para 1 ou ambos os genes, as amostras foram estudadas quanto presença de genes que codificam para enterotoxinas e citotoxinas: Termo lábil I (LT-I), Termo lábil li (LT-lI), Termo estável a (Sta), Termo estável b (STh), Fator necrotizante citotóxico 1 (CNF1), Fator necrotizante citotóxico 2 (CNF2), EaggEC heat-stable toxin 1 (EAST1) e Enterohemolisina (Eh1y), sendo que Eh1y foi testado também quanto a sua expressão, em ágar sangue. Entre os animais diarréicos, obtivemos 27 animais (10,2%) stx positivos e 15 animais (5,68%) eae positivos e entre os animais sadios, obtivemos 22 (7,8%) stx positivos e 17 (6,03%) eae positivos. Genes para CNF foram encontrados entre 5 (1,9%) animais diarréicos e 4 (1,4%) animais não diarréicos. LT-lI foi encontrada em uma única amostra isolada de um animal diarréico. Ehly foi encontrada em 20 (7,6%) animais diarréicos e 22 (7,8%) animais sadios. O gene ast1 foi encontrado em apenas 2 animais, sendo um diarréico e um sadio. Dos genes que codificam para as adesinas pesquisadas (BFP e Saa), somente saa foi encontrado (22mnostras),sendo-queoplasmídio EAF não esteve presente. As amostras eae+ foram pesquisadas através de PCR quanto ao subtipo de intimina apresentado, sendo que 17 amostras foram positivas para o subtipo 131, 15 amostras foram positivas para o subtipo y2, 3 amostras foram positivas para E, 2 amostras apresentaram-se ç+ e 1 amostra apresentou-se µ1+. As 10 amostras restantes apresentaram intimina Não Tipável. Também testamos estas amostras quanto à produção da lesão AlE, através do teste de F AS, sendo que 33 amostras apresentaram-se positivas neste teste, 10 apresentaram-se negativas e 5 não puderam ser testadas, pois não aderiram à linha celular HEp-2. Quando testamos estas amostras eae+ quanto à inserção de LEE, a grande maioria (37 amostras) apresentou pheU interrompido, indicando uma provável presença de LEE inserido neste locus. Todas as amostras foram testadas quanto à aderência em células HEp-2. Dez amostras apresentaram aderência Difusa (10,20%), 14 apresentaram aderência Agregativa (14,3%), 17 apresentaram aderência Localizada-like (17,3%), 26 apresentaram aderência Não Característica (26,5%) e 25 (25,5%) foram negativas para este teste. Uma amostra demonstrou aderência do tipo Cover Slip (1%) e 5 amostras provocaram descolamento do tapete celular (5%). O teste de Separação Imuno-Magnética (SIM) não favoreceu o isolamento de nenhuma amostra de E. coZi do sorogrupo 0157 entre as 50 amostras de carne bovina crua e 50 amostras fecais testadas / Abstract: Ninety eight strains of Escheríchía colí fTom 264 diarrheic calves and 282 hea1thy ones were studied. Screening was made based on the presence of genes eae, stx or both. These 98 strains were also tested for presence of genes encoding toxins: LT-I, LT-II, STa, STh, CNFl, CNF2, EASTl and Ehly. Twenty seven diarrheic calves (10,2%) were positive for stx genes and 15 (5,7%) were positive for eae gene. Among the hea1thy calves twenty two (7,8%) were positive to stx genes and 17 (6,0%) were positive to eae gene. The genes for CNF were isolated fTom 5 (1,9%) diarrheic calves and 4 (1,4%) non diarrheic ones calves. Only one strain Itll+ was isolated. The Eh/y was founded in 20 (7,6%) diarrheic calves and in 22 (7,8%) healthy caIves. When the 98 strains were tested for presence b.fp, eaf or saa genes, we only found 22 saa positive strains. From eae+ strains studied,17 were positive togene for _1 intimin subtype, 15 were positive to y2 subtype, 3 were positive to & subtype, 2 were positive to ç; subtype and only one strain was positive to the gene encoding to J.I. subtype. The 10 remaining strains were non-typable. Among the eae+ strains, 33 were positive in the Fluorescence Actin Staining test (FAS) and 14 strains react with anti intimin antisera used in Westem blot. These 48 eae+ strains were tested by PCR to determine the local of LEE insertion into the E. colí chromosome. pheU interrupted was observed in 37 strains indicating that LEE is probably inserted in this locus. By the cell culture assay in HEp-2 cells, 10 strains (10,2%) showed diffuse adesion (DA), 14 enteroaggregative adhesion (14,3%), 17 (17,3%) localized like adhesion (LAL), 26 (26,53%) strains showed no characteristic adhesion (NC), 1 strain showed cover slip (CS) adhesion and 25 strains were no adherent to HEp-2 cells. No 0157 strains were isolated by Imunno Magnetic Separation (IMS), either fTom the 50 raw meat or fecaI specimens examined. / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Tomomasa Yano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T11:53:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Catani_CleideFerreira_D.pdf: 5873013 bytes, checksum: 5656176a69a0675e7a4b73dab8537c20 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: As enterohemolisinas (EHly) foram inicialmente detectadas em amostras de Escherichia co/i enteropatogênicas clássicas (EPEC), isoladas a partir de fezes de crianças com diarréia, sendo posteriormente detectada em amostras de E. co/i isoladas de animais. Esta hemolisina, diferentemente da a-hemolisina, não é liberada espontaneamente no meio de cultivo, sendo necessária sua extração da célula bacteriana. Entre os métodos de extração utilizados, a sonicação mostrou ser o método mais eficiente para a liberação da enterohemolisina. Para a detecção da atividade hemolítica, os diferentes materiais a serem testados foram incubados a 37°C por lh, em microplacas ou em tubos, com 1% de eritrócitos de carneiro lavados com tampão PBS. A amostra padrão de