This thesis focuses on humoral immune response of specific hosts to antigens of various developmental stages of bird schistosomes T. regenti and T. szidati, and follows up on previous research of antibody response in non-specific hosts (mouse, human). Sera of experimentally infected and hunted-down wild ducks were examined using the ELISA and western blot methods. The sera samples were taken in predefined intervals. Results of the ELISA analysis show the process of humoral immune response after infection by bird schistosomes. The level of specific antibodies IgY against homogenate of T. regenti cercariae increased significantly 20 d.p.i. in ducks infected by T. regenti. Such reaction wasn't observed in ducks infected by T. szidati. Slight changes in level of specific antibodies IgM against T. szidati cercariae homogenate were observed 10 d.p.i. only in fully immunocompetent ducks and in reinfected ducks. Examination of hunted-down wild ducks didn't prove infection by bird schisosomes; this conclusion was confirmed by results of the ELISA analysis. IgY antibodies from ducks infected by T. regenti demonstrated strong reactions with 2 antigens in ranges 49-47 kDa and 47-45 kDa. Other reactions, which were recognized, have not been observed in all specimen. An Western blott with homogenate from 7 days...

This thesis is focused on immunochemical determination of concentration of active and inactive form of cathepsin B in patients with bladder cancer in order to compare diagnostic efficiency of methods for their possible use for routine diagnosis. Cathepsin B and procathepsin B were measured in serum and urine in 82 patients with bladder cancer (47 men and 35 women), with the average age of 66.5 year. The control group contain of 72 healthy subjects (31 men and 41 women), with the average age of 58.5 year. The concentration of cathepsin B and procathepsin B in the urine were corrected to creatinine, which was determined by the enzymatic creatinase method. The concentrations of cathepsin B in urine were singnificantly elevated in patients than in control group (median = 3.5 µg/l vs. 0.9 µg/l, P = 0.01), similarly the results of the cathepsin B/creatinine ratio were elevated (median = 0.4 µg/mmol vs. 0.1 µg/mmol, P = 0.01). There were no significant difference in concentration in serum between patients and control group (median = 4.8 µg/l vs. 4.2 µg/l, P = 0.8). The concentration values of procathepsin B were significantly higher in patients compare to control group both in urine (median = 3.9 µg/l vs. 1.4 µg/l, P < 0.0001), in serum (median = 73.3 µg/l vs. 58.7 µg/l, P = 0.0005) and similarly in...

Background In the as of yet uncurable Parkinson´s disease aggregation of α-syn is an accelerator of pathogenesis. Oligomers of α-synuclein is considered to be neurotoxic hence blocking the endocytosis of aggregated α-syn is possibly a way of preventing pathogenesis. With a protein construct of the Receptor X (RX) previously shown to bind α-syn, it can be possible to bind soluble aggregated α-syn and decrease neuron endocytosis.  Aim The aim of this study was to express, purify and trimerize two different protein constructs of RX to study the binding to α-syn monomers &amp; oligomers and if the proteins have higher affinity to α-syn oligomers. Methods In this study two RX constructs was produced with mammalian cell transfection and purified with Strep-Tactin affinity chromatography; D1, D123mut and D123 which affinity to α-syn monomers and oligomers were studied with ELISAs. Indirect ELISAs were optimized and conducted, a competitive ELISA with D123 was tested with poor reliability.  Results The results show that D1 could not be determined pure enough to examine its α-syn binding ability. D123mut was pure enough for ELISAs but did not show adequate binding to α-syn. D123 did show binding to α-syn in an indirect ELISA.  Conclusion The results were not as promising as expected and did not distinctly help strengthen the theory of a recombinant RX protein as a viable drug. Although there is potential, optimization of both protein constructs and methods used is essential for future studies of RX as a therapeutic protein.

