A total of 1076 sera from breeding goats were randomly collected from 24 different farms and tested with CHEKIT®-ELISA (Dr. Bommeli AG-IDEXX, Switzerland) for antibodies against Chlamydophila abortus. The farms were divided into two categories of 12 farms each, depending on their level of observed abortions over the previous 12 months: those with insignificant (<5 %) levels of abortions and those with significant (≥5 %) levels of abortions. The farmers were also interviewed on their level of awareness about chlamydophilosis and whether or not they were doing regular preventive vaccination against the disease. The study determined the seroprevalence levels of 25% at farm level and 8 % at individual animal level (at 95% confidence level). A total of 6 out of 24 farms had at least one positive breeding animal. Only 5 out of the 24 (20.8%) farmers interviewed were aware of chlamydophilosis and its zoonotic dangers. None of the 24 farmers interviewed practised any vaccination against chlamydophilosis. There was a significantly higher number of seropositive animals from farms with significant levels of abortions compared to those animals from farms with insignificant levels of abortions (P=0.0000). The study underscored the need for more farmer awareness and training on chlamydophilosis and its zoonotic dangers. / Dissertation (MSc (Veterinary Science))--University of Pretoria, 2007. / Veterinary Tropical Diseases / MSc / unrestricted

SARS-CoV-2-Antikörpertests sind deswegen von Bedeutung, weil damit insbesondere die Ausbreitung des Virus exakt nachverfolgt und politische Maßnahmen und Einschränkungen angepasst werden können. Zum Antikörpernachweis werden hauptsächlich das Spike und das Nukleo-Protein als Fängerprotein verwendet. Ausgangspunkt für die vorliegenden Studie war die Beobachtung, dass Covid-positive Seren, die in S-Protein basierten Antikörpertests stark reagiert hatten, teilweise im N-Protein-Tests gar nicht reagierten und umgekehrt. Daraufhin stellte sich die Frage, wie sich die Kombination der Nukleo- und Spike-Proteine in einem Kombinations-Test, im Vergleich zu einem Test mit dem Nukleo-Protein und dem Spike-Protein allein, auf die Sensitivität und Spezifität auswirkt. So entstand die Idee, die beiden Proteine in einem gemeinsamen Test zu kombinieren, um einerseits die Sensitivität zu verbessern, ohne aber gleichzeitig eine Verschlechterung der Spezifität in Kauf nehmen zu müssen. Um diese Arbeitshypothese optimal untersuchen zu können, wurde ein eigener S-Protein-ELISA und ein Kombinatios-ELISA, der das Spike und das Nukleo-Protein als Fängerprotein benutzt, etabliert und mit dem bereits von Frau Schnurra etablierten N-Protein-ELISA verglichen. Untersucht wurde die Hypothese mithilfe der drei ELISA-Antikörpertests, in denen 123 Covidseren von 2020 und 180 Blutbankseren und Plasmen von vor 2019 miteinander verglichen wurden. Der N-Protein-ELISA, der S-Protein-ELISA und der Kombinations-ELISA folgten dabei einem fast identischen Protokoll. Somit wurde garantiert, dass ausschließlich die Auswirkung der Proteine und Proteinkombinationen verglichen wurden und Sensitivitäten und Spezifitäten nicht wegen verschiedener Testqualitäten oder verwendeter Substanzen schwankten. Um den optimalen Vergleich der ELISA ermöglichen zu können, wurde die Spezifität der drei Tests mithilfe der ROC-Analyse auf 98,33 % angeglichen. Im Vergleich der Sensitivitäten der drei Tests ist zu sehen, dass die Sensitivität tatsächlich gesteigert werden kann, wenn das S- und das N-Protein miteinander kombiniert werden. Der N-Protein-ELISA hat mit 82,9 % (CI: 75,1% - 89,1%) die geringste Sensitivität, gefolgt von dem S-Protein-ELISA mit 93,5 % (CI: 87,6% - 97,2%). Die höchste Sensitivität hat der ELISA, der die beiden Proteine kombiniert mit 95,9 % (CI 90,8% - 98,7%). Werden die AUC‘s der drei Tests berechnet, die die Genauigkeit eines Tests angeben, wie zum Beispiel die Unterscheidung der diagnostischen Gruppe in krank und gesund, schneidet auch hier der Kombinationstest mit 0,986 (CI: 0,965 – 0,996) am besten ab. Auf dem zweiten Platz landet der S-Protein-ELISA mit 0,985 (CI: 0,964- 0,995) und auf dem dritten Platz der N-Protein-ELISA mit 0,96 (CI: 0,931 – 0,979). Wird die Spezifität der drei Tests bei einem Cut-off von 1 miteinander verglichen, ist deutlich, dass sich die Spezifität durch die Kombination der beiden Proteine verschlechtert. Von 180 Seren und Plasmen, die vor 2019 abgenommen wurden, wird im N-Protein-ELISA ein Serum als falsch positiv erkannt, im S-Protein-ELISA ein Serum und ein Plasma. Im Kombinations-ELISA werden jeweils die beiden zuvor genannten Seren und das Plasma als falsch positiv erkannt. Eine zusätzliche Überprüfung ist hierbei erforderlich, indem noch mehr Covid-negative Seren untersucht werden. Zur praktischen Nutzung der Ergebnisse kommen folgende Möglichkeiten in Frage: Wird ein besonders sensitiver Test benötigt, wie es zum Beispiel der Fall ist, wenn eine große Bevölkerung auf ihre Durchseuchung untersuchen werden soll, könnte ein ELISA benutzt werden, der beide Proteine kombiniert. Anschließend müssten die positiven Seren in einem hoch spezifischen Test, wie zum Beispiel dem Siemens-Test, nachgetestet werden. Das hätte den Vorteil, dass mit einem relativ günstigen ELISA die größte Anzahl an Seren aussortiert werden könnte. Daraufhin müsste dann nur noch eine kleine Gruppe an Seren mit dem teureren Antikörpertest, in diesem Falle dem Siemens-Test, nachgetestet werden. Wird primär ein besonders spezifischer ELISA benötigt, könnte das N-Protein wieder allein verwendet werden.  :Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS III 1 EINFÜHRUNG 1 1.1 Besonderheiten des SARS-Coronavirus-2 1 1.1.1 Aufbau des SARS-CoV-2 3 1.1.2 Antikörperantwort auf SARS-CoV-2 5 1.2 SARS-CoV-2 Diagnostik 7 1.2.1 SARS-CoV-2 Akutdiagnostik/ Direkter Erregernachweis 8 1.2.2 SARS-CoV-2-Antikörpertests/ Indirekter Erregernachweis 9 1.2.2.1 Die Bedeutung von SARS-CoV-2 Antikörpertests 10 1.3 Aufgabenstellung 11 2 MATERIAL UND METHODEN 12 2.1 Materialien 12 2.1.1 Blutproben 12 2.1.2 Herstellung des RBD-Bestandteils des S1-Proteins 12 2.2 Methoden 13 2.2.1 Allgemeines ELISA-Protokoll 13 2.2.2 Datenanalyse 14 3 ERGEBNISSE 15 3.1 Entwicklung des ELISA-Protokolls 15 3.1.1 Antigenbeschichtungslösung 15 3.1.2 Antigenbeschichtungskonzentration 16 3.1.3 Vergleich verschiedener Entwicklungszeiten 19 3.1.4 Versuch der Reduktion falsch positiver Ergebnisse 24 3.1.5 Herstellung des Calibrators 29 3.1.6 Herstellung des Standardserums 32 3.1.7 Finales Elisa Protokoll 36 3.2 Stabilisierung des ELISAs 36 3.2.1 Stabilisierung der Beschichtung 36 3.2.2 Stabilisierung von Positiv-/ Negativkontrolle und Calibrator 39 3.3 Vergleich der Sensitivitäten und Spezifitäten der verschiedenen ELISA 39 3.3.1 Sensitivitäten der Antikörpertests bei einem Cut-off von 1 40 3.3.1.1 Aufschlüsselung der Testergebnisse der Sensitivität 42 3.3.2 Spezifitäten der Antikörpertests 43 3.3.2.1 Aufschlüsselung der Testergebnisse der Spezifität 44 3.3.3 Angleichung der Spezifität zum Vergleich der drei ELISA 45 3.3.3.1 Angleichung der Spezifität auf 99,4% 45 3.3.3.2 Angleichung der Spezifität auf 98,3 % 47 3.4 Vergleich der Flächen unter den ROC-Kurven 50 4 DISKUSSION 51 5 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 58 6 LITERATURVERZEICHNIS 61 7 ANHANG 68 8 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT 69 9 LEBENSLAUF 70 10 PUBLIKATIONEN 71 11 DANKSAGUNG 72

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第19770号 / 農博第2166号 / 新制||農||1040(附属図書館) / 学位論文||H28||N4986(農学部図書室) / 32806 / 京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻 / (主査)教授 河田 照雄, 教授 保川 清, 教授 橋本 渉 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM

Verschiedene ELISA zur Erkennung von Stx1 und Stx2 in Rinderkotproben wurden auf ihrer Anwendbarkeit hin verglichen. Der ELISA nach RICHTER et al. (1997) unter Anwendung von Hydatidenflüssigkeiten von Echinococcus granulosus als Beschichtungssubstanz und monoklonalen Antikörper als Bindungsmolekül stellte sich als die praktikabelste Lösung im Vergleich mit dem ELISA mit monoklonalen Antikörpern (RANDALL et al., 1997) und einem ELISA mit kommerziellem Gb3 heraus. Der ELISA nach RICHTER et al. (1997) wurde gegen den klassischen Vero-Zell- Neutralisationstest validiert. Zu diesem Zweck wurden 100 E. coli-Feldisolate mit beiden Tests ausgewertet. Die zur Quantifizierung von Ergebnissen angewendete Coulter-Methode (Ermittlung der Überlebensraten der Vero-Zellen mit Hilfe des Z2-Partikelzählers) erwies sich als geeignet, während zwei Färbungsmethoden (KV- und MTT-Färbungsmethode) aufgrund von Einstellungsproblemen bei der spektralfotometrischen Messungen nicht zu auswertbaren Ergebnissen geführt hatten. Die Ergebnisse des ELISA und des Vero-Zell-Neutralisationstest wurden in einer „Two- Graphic Receiver-Operating Characteristic“ (TG-ROC)-Analyse verglichen. Die Indexwerte 0,020 und 0,040 wurden als „cut-off“ für den Stx1- bzw. Stx2-ELISA anhand dieser Analyse 79 festgelegt. Die geschätze Sensitivität und Spezifität für den Stx1-ELISA betrugen 100% (pu = 100%; po = 100%), für den Stx2-ELISA betrug die Sensitivität 100% (pu = 100%; po = 100%) und die Spezifität 94% (pu = 88,4%; po = 99,7%). Nach diesen Ergebnissen ist der ELISA ein geeigneter Test und kann den Vero-Zell-Neutralisationstest ersetzen. Der validierte ELISA wurde in einem Feldversuch parallel mit der MK1/MK2-PCR (KARCH und MEYER, 1989) eingesetzt. In einem Zeitraum vom 15.01.97 bis 31.12.99 wurden 1030 Rinderkotproben mit beiden Tests auf das Vorkommen von STEC untersucht. Die PCR wies stx-Gene bei 500 (49%) der Proben nach. Der ELISA wies nur 307 (30%) Stx-positive nach. Bei 264 positiven und 487 negativen Ergebnissen stimmten die Resultate zu 751 Proben (73%) überein. Der berechnete Kappa-Wert war 0,452. Der Kappa-Wert spricht für eine mäßige Übereinstimmung beider Tests. Diesen Ergebnissen nach sollte die PCR als „pre-screening“-Test favorisiert werden, obwohl eine Kombination beider Tests zum Stx-Nachweis am besten geeignet wäre.

