Alternative splicing is a process that partly rejects the common definition of a gene – that one gene codes for one specific protein. By variable combination of coding regions (exons) and exclusion of non-coding regions (introns), formation of several different mRNA-transcripts, and consequently several different proteins, can derive from the same gene. Alternative splicing is an important condition for the development of complex life forms, but it is also a highly sensitive process and inaccurate splicing is the cause of approximately 15 % of mutations that cause genetic diseases. This article presents four genes, BRCA1, BRCA2, ERα and ERβ, and inaccurate splicing of these genes increases the risk of developing cancer, particularly breast cancer and ovarian cancer. Breast cancer is the second most common form of lethal cancer among women. After identifying the cancerogenic mutations, women of high-risk families can undergo genetic testing and preventive therapy can reduce the morbidity and mortality. The article also presents a short discussion around the ethical problems of genetic testing, and the social and psychological dilemmas women of high-risk families are facing when they are given the option to undergo genetic testing.

Hintergrund: Die Gustafsson sche Yin-Yang-Theorie sagt dem stimulierten Östrogenrezeptors β hemmende oder modulierende Funktionen nach. Diese Studie untersuchte die Wirkungen der Kombination aus dem selektiven Östrogenrezeptoragonisten α (16α-LE2) und β (8β-VE2) sowie der Kombination aus Östradiol und dem ERβ-Agonist an 3 Monate alten ovarektomierten Sprague-Dawley-Ratten. Die subkutane Verabreichung erfolgte für insgesamt vier Wochen in kontinuierlich simultaner und zeitversetzt zweiwöchiger, simultaner Kombination. Eine Östradiolgruppe diente als Positivkontrolle. Als physiologischer Vergleichsparameter galt eine intakte sham-ovx Gruppe. Anhand von histologischen Schnitten und Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurden der Uterus und die Vagina auf proliferative Effekte und histomorphologisch untersucht. Zusätzlich wurden das Uterusgewicht, die Futteraufnahme, das Körpergewicht und mittels RIA der Hormonhaushalt (Östradiol, LH, TSH, fT3 und fT4) beurteilt. Die kontinuierlich verabreichten Kombinationen aus E2 bzw. dem ERα-Agonisten und dem ERβ-Agonisten präsentierten in keinem der genannten Organ- bzw. Hormonsysteme nennenswerte Unterschiede zur Wirkung von Östradiol. Die kontinuierliche Verabreichung zeigte keine bedeutenden Unterschiede zur zeitversetzten Kombination. Verglichen mit der sham-ovx Referenzgruppe präsentierten sich die Futteraufnahme, das Körpergewicht und das Hormonsystem (außer Östradiol) im physiologischen Bereich. Der Serumöstradiolwert, die uterine Schichtdicke des Myometriums und Epithels sowie die vaginale Epitheldicke wiesen supraphysiologische Werte auf. Die gewonnenen Resultate widersprechen somit der Gustafsson schen Yin-Yang-Theorie , nach welcher es durch die Stimulation des Östrogenrezeptors β zu einer hemmenden oder modulierenden Antwort der östrogenen Wirkung von Östradiol und dem selektiven ERα-Agonisten kommen sollte.