E. co/i C3888 foi utilizada para a produção e purificação da enterohemolisina. Esta cultura foi cultivada em meio TSB, acrescido de quelante de ferro EDDA, por 22 horas em shaker a 37°C. Após o cultivo, a cultura foi sonicada e precipitada com sulfato de amônio com 60% de saturação. O material precipitado foi cromatografado em coluna de DEAE FastFlow. As frações com atividade hemolítica foram recromatografadas em coluna de exclusão molecular Superdex 200 e posteriormente em coluna Mono Q no sistema HPLC. A fração com atividade hemolítica obtida da coluna Mono Q apresentou apenas uma banda de 60kDa em gel de SDS-P AGE. No processo de purificação foi obtido um aumento na atividade específica de 2800 vezes, e aproximadamente 100 vezes na atividade relativa. A atividade da EHly se manteve estável por diversos meses no sonicado de cultura, quando este foi mantido a baixas temperaturas (-20°C e -70°C). Entretanto, não foi possível manter a atividade da hemolisina pura nos processos finais de purificação. Apesar da utilização de três diferentes métodos de inoculação em coelhos, para a obtenção de antissoro específico anti-enterohemolisina, não foram obtidos resultados satisfatórios nos testes de neutralização realizados, já que os títulos de soroneutralização obtidos foram os mesmos com soros pré e pós-imunização. Em testes com diferentes culturas celulares, a enterohemolisina semi-purificada foi citotóxica para as culturas de células Hep-2, HeLa, Caco-2, Vero, MDBK e 3T3, com arredondamento celular e descolamento do tapete. As células CHO apresentaram um efeito citopático, com alongamento das células e aparente condensação do núcleo. Nos ensaios com camundongos, não foi observado letalidade ou toxicidade nos animais adultos ou nos recém-nascidos testados / Abstract: Enterohaemolysins (EHly) were ftrst detected in classical enteropathogenic Escherichia coZi strains (EPEC), isolated from feces of infants with diarrhea, and also detected in strains isolated from animaIs. Differring from a-haemolysin, EHly is not spontaneously released to culture medium. Sonication was the most efficient method to extract EHly. In order to detect haemolitic activity, the material was incubated for lh at 37°C in microplates or in tubes, with 1 % sheep erytrocytes, washed with PBS buffer. E. coZi strain C3888 was used to carry out production and puriftcation trials. Bacteria was cultivated in TSB medium with EDDA iron chelant, for 22h at 37°C. The cells were sonicated and the pellet submitted to cromatography in DEAE Fast-Flow column. The fractions that showed 8;ctivity were applied to Superdex-200 and Mono Q HPLC columns. The fraction with haemolitic activity obtained from Mono Q cromatography showed just one 60kDa band in SDS-P AGE electrophoresis gel. Increases of 2800 times in specrnc activity and aproximately 100 times in relative activity were obtained. The activity remained stable for several months in sonicated material when it was kept at low temperatures (-20°C to -70°C). However, it was not possible. to maintain the activity of pure haemolysin in the final purification procedures. Neutralization tests with specific anti-EHly antiserum did not present satisfactory results, despite the three different inoculation methods we tested in rabbits. Titles obtained with pre- and post-immunized sera were the same. In tests with different cell cultures, semipurified EHly proved to be citotoxic to Hep-2, HeLa, Caco-2, Vero, MDBK and 3T3 cells, showing cell rounding and detachment of the cell layer. CHO cells presented a cytopathic effect, with elongation and apparent condensation of the nuclei. No lethality or toxicity were observed in tests carried out in mice / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências

Orientador: Antonio Fernando Pestana de Castro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T16:52:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leonardo_MartaBeatriz_M.pdf: 4436936 bytes, checksum: 8df9211405166fd05a0c6d0c564d6248 (MD5) Previous issue date: 1981 / Resumo: Com objetivo de oferecer a laboratórios menos equipados, e, portanto, sem infraestrutura para realizar a detecção de colibacilos enterotoxigênicos produtoes de enterotoxina termolábil (LT), fez-se uma avaliação da prova de Imunohemólise Radial (SRIH) para este fim. Os principais resultados e conclusões obtidos à partir deste estudo podem ser assim resumidos: Utilizando deferentes diluições de sobrenadantes de culturas provenientes da amostra de E. coli 40T (incluída no grupo I, fortemente enterotoxigênica) frente a diferentes diluições de antitoxina colérica, realizou-se um estudo comparativo entre os testes da SRIH e da Imunohemólise Passiva (PIH). Verificou-se, através deste estudo, que o teste da SRIH é tão sensível quanto o da PIH, para a detecção de enterotoxina LT, quando se correlacionou o diâmetro (em mm) do halo de hemólise com a absorbância, a 420 nm, ou com a quantidade de hemoglobina liberada ('mu¿g/ml), sendo que os valores de r, para n = 25, foram, respectivamente, 0,748 e 0,755. Pode-se considerar como resultado positivo, no teste da SRIH, valores sod diâmetros dos halos de hemólise, superiores a 12,43 mm; valores negativos, aqueles inferiores a 11,33 mm, e duvidosos, aqueles compreendidos entre 11,33 e 12,43mm, conforme estabelecido pelo cálculo do intervalo de Confiança. O teste não apresentou nenhuma reação falso-positivo nas diluições de antitoxina colérica maiores (1:40 e 1:80), sendo, portanto, específico. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas