Devido a dificuldades técnicas de modelagem experimental e de aferição de dor, até os anos 70, acreditava-se que recém-nascidos e lactentes jovens não teriam maturidade neurológica para conduzir, de forma adequada, os estímulos dolorosos; portanto, não sentiam dor. Recentes estudos, focados na área de neurobiologia do desenvolvimento, têm demonstrado como as informações sensoriais são processadas no início da vida e que dor intensa ou persistente no prematuro ou neonato pode provocar alterações de comportamento e percepção da dor que podem persistir no decorrer da vida. Considerando a relevância do tema, este trabalho teve como objetivo avaliar possíveis alterações comportamentais e bioquímicas, a partir de uma intervenção farmacológica com anestésicos gerais, acompanhados ou não de procedimento cirúrgico realizado no 14°dia de vida do animal. Foram utilizadas 40 ninhadas padronizadas com 8 ratos Wistar machos. O modelo cirúrgico utilizado foi descrito por Levine, modificado por Rice et al. (1981), porém sem a oclusão da carótida. Para as avaliações comportamentais foram utilizados os testes de campo aberto, labirinto em cruz elevado, tail-flick e formalina. O parâmetro bioquímico avaliado foi atividade das enzimas E-NTPDases e ecto-5’nucleotidase. Este trabalho foi dividido em dois desenhos experimentais. No primeiro, os animais foram divididos em 3 grupos: controle (O2), anestesia (isoflurano), anestesia/cirurgia (isoflurano/cirurgia); no segundo, os animais foram divididos em 3 grupos: controle (salina), anestesia (cetamina S+/fentanil), anestesia/cirurgia (cetamina S+/fentanil/cirurgia). Os animais que receberam isoflurano apresentaram aumento na atividade locomotora em P14 e P30 e maior analgesia no tail-flick em P14 e P60, associados a uma diminuição da hidrólise de ATP, ADP e AMP em P14. É importante salientar que o procedimento cirúrgico reverteu a diminuição na hidrólise do ATP e do ADP. Os animais que receberam cetamina S+/fentanil (CF) apresentaram diminuição do nível de ansiedade (P30 e P60) e maior analgesia no tail-flick (P30), associadas a aumento da hidrólise de ATP e AMP, o procedimento cirúrgico reverteu o efeito observado no ATP. Esses resultados indicam que manipulações farmacológicas com anestésicos gerais, como as utilizadas nesta dissertação, em um período de maturação do sistema nervoso central, promovem alterações que podem ser percebidas ao longo da vida do animal. Os anestésicos são capazes de interagir com uma variedade de sistemas neuronais, incluindo sistemas GABAérgico, glicinérgico, colinérgico e glutamatérgico, e alterações em número e/ou afinidade de receptores destes sistemas podem estar contribuindo com os resultados obtidos nesta dissertação. No entanto, as técnicas utilizadas neste estudo não nos permitem determinar os mecanismos de neurotransmissão suscetíveis à exposição a anestésicos gerais, associado ou não ao procedimento cirúrgico, em animais com 14 dias, e envolvidos nas alterações observadas nas respostas comportamentais e bioquímicas em curto, médio e longo prazos. Novos estudos são necessários para melhor elucidar os resultados obtidos. / Due to technical difficulties of modeling and experimental measurement of pain, until the 70th decade, it was thought that newborns and young infants would not have neurological maturity to drive properly painful stimuli, so they felt no pain. Recent studies focused on the area of developmental neurobiology have shown how sensory information is processed at the beginning of life and severe or persistent pain in premature or newborn may cause changes in behavior and perception of pain that can persist throughout life. Considering the relevance of the theme of this work, it was evaluated possible behavioral and biochemical changes from a pharmacological intervention with general anesthetics, associated or not with surgical procedure performed on the 14th day of life of the animal. Fourty litters were used with standard 8 male Wistar rats. The surgical model used was described by Levine, modified by Rice et al. (1981), but without carotid occlusion. For behavioral assessments the open-field, elevated plus-maze, tail-flick and formalin were performed. The biochemical parameters evaluated was the enzymatic activity of E-NTPDases and ecto-5'nucleotidase. This work was divided into two experimental designs: the first, the animals were divided into 3 groups: control (O2), anesthesia (isoflurane), anesthesia / surgery (isoflurane / surgery); in the second, the animals were divided into 3 groups: control (saline), anesthesia (ketamine S+/fentanyl), anesthesia / surgery (ketamine S+/fentanyl / surgery). The animals that received isoflurane showed an increase in locomotor activity in P14 and P30 and greater analgesia in tail-flick in P14 and P60, associated with decreased hydrolysis of ATP, ADP and AMP in P14. It is important to note that the surgery reversed the decrease in the hydrolysis of ATP and ADP. The animals that received ketamine S+/fentanyl had decreased levels of anxiety (P30 and P60) and greater analgesia in tail-flick (P30) associated with increased ATP hydrolysis and AMP, the surgery reversed the effect observed in the ATP. These results indicate that pharmacological manipulation with general anesthetics, such as those used in this work, in a period of maturation of the central nervous system, can promote changes which could be seen throughout the animal's life. Anesthetics are able to interact with a variety of neuronal systems, including systems GABAergic, glycinergic, glutamatergic and cholinergic, and changes in the level of receptors of these systems in numbers and / or affinity may be contributing to the results obtained in this dissertation. However, the techniques used in this study did not allow us to determine the mechanisms of neurotransmission susceptible to exposure to general anesthetics in association or not surgery in animals with 14 days and involved in the observed changes in behavioral and biochemical alterations in short, medium and long term. Further studies are needed to further elucidate the results.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.

Glioblastoma multiforme é a forma mais comum e agressiva de tumor cerebral que apresenta um severo crescimento e um comportamento altamente invasivo. Linhagens de células de glioma em cultura apresentam alta atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase que metaboliza AMP em adenosina. Em adição, ela também interage com componentes da matriz extracelular como molécula adesiva. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito de diferentes componentes da matriz extracelular sobre a atividade da ecto-5’-nucleotidase, proliferação, adesão e migração celular na linhagem de células de glioma humano U138-MG. Os resultados obtidos mostraram uma inibição da atividade enzimática da ecto-5’- nucleotidase quando tratada com laminina sozinha e com fibronectina ou laminina em co-tratamento com dextran sulfato. O dextran sulfato mostrou reduzir a proliferação em 37%. O mesmo efeito foi observado para os co-tratamentos entre dextran/laminina (29%) e dextran/colágeno (28%). A presença de adenosina diminuiu a adesão celular em torno de 40% e o APCP aumentou a adesão em 75%. Laminina inibiu a adesão celular, já a condroitina sulfato aumentou em 70%. As células U138 apresentaram uma redução da adesão e migração celular quando tratadas apenas com dextran e também no co-tratamento deste com adenosina e APCP. Diante dos resultados podemos sugerir a modulação da atividade da ecto5’-nucleotidase e assim uma modulação da produção de adenosina por moléculas da matriz extracelular, afetando assim eventos celulares envolvidos no comportamento invasivo destas células tumorais. / Glioblastoma multiforme is the most aggressive form of brain tumor that shows a severe growth and highly invasiveness behavior. Glioma cell lines in culture present a high activity of the ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT/CD73) which metabolizes AMP to adenosine. In addition, ecto-5’-NT/CD73 also has contact with extracellular matrix components like adhesive molecule. In the present paper, we evaluate the effect of distinct extracellular matrix components on the ecto-5’- NT/CD73 activity, proliferation, adhesion and migration in U138-MG human glioma cell line. The results showed an inhibition of enzymatic activity of ecto-5’NT/CD73 in the presence of laminin, fibronectin plus dextran sulfate and laminin plus dextran sulfate. In the proliferation assay it was observed that dextran sulfate reduced the proliferation in 37% and in association with collagen type I or laminin, the proliferation was reduced too (28% and 29%, respectively). The presence of adenosina decreased of adhesion at about 40% and when treated with APCP increased in 75%. Laminin inhibited the cell adhesion and chondroitin sulfate increased in 70%. U138 cells presented reduction of adhesion and cell migration in the presence of dextran sulfate alone and in the presence of adenosine and APCP. Taken together these results suggest the modulation of ecto-5’-NT/CD73 activity and production of adenosin by extracellular matrix molecules, affecting cell events involved in the invasiveness behavior this tumor cells.