Submitted by Bianca Ribeiro De Souza null (mione_bi@msn.com) on 2017-09-18T05:28:24Z No. of bitstreams: 1 Dissertação (Final).pdf: 4000625 bytes, checksum: 7fde4629bfd1677d4c0087a9ad24c0ba (MD5) / Approved for entry into archive by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com) on 2017-09-19T19:10:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 souza_br_me_assis.pdf: 4000625 bytes, checksum: 7fde4629bfd1677d4c0087a9ad24c0ba (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T19:10:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 souza_br_me_assis.pdf: 4000625 bytes, checksum: 7fde4629bfd1677d4c0087a9ad24c0ba (MD5) Previous issue date: 2017-08-04 / Os esteroides anabólicos androgênicos são prescritos para o tratamento de várias doenças, porém apresentam efeitos colaterais mesmo em dosagens terapêuticas. Entre eles, destaca-se o decanoato de nandrolona (DN), o qual age sobre receptores de andrógenos (AR) e estrógenos (ERα e ERβ). Paralelamente, a melatonina (MLT) tem despertado a atenção na área da saúde devido às suas propriedades antioxidantes e profiláticas, com o intuito de reduzir ou suprimir os efeitos colaterais promovidos por fármacos. Então, o presente estudo teve por objetivo avaliar o ciclo estral, a estrutura histológica e a imunomarcação para AR, ERα e ERβ em ovários de ratas androgenizadas submetidas ao tratamento com MLT. Ratas Wistar (n = 8/grupo) receberam óleo mineral (Controle), DN (7,5 mg/kg; via subcutânea, 15 dias) e o tratamento com MLT (10 mg/kg; via intraperitoneal, 7 dias) isoladamente, previamente ou concomitantemente ao esteroide. O ciclo estral foi monitorado. Os ovários foram coletados e preparados para a avaliação do tecido. Nas ratas androgenizadas, a MLT recuperou o peso e o tecido ovariano, mas não restabeleceu o ciclo estral. O número e área dos corpos lúteos dos animais que receberam MLT, previamente ou concomitantemente ao DN, foram similares ao controle, e apenas o tratamento prévio restabeleceu a quantidade de folículos saudáveis e atrésicos. Nos folículos, a MLT promoveu uma fraca expressão do ERα e ERβ, e nos corpos lúteos inibiu a diminuição na expressão de ERβ induzido pelo DN. O tratamento prévio com MLT atenuou o aumento na expressão do AR promovido pelo DN em folículos atrésicos e corpos lúteos. Em conclusão, a MLT apresentou efeito benéfico nos ovários androgenizados através da recuperação da foliculogênese e da luteogênese. O tratamento prévio com melatonina foi mais eficaz em relação ao tratamento concomitante. / Androgenic anabolic steroids are prescribed as treatment to several diseases, however, they present side effects even in therapeutic dosages. Among them, we highlight the nandrolone decanoate (ND) which acts on androgen receptors (AR) and estrogen receptors (ERα e ERβ). At the same time, melatonin (MLT) has raised attention in health area due to its antioxidant and prophylactic properties intending reduction or surpassing side effects caused by medicine. Thus, the present study aimed assess the estrous cycle, histological structure and AR, ERα and ERβ immunolocalization in androgenized rats ovaries undergone treatment with MLT. Wistar rats (n= 8/group) received mineral oil (Control), ND (7,5 mg/kg; subcutaneously, 15 days) and treatment with MLT (10 mg/kg; intraperitoneally, 7 days) singly, previously or concomitantly to steroid. Estrous cycle was monitored. The ovaries were collected and prepared for tissue assessment. In androgenized rats, MLT recovered weight and ovarian tissue, but it did not reestablish the estrous cycle. The number and area of corpus luteum of animals which received MLT, previously or concomitantly to ND, were similar to control, and only previous treatment reestablished the quantity of healthy and atretic follicles. In follicles, MLT promoted a weak expression of the ERα and ERβ, and in corpora lutea, it inhibited the decrease in the ERβ expression induced by ND. Previous treatment with MLT mitigated the increase in AR expression promoted by ND in atretic follicles and corporea lutea. In conclusion, melatonin presented a beneficial effect on the androgenized ovaries through the recovery of the folliculogenesis and luteogenesis. The previous treatment was the most effective.