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Solid-state nanopores are a versatile class single-molecule sensors to electrically characterize a range of biological molecules. Nanopores operate on the simple premise that when a voltage is applied across a pore immersed in a salt solution, the passage of a biomolecule results in a transient blockage in the ionic current that provide information about the translocating molecule. This thesis presents studies employing various DNA nanostructures with solid-state nanopore electrical readout for the development of high sensitivity digital single-molecule assays to detect low-abundance biomarkers. Toward this ultimate goal, work presented in this thesis use nanopores to probe DNA nanostructures, their assembly, mechanical properties, and monitor their dynamics with time and temperature. DNA nanostructures are self-assembled via specific base pairing of DNA, their programmability make them particularly useful for applications including drug delivery, molecular computation and biosensing. Here, I first show results of translocation profiles and discuss folding characteristics, mobility, and molecular configuration during passage for different DNA nanostructures such as the short star-shaped DNA nanostructures and large helix-bundle DNA origami structures under various experimental conditions in an effort to understand the passage characteristics through nanopores of these structures before using them in biological assays. I conclude by presenting a magnetic bead-based immunoassay scheme using a digital solid-state nanopore readout. Nanopore has the ability to count molecules one at a time, this allows accurate and precise determination of the concentration of a biomarker in solution. Coupled with the use of specific choice of DNA nanostructures, as proxy labels for proteins of interest, I establish that nanopores sensors can reliably quantify the concentration of a protein biomarker from complex biofluids and overcome the traditional challenges associated with nanopore-based protein sensing, such as specificity, sensitivity, and consistency. I demonstrate the quantification of thyroid stimulating hormone (TSH) with a high degree of precision down to the femtomolar range by using a nanoparticle-based signal amplification strategy. The proposed assay scheme is generalizable to a framework for the detection and quantification of a wide range of target proteins, and given that its performance can further be improved with the use of parallelization, preconcentration, or miniaturization, it opens up exciting opportunities for the development of ultra-sensitive digital assay in a format that is compatible for point-of-care.

Einleitung: Toxoplasma gondii stellt einen der weltweit häufigsten, ubiquitär vorkommenden, alimentär übertragbaren Krankheitserreger dar. Der Verzehr von nicht ausreichend erhitztem Fleisch und Fleischerzeugnissen, welche infektiöse Stadien des Protozoen enthalten, erwies sich als eine der bedeutendsten Infektionsquellen für den Menschen. Waschbären (Procyon lotor) gelten in Deutschland als invasive Art. Aufgrund der steigenden Jagdstrecke in den letzten Jahrzehnten wird neben der Pelzproduktion auch die Verwendung des Fleisches als Wildbret zunehmend attraktiv. Gegenwärtig gibt es nur wenige Daten zur Erregerlast von T. gondii in für den humanen Konsum relevanten Gewebeteilen bei Waschbären, ferner zur Durchseuchungsrate der Waschbären in Deutschland und assoziierten Risikofaktoren. Ziele der Studie: In dieser Arbeit sollten die Seroprävalenz von T. gondii bei Waschbären in Deutschland sowie damit assoziierte Risikofaktoren ermittelt werden. Die für den menschlichen Verzehr relevanten Fleischteile sollten ergänzend dazu direkt molekularbiologisch untersucht werden, um qualitative und quantitative Ergebnisse zum Vorkommen von T.-gondii-Stadien in ebendiesem Gewebe zu erhalten. Schlussendlich sollten diese Daten als Beitrag zur Risikoabschätzung einer Toxoplasma-gondii-Infektion des Menschen durch den Verzehr des Fleisches von wildlebenden Waschbären aus Deutschland zur Verfügung gestellt werden. Material und Methoden: Im Rahmen dieser Studie wurden Proben von 820 wildlebenden Waschbären, die von Dezember 2017 bis April 2021 erlegt wurden, untersucht. Das Erlegungsdatum, die Herkunftspostleitzahl, Alter, Geschlecht und Gewicht der Tiere wurden jeweils erfasst. Von den Tieren wurden Kopf, Zwerchfell, Vorder- und Hintergliedmaße entnommen, um Fleischsaft durch Auftauen zu generieren. Mittels kommerziellen ELISAs (Enzyme‐Linked Immunosorbent Assay) wurden T.-gondii-spezifische Antikörper im Fleischsaft nachgewiesen und Risikofaktoren, basierend auf den zugrundeliegenden tierassoziierten Daten, ermittelt. Auf Grundlage der serologischen Ergebnisse wurde das Fleisch der Gliedmaßen von 50 negativen, 50 niedrigpositiven und 50 hochpositiven Proben mittels magnetic-capture Polymerase Chain Reaction (PCR) quantitativ untersucht. Zur Untersuchung der Prävalenz-Unterschiede für die einzelnen Risikofaktoren, wurden Chi-Quadrat-Tests durchgeführt. Für das Gewicht wurde eine einfache logistische Regression angewandt. Ergebnisse: Bei 48,5 % (398/820; 95 % Konfidenzintervall KI: 45,1-52,0) der untersuchten Waschbären wurden T.-gondii-spezifische Antikörper nachgewiesen. Weitere 48,5 % der Proben waren negativ und 2,9 % (47/820; 95 % KI: 2,0-4,3) fraglich. Statistisch signifikante Unterschiede wurden für die Faktoren Geschlecht (p = 0,028), Saison (p < 0,0003) und Gewicht (odds ratio: 1,783; 95 % KI: 1,513-2,108; p < 0,0001) festgestellt. Rüden waren häufiger seropositiv als Fähen, im Spätwinter/Frühling erlegte Tiere waren häufiger seropositiv als im Herbst erlegte Tiere und je schwerer die Tiere waren, umso höher war die Chance eines positiven Antikörper-Nachweises. Bei 56 der untersuchten 150 Waschbärenfleischproben wurde T.