O câncer de bexiga é a segunda neoplasia urogenital mais comum, atinge mais os homens e está relacionado principalmente com o fumo. Os tratamentos atualmente utilizados não são suficientemente efetivos, permitindo os diversos casos de recorrência, progressão do tumor e/ou morte do paciente. Assim, as pesquisas realizadas continuam buscando tratamentos mais efetivos. Diversos estudos revelam o envolvimento do sistema purinérgico na tumorigênese da bexiga, no âmbito das ectonucleotidases, há evidências de alterações em duas delas na progressão do câncer de bexiga: a NTPDase3 e a ecto-5’-NT/CD73. O urotélio normal dos camundongos expressa a NTPDase3 que é expressa em linhagem de câncer de bexiga de grau 1 (RT4), mas não em linhagem de grau 3 (T24). Já a ecto-5’-NT/CD73, não é expressa no urotélio normal de camundongos e tem baixa atividade em linhagem de câncer de bexiga de grau 1 (RT4) em comparação a linhagem de grau 3 (T24), evidenciando a possível participação destas proteínas na progressão do câncer de bexiga. Dessa forma, o objetivo desta tese foi investigar o envolvimento da NTPDase3 e da ecto-5'-NT/CD73 na progressão e malignidade do câncer de bexiga. A fim de caracterizar a expressão dessas enzimas durante a progressão do estabelecimento do câncer de bexiga, camundongos Balb-c receberam N-butil-N-(hidroxibutil)-nitrosamina (BBN) 0,05% em sua água de beber por 4, 8, 12, 18 e 24 semanas. Nas primeiras 8 semanas as bexigas dos animais apresentaram características de inflamação, em 12 semanas iniciaram as transformações neoplásicas que em 24 semanas caracterizaram câncer. NTPDase3 teve sua expressão diminuída nesse processo, enquanto a ecto-5’-NT/CD73 passou a ser expressa e sua expressão foi significativamente maior no utrotélio cancerígeno. A fim de verificar se a atividade das enzimas acompanhava as alterações de expressão, o câncer de bexiga foi induzido pela BBN em ratos Wistar por 24 semanas. As hidrólises de ATP e ADP são maiores nas bexigas dos animais controle do que no urotélio tumoral dos animais concordando com a expressão da NTPDase3. Por fim, no intuito de verificar o envolvimento dessas duas enzimas na malignidade do câncer de bexiga, a NTPDase3 foi superexpressa na linhagem T24, por transfecção com pcDNA3, e a ecto-5’-NT/CD73 foi silenciada utilizando o sistema CRISPR/Cas. Os clones de cada tranfecção foram caracterizados mostrando o sucesso de ambas transformações genéticas. As transfecções não alteraram significativamente as respostas purinérgicas testadas e os experimentos de implante tumoral in vivo mostram que a ecto-5’-NT/CD73 está provavelmente envolvida na malignidade dessa neoplasia. / The bladder cancer is the second most prevalent tumor of genitourinary tract. It is more common among men and it is mainly associated with smoking. The current treatments are not efficient enough to avoid the cases of tumor recurrence, progression and pacient death. So, the researches follow the pursuit of more effective treatments. Many studies have shown the involvement of purinergic system in the bladder tumorigenesis, in relation to the ectonucleotidases, there is evidence of the engagement of two of them, the NTPDase3 and the ecto05’-Nucleotidase/CD73. The health urothelium expresses NTPDase3, which is also expressed in a bladder cancer cell line of grade 1 (RT4) but it is not expressed in bladder cancer cell line of grade 3 (T24). While ecto-5’-NT/CD73 does not is expressed in the health urothelium of mice and presents a low activity in a bladder cancer cell line of grade 1 front of a high activity in a bladder cancer cell line of grade 3, highlighting the possible role of these proteins in the bladder cancer progression. In this way, the aim of this thesis was to investigate the involvement of NTPDase3 and ecto-5'-NT/CD73 in bladder cancer progression and malignancy. To investigate the enzymes expression during the progress of bladder cancer establishment, Balb-c mice received 0,05% of N-butyl-N-(hydroxybutyl)-nitrosamine (BBN) in its drinking water during 4, 8, 12, 18 and 24 weeks. Until the first 8 weeks just inflammation was observed in mice bladder, at 12 week beginning the neoplastic alterations that culminated in cancer after 24 weeks of induction. The NTPDase3 expression was decreased in this process while ecto-5’-NT/CD73 showed up and was significantly enhanced in cancerous urothelium. To verify if the enzyme activities were in agreement with their expression changes, bladder cancer was induced in Wistar rats with BBN for 24 weeks. The ATP and ADP hydrolysis was higher in the urothelium of control animals than in the cancerous urothelium, in accordance with NTPDase3 expression. Finally, in order to verify the involvement of these two enzymes in bladder cancer malignancy, NTPDase3 was overexpressed in T24 bladder cancer cell line, through transfection with pcDNA3, and ecto-5’-NT/CD73 was silenced with CRISPR/Cas system. The clones of each transfection were featured showing the success of both cell genetic transformations. The transfections did not significantly change the tested purinergic answers and the experiments of in vivo tumor implant shows that ecto-5’-NT/CD73 is probably involved in bladder cancer malignancy.