Das Dengue-Virus ist ein, in tropischen und subtropischen Regionen endemisches, humanpathogenes Virus, welches durch Moskitos des Genus Aedes übertragen wird. Jährlich werden ca. 95 Millionen der Infektionen klinisch manifestiert, wobei 1 % davon in der schwersten Form des Dengue-hämorrhagischen Fiebers verlaufen. Eine schnelle und einfache Diagnostik spielt dabei für die Behandlung sowie für epidemiologische Studien eine wichtige Rolle. Die serologische Diagnostik flaviviraler Infektionen im Allgemeinen und DENV im Speziellen, ist durch die Vielzahl kreuzreaktiver und infektionsverstärkender Antikörper hoch komplex. Die starke Co-Zirkulation verschiedener Flaviviren und deren ähnliche klinische Symptomatik erschwert zusätzlich die spezifische Diagnostik. Seit 2015 führte insbesondere der massive Vormarsch von ZIKV‑Infektionen in DENV-endemischen Gebieten Südamerikas zu einer noch komplexeren Sachlage, da die serologische Unterscheidung beider Infektionen kaum möglich war. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden daher rekombinante virale E-Proteine exprimiert und charakterisiert, welche die Spezifität serologischer DENV- und ZIKV‑Tests erhöhen sollen. E-Proteine sind stark immunogen, da sie die Virusoberfläche dominieren. Jedoch ist deren hochkonservierte DII-FL Region gleichzeitig das Ziel von einem Großteil kreuzreaktiver Antikörper. Studien mit WNV und JEV haben zuvor belegt, dass Mutationen in diesem Sequenzbereich, die Kreuzreaktivität mit heterologen Flaviviren herabsenken können. Deshalb wurden vier Punktmutationen in die DII-FL Region von DENV 1-4 und ZIKV E (Equad) eingefügt und in einem Insektentenzellen- basierten System exprimiert, aus dem Kulturüberstand aufgereinigt und mit Humanseren in IgM- und IgG-ELISAs untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden in zwei Publikationen dargelegt, welche die Grundlage für diese Promotionsschrift darstellen.

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After kidney transplantation the recipient's immune system responds to the donor's antigens and the graft rejection occurs. Borderline changes are a frequent diagnosis after kidney transplantation, representing only mild rejection signs. Some patients with borderline changes undergo progression to rejection. The identification of these at- risk patients by biomarkers will allow enhanced treatment and help to prevent the development of rejection. The aim of my work was to verify biomarkers of rejection in patients with borderline changes. Chemokines CXCL9, CXCL10 and CCL17 in urine/serum of 40 patients with subclinical borderline changes at 3 months and in 25 patients with early borderline changes were determined by ELISA. At 3 months, the higher CXCL10 level predicted rejection with AUC=0.749, p=0.024. High levels of CXL10 had also been found in patients with BKV infection. We did not confirm the relationship between rejection and the CXCL9 and CCL17. In the early posttransplant period the levels of CXCL10 and CXCL9 were elevated in all patients and therefore couldn't be used to predict rejection. The alloreactivity was examined using IFN-γ ELISPOT (n=38). No association between the frequency of IFN-γ producing cells after stimulation with donor cells or CMV peptides and the development of...

Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia are opportunistic human pathogens. Hazards pose to immunocompromited patient groups, most of whom are patients suffering from cystic fibrosis, for which is the infection caused by Pseudomonas aeruginosa or Burkholderia cepacia, often lethal. Bacteria exhibit resistance to most antibiotics and the immunization of patients, paradoxically, worsens the patients' condition. Hen antibodies, unlike mammalian do not activate the complement cascade and do not cause the inflammatory response, therefore, seem to be a suitable tool to protect high risk populations as a means of passive immunization. In this work were prepared specific chicken antibodies against significant virulent factor - bacterial lectins PAIIL and BClA responsible for adhesion. Antibody specificity was demonstrated by ELISA and Western blot. Antibodies were affinity purified and cleaved to fragments. Pneumocytes type II from the lungs of patients with Cystic Fibrosis were isolated and cultured. Tests of the adhesion of bacteria cells were performed on them using ELISA. As an alternative model rat pneumocytes and tumor cell line A549 has been used. Prepared antibodies specifically detect bacterial lectins on the surface of bacteria. Antibody has been shown to reduce adhesion of bacteria to...