-gondii-DNA (Deoxyribonucleic Acid) nachgewiesen. Davon gehörten 18 Tiere der serologisch niedrigpositiven Gruppe und 38 Tiere der serologisch hochpositiven Gruppe an. In den Proben der seronegativen Tiere wurde keine T.-gondii-DNA detektiert. In der serologisch hochpositiven Gruppe gab es statistisch signifikant mehr positive Proben (p < 0,0001) und es wurden statistisch signifikant höhere Werte der DNA-Äquivalente (p < 0,0001) pro 100 g Waschbärenfleisch nachgewiesen als bei den serologisch Niedrigpositiven. Schlussfolgerung: Waschbären in Deutschland sind stark mit T. gondii befallen. Bei Handling und Verzehr von Waschbärenfleisch besteht daher grundsätzlich ein potenzielles humanes Gesundheitsrisiko. Das Fleisch sollte vor dem Verzehr ausreichend durcherhitzt werden. Jedoch sind weitere Studien im Rahmen von Bioassay oder Zellkulturen nötig, um eine bessere Aussage über die Infektiosität treffen zu können.:Inhalt Seite 1 Einleitung ............................................................................................................. 1 2 Literaturübersicht ................................................................................................. 3 2.1 Lebenszyklus und Parasitenstadien von Toxoplasma gondii ............................. 3 2.2 Toxoplasmose beim Menschen .......................................................................... 7 2.2.1 Klinische Manifestation ................................................................................... 7 2.2.2 Risikofaktoren ................................................................................................ 8 2.2.3 Seroprävalenz .............................................................................................. 10 2.3 Toxoplasmose beim Tier .................................................................................. 12 2.3.1 Klinische Manifestation ................................................................................. 12 2.3.2 Prävalenz in verschiedenen Tierarten .......................................................... 12 2.3.3 Toxoplasmose bei Waschbären .................................................................... 14 2.4 T. gondii in Lebensmitteln ................................................................................ 16 2.4.1 Vorkommen in Lebensmitteln ....................................................................... 16 2.4.2 Prävention und Inaktivierung von T. gondii ................................................... 17 2.5 Diagnostik ....................................................................................................... 20 2.5.1 Serodiagnostik ............................................................................................. 21 2.5.2 Molekulardiagnostik ..................................................................................... 22 3 Publikationen ..................................................................................................... 25 3.1 Publikation 1 ................................................................................................... 25 3.2 Publikation 2 ................................................................................................... 35 4 Diskussion .......................................................................................................... 43 5 Zusammenfassung.............................................................................................. 50 6 Summary ............................................................................................................ 52 7 Literaturverzeichnis ............................................................................................ 54 8 Danksagung ....................................................................................................... 68

Giardia is a parasite that causes disease in both humans and animals all around the world. Approximately 200 million people are infected each year. The parasite is spread mainly through contact with contaminated feces but can also be spread through food and water contaminated with infectious cysts. Symptoms that may occur during infection could be diarrhea and abdominal pain. Not all host organisms get symptoms and there are lots of asymptomatic carriers. The aim of this report was to compare and evaluate the performance of three different methods used to detect Giardia in dogs and cats. Today the gold standard is detecting cysts with immunofluorescence, which was one of the methods evaluated. One cyst visible was enough to say the test was positive. The other two methods were an ELISA and a rapid test, and both detected soluble Giardia antigen. For both methods, color development occurred in case of positive results. The ELISA wells were read spectrophotometrically at 450 nm. During this project, 294 tests from randomly chosen dogs and cats were analyzed. Of all these tests, 103 were analyzed with all three methods, whereas 191 tests were only analyzed with immunofluorescence and ELISA. When analyzing the results, the number of positive test results was very similar between the three methods and there was no statistically significant difference between them. Therefore, when price, time and results were taken into consideration, the method recommended was ELISA.