Les estrogènes jouent un rôle primordial dans le développement et le fonctionnement des tissus reproducteurs par leurs interactions avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. Ces récepteurs nucléaires agissent comme facteurs de transcription et contrôlent l’expression des gènes de façon hormono-dépendante et indépendante grâce à leurs deux domaines d’activation (AF-1 et AF-2). Une dérégulation de leur activité transcriptionnelle est souvent à l’origine de pathologies telles que le cancer du sein, de l’endomètre et des ovaires. Alors que ERα est utilisé comme facteur pronostic pour l’utilisation d’agents thérapeutiques, l’importance de la valeur clinique de ERβ est encore controversée. Toutefois, des évidences récentes lui associent un pouvoir anti-tumorigénique en démontrant que sa présence favorise l’inhibition de la progression de ces cancers ainsi que l’efficacité des traitements. En combinaisons avec d’autres études, ces observations démontrent que bien que les deux isoformes partagent une certaine similitude d’action, les ERs sont en mesure d’exercer des fonctions distinctes. Ces différences sont fortement attribuables au faible degré d’homologie observé entre certains domaines structuraux des ERs, comme le domaine AF-1, ce qui fait en sorte que les différents sites de modifications post-traductionnelles (MPTs) présents sur les ERs sont très peu conservés entre les isoformes. Or, l’activité transcriptionnelle ligand-dépendante et indépendante des ERs est hautement régulée par les MPTs. Elles sont impliquées à tous les niveaux de l’activation des ERs incluant la liaison et la sensibilité au ligand, la localisation cellulaire, la dimérisation, l’interaction avec l’ADN, le recrutement de corégulateurs transcriptionnels, la stabilité et l’arrêt de la transcription. Ainsi, de par leur dissimilitude, les ERs seront différemment régulés par la signalisation cellulaire. Comme un débalancement de plusieurs voies de signalisation ont été associées à la progression de tumeurs ER-positives ainsi qu’au développement d’une résistance, une meilleure compréhension de l’impact des MPTs sur la régulation spécifique des ERs s’avère essentielle en vue de proposer et/ou développer des traitements adéquats pour les cancers gynécologiques. Les résultats présentés dans cette thèse ont pour objectif de mieux comprendre les rôles des MPTs sur l’activité transcriptionnelle de ERβ qui sont, contrairement à ERα, très peu connus. Nous démontrons une régulation dynamique de ERβ par la phosphorylation, l’ubiquitination et la sumoylation. De plus, toutes les MPTs nouvellement découvertes par mes recherches se situent dans l’AF-1 de ERβ et permettent de mieux comprendre le rôle capital joué par ce domaine dans la régulation de l’activité ligand-dépendante et indépendante du récepteur. Dans la première étude, nous observons qu’en réponse aux MAPK, l’AF-1 de ERβ est phosphorylé au niveau de sérines spécifiques et qu’elles jouent un rôle important dans la régulation de l’activité ligand-indépendante de ERβ par la voie ubiquitine-protéasome. En effet, la phosphorylation de ces sérines régule le cycle d’activation-dégradation de ERβ en modulant son ubiquitination, sa mobilité nucléaire et sa stabilité en favorisant le recrutement de l’ubiquitine ligase E6-AP. De plus, ce mécanisme d’action semble être derrière la régulation différentielle de l’activité de ERα et ERβ observée lors de l’inhibition du protéasome. Dans le second papier, nous démontrons que l’activité et la stabilité de ERβ en présence d’estrogène sont étroitement régulées par la sumoylation phosphorylation-dépendante de l’AF-1, processus hautement favorisé par l’action de la kinase GSK-3. La sumoylation de ERβ par SUMO-1 prévient la dégradation du récepteur en entrant en compétition avec l’ubiquitination au niveau du même site accepteur. De plus, contrairement à ERα, SUMO-1 réprime l’activité de ERβ en altérant son interaction avec l’ADN et l’expression de ses gènes cibles dans les cellules de cancers du sein. Également, ces recherches ont permis d’identifier un motif de sumoylation dépendant de la phosphorylation (pSuM) jusqu’à lors inconnu de la communauté scientifique, offrant ainsi un outil supplémentaire à la prédiction de nouveau substrat de la sumoylation. En plus de permettre une meilleure compréhension du rôle des signaux intracellulaires dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de ERβ, nos résultats