Devido a dificuldades técnicas de modelagem experimental e de aferição de dor, até os anos 70, acreditava-se que recém-nascidos e lactentes jovens não teriam maturidade neurológica para conduzir, de forma adequada, os estímulos dolorosos; portanto, não sentiam dor. Recentes estudos, focados na área de neurobiologia do desenvolvimento, têm demonstrado como as informações sensoriais são processadas no início da vida e que dor intensa ou persistente no prematuro ou neonato pode provocar alterações de comportamento e percepção da dor que podem persistir no decorrer da vida. Considerando a relevância do tema, este trabalho teve como objetivo avaliar possíveis alterações comportamentais e bioquímicas, a partir de uma intervenção farmacológica com anestésicos gerais, acompanhados ou não de procedimento cirúrgico realizado no 14°dia de vida do animal. Foram utilizadas 40 ninhadas padronizadas com 8 ratos Wistar machos. O modelo cirúrgico utilizado foi descrito por Levine, modificado por Rice et al. (1981), porém sem a oclusão da carótida. Para as avaliações comportamentais foram utilizados os testes de campo aberto, labirinto em cruz elevado, tail-flick e formalina. O parâmetro bioquímico avaliado foi atividade das enzimas E-NTPDases e ecto-5’nucleotidase. Este trabalho foi dividido em dois desenhos experimentais. No primeiro, os animais foram divididos em 3 grupos: controle (O2), anestesia (isoflurano), anestesia/cirurgia (isoflurano/cirurgia); no segundo, os animais foram divididos em 3 grupos: controle (salina), anestesia (cetamina S+/fentanil), anestesia/cirurgia (cetamina S+/fentanil/cirurgia). Os animais que receberam isoflurano apresentaram aumento na atividade locomotora em P14 e P30 e maior analgesia no tail-flick em P14 e P60, associados a uma diminuição da hidrólise de ATP, ADP e AMP em P14. É importante salientar que o procedimento cirúrgico reverteu a diminuição na hidrólise do ATP e do ADP. Os animais que receberam cetamina S+/fentanil (CF) apresentaram diminuição do nível de ansiedade (P30 e P60) e maior analgesia no tail-flick (P30), associadas a aumento da hidrólise de ATP e AMP, o procedimento cirúrgico reverteu o efeito observado no ATP. Esses resultados indicam que manipulações farmacológicas com anestésicos gerais, como as utilizadas nesta dissertação, em um período de maturação do sistema nervoso central, promovem alterações que podem ser percebidas ao longo da vida do animal. Os anestésicos são capazes de interagir com uma variedade de sistemas neuronais, incluindo sistemas GABAérgico, glicinérgico, colinérgico e glutamatérgico, e alterações em número e/ou afinidade de receptores destes sistemas podem estar contribuindo com os resultados obtidos nesta dissertação. No entanto, as técnicas utilizadas neste estudo não nos permitem determinar os mecanismos de neurotransmissão suscetíveis à exposição a anestésicos gerais, associado ou não ao procedimento cirúrgico, em animais com 14 dias, e envolvidos nas alterações observadas nas respostas comportamentais e bioquímicas em curto, médio e longo prazos. Novos estudos são necessários para melhor elucidar os resultados obtidos. / Due to technical difficulties of modeling and experimental measurement of pain, until the 70th decade, it was thought that newborns and young infants would not have neurological maturity to drive properly painful stimuli, so they felt no pain. Recent studies focused on the area of developmental neurobiology have shown how sensory information is processed at the beginning of life and severe or persistent pain in premature or newborn may cause changes in behavior and perception of pain that can persist throughout life. Considering the relevance of the theme of this work, it was evaluated possible behavioral and biochemical changes from a pharmacological intervention with general anesthetics, associated or not with surgical procedure performed on the 14th day of life of the animal. Fourty litters were used with standard 8 male Wistar rats. The surgical model used was described by Levine, modified by Rice et al. (1981), but without carotid occlusion. For behavioral assessments the open-field, elevated plus-maze, tail-flick and formalin were performed. The biochemical parameters evaluated was the enzymatic activity of E-NTPDases and ecto-5'nucleotidase. This work was divided into two experimental designs: the first, the animals were divided into 3 groups: control (O2), anesthesia (isoflurane), anesthesia / surgery (isoflurane / surgery); in the second, the animals were divided into 3 groups: control (saline), anesthesia (ketamine S+/fentanyl), anesthesia / surgery (ketamine S+/fentanyl / surgery). The animals that received isoflurane showed an increase in locomotor activity in P14 and P30 and greater analgesia in tail-flick in P14 and P60, associated with decreased hydrolysis of ATP, ADP and AMP in P14. It is important to note that the surgery reversed the decrease in the hydrolysis of ATP and ADP. The animals that received ketamine S+/fentanyl had decreased levels of anxiety (P30 and P60) and greater analgesia in tail-flick (P30) associated with increased ATP hydrolysis and AMP, the surgery reversed the effect observed in the ATP. These results indicate that pharmacological manipulation with general anesthetics, such as those used in this work, in a period of maturation of the central nervous system, can promote changes which could be seen throughout the animal's life. Anesthetics are able to interact with a variety of neuronal systems, including systems GABAergic, glycinergic, glutamatergic and cholinergic, and changes in the level of receptors of these systems in numbers and / or affinity may be contributing to the results obtained in this dissertation. However, the techniques used in this study did not allow us to determine the mechanisms of neurotransmission susceptible to exposure to general anesthetics in association or not surgery in animals with 14 days and involved in the observed changes in behavioral and biochemical alterations in short, medium and long term. Further studies are needed to further elucidate the results.

Glioblastoma multiforme é a forma mais comum e agressiva de tumor cerebral que apresenta um severo crescimento e um comportamento altamente invasivo. Linhagens de células de glioma em cultura apresentam alta atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase que metaboliza AMP em adenosina. Em adição, ela também interage com componentes da matriz extracelular como molécula adesiva. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito de diferentes componentes da matriz extracelular sobre a atividade da ecto-5’-nucleotidase, proliferação, adesão e migração celular na linhagem de células de glioma humano U138-MG. Os resultados obtidos mostraram uma inibição da atividade enzimática da ecto-5’- nucleotidase quando tratada com laminina sozinha e com fibronectina ou laminina em co-tratamento com dextran sulfato. O dextran sulfato mostrou reduzir a proliferação em 37%. O mesmo efeito foi observado para os co-tratamentos entre dextran/laminina (29%) e dextran/colágeno (28%). A presença de adenosina diminuiu a adesão celular em torno de 40% e o APCP aumentou a adesão em 75%. Laminina inibiu a adesão celular, já a condroitina sulfato aumentou em 70%. As células U138 apresentaram uma redução da adesão e migração celular quando tratadas apenas com dextran e também no co-tratamento deste com adenosina e APCP. Diante dos resultados podemos sugerir a modulação da atividade da ecto5’-nucleotidase e assim uma modulação da produção de adenosina por moléculas da matriz extracelular, afetando assim eventos celulares envolvidos no comportamento invasivo destas células tumorais. / Glioblastoma multiforme is the most aggressive form of brain tumor that shows a severe growth and highly invasiveness behavior. Glioma cell lines in culture present a high activity of the ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT/CD73) which metabolizes AMP to adenosine. In addition, ecto-5’-NT/CD73 also has contact with extracellular matrix components like adhesive molecule. In the present paper, we evaluate the effect of distinct extracellular matrix components on the ecto-5’- NT/CD73 activity, proliferation, adhesion and migration in U138-MG human glioma cell line. The results showed an inhibition of enzymatic activity of ecto-5’NT/CD73 in the presence of laminin, fibronectin plus dextran sulfate and laminin plus dextran sulfate. In the proliferation assay it was observed that dextran sulfate reduced the proliferation in 37% and in association with collagen type I or laminin, the proliferation was reduced too (28% and 29%, respectively). The presence of adenosina decreased of adhesion at about 40% and when treated with APCP increased in 75%. Laminin inhibited the cell adhesion and chondroitin sulfate increased in 70%. U138 cells presented reduction of adhesion and cell migration in the presence of dextran sulfate alone and in the presence of adenosine and APCP. Taken together these results suggest the modulation of ecto-5’-NT/CD73 activity and production of adenosin by extracellular matrix molecules, affecting cell events involved in the invasiveness behavior this tumor cells.