To determine the origin of non-vagal afferent fibers innervating the heart of guinea pigs, capsaicin was injected into the ventricular myocardium to induce depletion of substance P (SP). The lower cervical, upper thoracic and lumbar spinal ganglia, as well as the left atrium and base of ventricles, were assayed for SP depletion by using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunohistochemical procedures. Capsaicin affected spinal ganglia from the 3 regions differently. The substance P level in lumbar spinal ganglia remained fairly constant, while the level of SP from cervical and thoracic regions declined significantly. At the maximal depletion dosage (173 μg of capsaicin/kg), SP concentration decreased 72.3% in cervical spinal ganglia, 45.5% in thoracic ganglia and 56.1% in the atrium. The lack of SP depletion in lumbar ganglia indicates that capsaicin acted locally on cardiac afferents rather than systemically. Data from this study suggest that capsaicin-sensitive neurons of the heart have cell bodies in the lower cervical spinal ganglia as well as in the upper thoracic spinal ganglia.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob humane Antikörper gegen ZIKV-Kapsid und ZIKV-Kapsid selbst geeignete Biomarker für den Nachweis einer ZIKV-Infektion sind. Sie kann damit als erste Phase einer Studie zur Entwicklung neuer ZIKV-Diagnostika angesehen werden. Der Aufbau, das klinische Erscheinungsbild, die Epidemiologie und der Nachweis von ZIKV, bzw. einer ZIKV-Infektion, wurden erörtert. Die Möglichkeiten und Limitationen aktueller ZIKV-Diagnostika wurden beschrieben, insbesondere hinsichtlich der Spezifität. Durch Analyse des Genoms von ZIKV und anderen Flaviviren wurde gezeigt, dass die Aminoäuresequenzidentität zwischen den einzelnen Flaviviren für flavivirales Kapsid geringer ist als für andere Bestandteile und potenzielle Antigene von Flaviviren. Relevant ist insbesondere die Abgrenzung zu DENV, da eine akute oder abgelaufene DENV-Infektion eine häufige Ursache von Kreuzreaktivität beim Nachweis einer ZIKV-Infektion darstellt. Mittels webserverbasierten In-silico-Analysen konnten immunogene Regionen innerhalb des ZIKV-Kapsid-Proteins kartiert und mit den immunogenen Regionen, welche für ZIKV-Kapsid anderer Flaviviren In-silico oder experimentell ermittelt wurden, verglichen werden. Auf Basis dieser Analysen war die Erwartung, dass bei einer ZIKV-Infektion humane Antikörper gegen ZIKV-Kapsid gebildet werden, welche sich in ihren Paratopen von Antikörpern, die gegen Kapsid-Proteine anderer Flaviviren gebildet werden, unterscheiden. Der Umfang der humanen Antikörperantwort auf ZIKV-Kapsid wurde in dieser Arbeit anschließend untersucht. Dazu wurde das Antigen ZIKV-Kapsid eines ZIKV-Stamms aus der afrikanischen Linie (hier: Stamm MR766) rekombinant hergestellt. Rekombinantes ZIKV-Kapsid eines Stammes der asiatischen Linie (hier: Stamm Z1106033) wurde erworben. In 11 humanen Seren und einem Pool-Serum (WHO-Referenzserum) wurde versucht Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper mittels ELISAs und Western Blots nachzuweisen. Es fanden sich keine bis schwache Hinweise auf das Vorhandensein von Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörpern in diesen Seren. Im direkten Vergleich mit 10 Seren von ZIKV-negativen Blutspendern zeigten sich für die Seren des ZIKV-Serumpanels keine höheren ELISA-Extinktionswerte. Dies galt sowohl für den Einsatz von ZIKV-Kapsid des Stammes der afrikanischen Linie als auch beim Einsatz von ZIKV-Kapsid des Stammes der asiatischen Linie. Im Sinn der Ermittlung der Paralleltestreliabilität fand sich für Anti-ZIKV-Kapsid-IgG in einer Regressionsanalyse ein schwacher linearer Zusammenhang zu Messwerten eines gut validierten Referenztests, dem ZIKV-NS1-ELISA der Firma Euroimmun. Dies ist ein schwacher Hinweis auf die postinfektiöse Bildung von humanen Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörpern. Obwohl der lineare Zusammenhang signifikant war, ist die Aussagekraft dieses Ergebnisses eingeschränkt. Es fanden sich Hinweise auf unspezifische, im Rahmen dieser Arbeit nicht vollständig identifizierte, Einflüsse auf die Testergebnisse der eigenen Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper-ELISAs. Es ist vorstellbar, dass der gefundene lineare Zusammenhang zum Referenztest teilweise durch diese unspezifischen Einflüsse, im Sinn von Kovariablen, verursacht wird. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper-ELISAs zeigten Hinweise für falsch-positive Messergebnisse bei der Testung von fünf DENV-positiven Seren. Mit Hilfe von Western Blots, welche verglichen mit ELISAs als spezifischer gelten, konnten in Seren des ZIKV-Serumpanels keine ZIKV-Kapsid-spezifischen Antikörper nachgewiesen werden. Auch Antikörper aus Seren von ZIKV-negativen Blutspendern und IgG-Antikörper aus gereinigten IgG-Antikörper-Lösungen verursachten positive und somit unspezifische Testergebnisse (Banden). Eine mögliche Erklärung dafür liegt in der hohen Hydrophobizität von ZIKV-Kapsid, was für die Anlagerung nichtspezifischer humaner Antikörper sorgen könnte. Es ist möglich diese Arbeit in zwei Teile zu unterteilen, wobei sich der erste Teil vor allem dem Nachweis von humanen Antikörpern gegen ZIKV-Kapsid widmet und der Nachweis von ZIKV-Kapsid in Serum von Infizierten den zweiten Teil darstellt. Für den Nachweis des Antigens wurden polyklonale und monoklonale Antikörper eingesetzt. Durch Immunisierung von Mäusen mit ZIKV-Kapsid und anschließendem Einsatz der Hybridomtechnik konnten durch Dr. Sven Reiche (Friedrich-Löffler-Institut) und Prof. Christian Jassoy vier monoklonale Antikörper gegen ZIKV-Kapsid gewonnen werden. Diese Antikörper wurden in dieser Arbeit weiter charakterisiert. Sie zeigten sich als geeignet und spezifisch beim Nachweis von ZIKV-infizierten Vero-Zellen durch Immunfluoreszenzfärbungen. Durch Kompetitionstests hatte sich zuvor bereits gezeigt, dass alle Antikörper an dasselbe, oder mindestens nahe beieinander liegende Epitope binden. Da sie sich somit bei Einsatz in einem Sandwich-ELISA zum Nachweis von ZIKV-Kapsid als Antigen verdrängen würden, wurden zwei polyklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper erworben. Ein Sandwich-ELISA, der polyklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper als Fängerantikörper und monoklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper als Detektionsantikörper nutzt, konnte erfolgreich zum Nachweis von ZIKV-Kapsid in verschiedenen Lösungen, u. a. nativem ZIKV-Kapsid in Zellkulturüberstand, eingesetzt werden. Der so aufgebaute Antigen-ELISA erreichte, abhängig von der Kombination an Antikörper und Antigen, eine untere Nachweisgrenze zwischen 2 bis 345 ng/ml. Um zum Nachweis von ZIKV-Kapsid in humanem Serum eines ZIKV-infizierten Patienten eingesetzt werden zu können, müsste seine Sensitivität um etwa zwei bis drei Logstufen steigen. Möglichkeiten dazu wurden diskutiert.:1 Inhaltsverzeichnis 2 2 Abkürzungsverzeichnis 7 3 Einführung 10 4 Aufgabenstellung 47 5 Materialien und Methoden 49 6 Ergebnisse 97 7 Diskussion 131 8 Zusammenfassung 156 9 Literaturverzeichnis 158 10 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 182 11 Anlagen 187

β-Glucans are structural components of fungal cell walls which are involved in the immune recognition of fungal pathogens and possess beneficial immunomodulatory activities in isolated form. Here we have developed a soluble chimeric form of the major mammalian β-glucan receptor, Dectin-1, and demonstrate its application for the detection and characterisation of soluble and insoluble β-glucans, including fungal particles, using ELISA, flow cytometric and fluorescence-based microscopy assays.