soulignent l’importance des MPTs dans l’induction des différences fonctionnelles observées entre ERα et ERβ et apportent des pistes supplémentaires à la compréhension de leurs rôles physiopathologiques respectifs. / Estrogens play a pivotal role in reproductive physiology through direct interaction with the estrogen receptors ERα and ERβ, which belong to the nuclear hormone receptor family of ligand-activated transcription factors. Harbouring two activation domains (AF-1 and AF-2), gene expression can be controlled by ERs either in a hormone-dependent and/or independent manner. Disruption of ER transcriptional regulation is associated with pathological events such as breast and endometrial cancers. While ERα is considered a strong predictive factor in endocrine therapy of reproductive cancers, the clinical value of ERβ is still debated, although greater expression of ERβ has been associated with a favourable outcome since recent evidence has associated ERβ with anti-tumorigenic properties and a better response to anti-estrogenic compounds. Along with others studies, those individual outcomes indicate that even though the two receptors can exert similar roles by sharing resemblances in terms of structure and general response to hormone, they can also carry out distinct functions. These variations can be attributed to the fact that most of the structural domains shared by ERs exhibit a low level of homology, especially at the AF-1 domain. Consequently, the majority of the post-translational modifications sites (PTMs) on ERs are not shared between both isoforms. In fact, ligand-induced and ligand-independent activities of ERs are critically influenced by PTMs. PTMs controls the multiple aspects of ER-dependent activation by modulating ERs ligand binding, specificity, cellular localization, dimerization, interaction with their cognate DNA response element, combinatory recruitment of transcriptional coregulators, stability and transcriptional arrest. Hence, by their discrepancies, ERs will be differently influenced by the cellular environment. Furthermore, as the deregulation of different signalling pathway in cancers is associated with ER-dependant tumour progression and in the acquisition of a therapeutic resistant phenotype, it is crucial to understand the how PTMs affect ERs transactivation in order to eventually propose and/or develop adequate treatment. The results presented in this thesis were carried out with the objective of gaining a better understanding of PTM’s roles on ERβ transcriptional control which, as opposed to ERα, remain unclear. We demonstrate here a dynamic regulation of ERβ by phosphorylation, ubiquitination and sumoylation. Furthermore, as all the newly identified PTM are located within de AF-1 domain of ERβ, our results highlight the key role of this domain in the regulation of ligand-dependent and independent transcriptional properties of this receptor. The first study shows that in response to MAPK, specific serine residues in the AF-1 of ERβ are phosphorylated and play an important role in the regulation of ERβ ligand-independent activity by the ubiquitin-proteasome pathway. In fact, the activation-degradation cycle of ERβ induced by MAPK is regulated upon phosphorylation of these serines coordinating ERβ ubiquitination, subnuclear mobility and stability by promoting the recruitment of the ubiquitin ligase E6-AP. Moreover, this molecular process plays part in the differential regulation of ERα and ERβ activity upon proteasome inhibition. In the second paper, we demonstrate that ERβ activity and stability in presence of estrogen is closely regulated by the phosphorylation-dependent sumoylation of the AF-1 domain, amplified by GSK-3 action. SUMO-1 attachment prevents ERβ degradation by competing with ubiquitin at the same acceptor site and dictates ERβ transcriptional inhibition, as opposed to ERα, by altering estrogen-responsive target promoter occupancy and gene expression in breast cancer cells. Furthermore, these findings uncover a novel phosphorylated sumoylation motif (pSuM) and offer a valuable tool to predict novel SUMO substrates under protein kinase regulation. In combination to our better understanding on how intracellular signals controls ERβ transcriptional activity, our results highlight the significant role of PTMs in ERs isoforms discrepancies and allows supplementary comprehension of their respective physiopathologicals roles.