O câncer de bexiga é a segunda neoplasia urogenital mais comum, atinge mais os homens e está relacionado principalmente com o fumo. Os tratamentos atualmente utilizados não são suficientemente efetivos, permitindo os diversos casos de recorrência, progressão do tumor e/ou morte do paciente. Assim, as pesquisas realizadas continuam buscando tratamentos mais efetivos. Diversos estudos revelam o envolvimento do sistema purinérgico na tumorigênese da bexiga, no âmbito das ectonucleotidases, há evidências de alterações em duas delas na progressão do câncer de bexiga: a NTPDase3 e a ecto-5’-NT/CD73. O urotélio normal dos camundongos expressa a NTPDase3 que é expressa em linhagem de câncer de bexiga de grau 1 (RT4), mas não em linhagem de grau 3 (T24). Já a ecto-5’-NT/CD73, não é expressa no urotélio normal de camundongos e tem baixa atividade em linhagem de câncer de bexiga de grau 1 (RT4) em comparação a linhagem de grau 3 (T24), evidenciando a possível participação destas proteínas na progressão do câncer de bexiga. Dessa forma, o objetivo desta tese foi investigar o envolvimento da NTPDase3 e da ecto-5'-NT/CD73 na progressão e malignidade do câncer de bexiga. A fim de caracterizar a expressão dessas enzimas durante a progressão do estabelecimento do câncer de bexiga, camundongos Balb-c receberam N-butil-N-(hidroxibutil)-nitrosamina (BBN) 0,05% em sua água de beber por 4, 8, 12, 18 e 24 semanas. Nas primeiras 8 semanas as bexigas dos animais apresentaram características de inflamação, em 12 semanas iniciaram as transformações neoplásicas que em 24 semanas caracterizaram câncer. NTPDase3 teve sua expressão diminuída nesse processo, enquanto a ecto-5’-NT/CD73 passou a ser expressa e sua expressão foi significativamente maior no utrotélio cancerígeno. A fim de verificar se a atividade das enzimas acompanhava as alterações de expressão, o câncer de bexiga foi induzido pela BBN em ratos Wistar por 24 semanas. As hidrólises de ATP e ADP são maiores nas bexigas dos animais controle do que no urotélio tumoral dos animais concordando com a expressão da NTPDase3. Por fim, no intuito de verificar o envolvimento dessas duas enzimas na malignidade do câncer de bexiga, a NTPDase3 foi superexpressa na linhagem T24, por transfecção com pcDNA3, e a ecto-5’-NT/CD73 foi silenciada utilizando o sistema CRISPR/Cas. Os clones de cada tranfecção foram caracterizados mostrando o sucesso de ambas transformações genéticas. As transfecções não alteraram significativamente as respostas purinérgicas testadas e os experimentos de implante tumoral in vivo mostram que a ecto-5’-NT/CD73 está provavelmente envolvida na malignidade dessa neoplasia. / The bladder cancer is the second most prevalent tumor of genitourinary tract. It is more common among men and it is mainly associated with smoking. The current treatments are not efficient enough to avoid the cases of tumor recurrence, progression and pacient death. So, the researches follow the pursuit of more effective treatments. Many studies have shown the involvement of purinergic system in the bladder tumorigenesis, in relation to the ectonucleotidases, there is evidence of the engagement of two of them, the NTPDase3 and the ecto05’-Nucleotidase/CD73. The health urothelium expresses NTPDase3, which is also expressed in a bladder cancer cell line of grade 1 (RT4) but it is not expressed in bladder cancer cell line of grade 3 (T24). While ecto-5’-NT/CD73 does not is expressed in the health urothelium of mice and presents a low activity in a bladder cancer cell line of grade 1 front of a high activity in a bladder cancer cell line of grade 3, highlighting the possible role of these proteins in the bladder cancer progression. In this way, the aim of this thesis was to investigate the involvement of NTPDase3 and ecto-5'-NT/CD73 in bladder cancer progression and malignancy. To investigate the enzymes expression during the progress of bladder cancer establishment, Balb-c mice received 0,05% of N-butyl-N-(hydroxybutyl)-nitrosamine (BBN) in its drinking water during 4, 8, 12, 18 and 24 weeks. Until the first 8 weeks just inflammation was observed in mice bladder, at 12 week beginning the neoplastic alterations that