<p>Development of serological assays for the diagnosis of Baylisascaris larva migrans in birds and non-human primates</p>

Cytokiner eller interleukiner är signalpeptider med låg molekylär vikt somreglerar många viktiga funktioner. De kan delas in i två grupper beroende på deraseffekt på celler. Interleukin 4 (IL-4) till exempel kan tillhöra gruppentillväxtfaktorer medan interleukin 6 (IL-6) kan tillhöra gruppen aktiverings- ellerdifferentieringsfaktorer. IgM-receptorn eller B-cellsreceptorn, BCR, finns på Bcelleroch är membranbundna immunoglobuliner (mIg) som har tvåhuvuduppgifter; att förmedla signaler som styr B-cellens utveckling samt att bindain antigen som sedan ska presenteras för T-celler. I studien aktiverades B-cellermed antikropp mot IgM (anti-IgM) samt rekombinant IL-4. Efter stimuleringanalyserades IL-6 produktionen med enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Syftet med studien var att karakterisera uttrycket av IL-4 receptorn pålymfom- och leukemiceller med flödescytometri och polymeras chain reaction(PCR) samt produktion av IL-6 med ELISA. ELISA-analysen visade att tvåcellinjer, stimulerade Sp53 och stimulerade samt kontroller av WaC3CD5+, gaven ökning av IL-6 produktionen. Vid jämförelse med ELISA-resultaten ochflödescytometri-analyserna ser man att WaC3CD5+ som producerat storamängder IL-6, har en liten andel IL-4 receptorer på cellytan. Resultatet av PCRanalysenvisar att det var framförallt Sp53 som fick höga mängder IL-4R mRNA,men även I83, U2932 och WaC3CD5+ fick positiva resultat. Resultaten i dennastudie är preliminära och för att få mer säkerställda resultat krävs att alla analysergörs om ett antal gånger för att få ett mer tillförlitligt resultat. / Cytokines or interleukins are signal peptides of low molecular weight, whichregulates many important functions. They can roughly be divided into two groupsor divisions due to their effect on cells. Interleukin 4 (IL-4), for example, belongsto the group growth factors while interleukin-6 (IL-6) belongs to the groupactivation or differentiation factors. IgM receptors or B cell receptors, BCR, areexpressed on B cells and are membrane-bound immunoglobulins (mIg) and havetwo main functions: to convey signals that control B cell activation and to bindantigen which will then be presented to T cells. In the study B cells were activatedwith antibodies against IgM (anti-IgM) and recombinant IL-4. After stimulationthe IL-6 production was analysed by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). The purpose of this study was to characterize the expression of IL-4receptor in lymphoma and leukemia cells by flow cytometry and polymerasechain reaction (PCR) and furthermore the production of IL-6 by ELISA. ELISAanalysis showed that two cell lines, stimulated Sp53 and stimulated and control ofWaC3CD5+, resulted in an increased IL-6 production. When comparing ELISAresults and flow cytometry assays, it can be seen that WaC3CD5+, whichproduced large amounts of IL-6, has a small percentage of IL-4 receptors on thecell surface. The results of the PCR analysis shows that particularly Sp53displayed high amounts of IL-4 mRNA, but also I83, U2932 and WaC3CD5+were positive for IL-4 mRNA. The results of this study are preliminary, and to getmore trustworthy results, all analyses have to be repeated to get more reliableresults.