culminated in cancer after 24 weeks of induction. The NTPDase3 expression was decreased in this process while ecto-5’-NT/CD73 showed up and was significantly enhanced in cancerous urothelium. To verify if the enzyme activities were in agreement with their expression changes, bladder cancer was induced in Wistar rats with BBN for 24 weeks. The ATP and ADP hydrolysis was higher in the urothelium of control animals than in the cancerous urothelium, in accordance with NTPDase3 expression. Finally, in order to verify the involvement of these two enzymes in bladder cancer malignancy, NTPDase3 was overexpressed in T24 bladder cancer cell line, through transfection with pcDNA3, and ecto-5’-NT/CD73 was silenced with CRISPR/Cas system. The clones of each transfection were featured showing the success of both cell genetic transformations. The transfections did not significantly change the tested purinergic answers and the experiments of in vivo tumor implant shows that ecto-5’-NT/CD73 is probably involved in bladder cancer malignancy.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.

Glioblastoma multiforme é a forma mais comum e agressiva de tumor cerebral que apresenta um severo crescimento e um comportamento altamente invasivo. Linhagens de células de glioma em cultura apresentam alta atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase que metaboliza AMP em adenosina. Em adição, ela também interage com componentes da matriz extracelular como molécula adesiva. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito de diferentes componentes da matriz extracelular sobre a atividade da ecto-5’-nucleotidase, proliferação, adesão e migração celular na linhagem de células de glioma humano U138-MG. Os resultados obtidos mostraram uma inibição da atividade enzimática da ecto-5’- nucleotidase quando tratada com laminina sozinha e com fibronectina ou laminina em co-tratamento com dextran sulfato. O dextran sulfato mostrou reduzir a proliferação em 37%. O mesmo efeito foi observado para os co-tratamentos entre dextran/laminina (29%) e dextran/colágeno (28%). A presença de adenosina diminuiu a adesão celular em torno de 40% e o APCP aumentou a adesão em 75%. Laminina inibiu a adesão celular, já a condroitina sulfato aumentou em 70%. As células U138 apresentaram uma redução da adesão e migração celular quando tratadas apenas com dextran e também no co-tratamento deste com adenosina e APCP. Diante dos resultados podemos sugerir a modulação da atividade da ecto5’-nucleotidase e assim uma modulação da produção de adenosina por moléculas da matriz extracelular, afetando assim eventos celulares envolvidos no comportamento invasivo destas células tumorais. / Glioblastoma multiforme is the most aggressive form of brain tumor that shows a severe growth and highly invasiveness behavior. Glioma cell lines in culture present a high activity of the ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT/CD73) which metabolizes AMP to adenosine. In addition, ecto-5’-NT/CD73 also has contact with extracellular matrix components like adhesive molecule. In the present paper, we evaluate the effect of distinct extracellular matrix components on the ecto-5’- NT/CD73 activity, proliferation, adhesion and migration in U138-MG human glioma cell line. The results showed an inhibition of enzymatic activity of ecto-5’NT/CD73 in the presence of laminin, fibronectin plus dextran sulfate and laminin plus dextran sulfate. In the proliferation assay it was observed that dextran sulfate reduced the proliferation in 37% and in association with collagen type I or laminin, the proliferation was reduced too (28% and 29%, respectively). The presence of adenosina decreased of adhesion at about 40% and when treated with APCP increased in 75%. Laminin inhibited the cell adhesion and chondroitin sulfate increased in 70%. U138 cells presented reduction of adhesion and cell migration in the presence of dextran sulfate alone and in the presence of adenosine and APCP. Taken together these results suggest the modulation of ecto-5’-NT/CD73 activity and production of adenosin by extracellular matrix molecules, affecting cell events involved in the invasiveness behavior this tumor cells.