Les estrogènes jouent un rôle primordial dans le développement et le fonctionnement des tissus reproducteurs par leurs interactions avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. Ces récepteurs nucléaires agissent comme facteurs de transcription et contrôlent l’expression des gènes de façon hormono-dépendante et indépendante grâce à leurs deux domaines d’activation (AF-1 et AF-2). Une dérégulation de leur activité transcriptionnelle est souvent à l’origine de pathologies telles que le cancer du sein, de l’endomètre et des ovaires. Alors que ERα est utilisé comme facteur pronostic pour l’utilisation d’agents thérapeutiques, l’importance de la valeur clinique de ERβ est encore controversée. Toutefois, des évidences récentes lui associent un pouvoir anti-tumorigénique en démontrant que sa présence favorise l’inhibition de la progression de ces cancers ainsi que l’efficacité des traitements. En combinaisons avec d’autres études, ces observations démontrent que bien que les deux isoformes partagent une certaine similitude d’action, les ERs sont en mesure d’exercer des fonctions distinctes. Ces différences sont fortement attribuables au faible degré d’homologie observé entre certains domaines structuraux des ERs, comme le domaine AF-1, ce qui fait en sorte que les différents sites de modifications post-traductionnelles (MPTs) présents sur les ERs sont très peu conservés entre les isoformes. Or, l’activité transcriptionnelle ligand-dépendante et indépendante des ERs est hautement régulée par les MPTs. Elles sont impliquées à tous les niveaux de l’activation des ERs incluant la liaison et la sensibilité au ligand, la localisation cellulaire, la dimérisation, l’interaction avec l’ADN, le recrutement de corégulateurs transcriptionnels, la stabilité et l’arrêt de la transcription. Ainsi, de par leur dissimilitude, les ERs seront différemment régulés par la signalisation cellulaire. Comme un débalancement de plusieurs voies de signalisation ont été associées à la progression de tumeurs ER-positives ainsi qu’au développement d’une résistance, une meilleure compréhension de l’impact des MPTs sur la régulation spécifique des ERs s’avère essentielle en vue de proposer et/ou développer des traitements adéquats pour les cancers gynécologiques. Les résultats présentés dans cette thèse ont pour objectif de mieux comprendre les rôles des MPTs sur l’activité transcriptionnelle de ERβ qui sont, contrairement à ERα, très peu connus. Nous démontrons une régulation dynamique de ERβ par la phosphorylation, l’ubiquitination et la sumoylation. De plus, toutes les MPTs nouvellement découvertes par mes recherches se situent dans l’AF-1 de ERβ et permettent de mieux comprendre le rôle capital joué par ce domaine dans la régulation de l’activité ligand-dépendante et indépendante du récepteur. Dans la première étude, nous observons qu’en réponse aux MAPK, l’AF-1 de ERβ est phosphorylé au niveau de sérines spécifiques et qu’elles jouent un rôle important dans la régulation de l’activité ligand-indépendante de ERβ par la voie ubiquitine-protéasome. En effet, la phosphorylation de ces sérines régule le cycle d’activation-dégradation de ERβ en modulant son ubiquitination, sa mobilité nucléaire et sa stabilité en favorisant le recrutement de l’ubiquitine ligase E6-AP. De plus, ce mécanisme d’action semble être derrière la régulation différentielle de l’activité de ERα et ERβ observée lors de l’inhibition du protéasome. Dans le second papier, nous démontrons que l’activité et la stabilité de ERβ en présence d’estrogène sont étroitement régulées par la sumoylation phosphorylation-dépendante de l’AF-1, processus hautement favorisé par l’action de la kinase GSK-3. La sumoylation de ERβ par SUMO-1 prévient la dégradation du récepteur en entrant en compétition avec l’ubiquitination au niveau du même site accepteur. De plus, contrairement à ERα, SUMO-1 réprime l’activité de ERβ en altérant son interaction avec l’ADN et l’expression de ses gènes cibles dans les cellules de cancers du sein. Également, ces recherches ont permis d’identifier un motif de sumoylation dépendant de la phosphorylation (pSuM) jusqu’à lors inconnu de la communauté scientifique, offrant ainsi un outil supplémentaire à la prédiction de nouveau substrat de la sumoylation. En plus de permettre une meilleure compréhension du rôle des signaux intracellulaires dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de ERβ, nos résultats soulignent l’importance des MPTs dans l’induction des différences fonctionnelles observées entre ERα et ERβ et apportent des pistes supplémentaires à la compréhension de leurs rôles physiopathologiques respectifs. / Estrogens play a pivotal role in reproductive physiology through direct interaction with the estrogen receptors ERα and ERβ, which belong to the nuclear hormone receptor family of ligand-activated transcription factors. Harbouring two activation domains (AF-1 and AF-2), gene expression can be controlled by ERs either in a hormone-dependent and/or independent manner. Disruption of ER transcriptional regulation is associated with pathological events such as breast and endometrial cancers. While ERα is considered a strong predictive factor in endocrine therapy of reproductive cancers, the clinical value of ERβ is still debated, although greater expression of ERβ has been associated with a favourable outcome since recent evidence has associated ERβ with anti-tumorigenic properties and a better response to anti-estrogenic compounds. Along with others studies, those individual outcomes indicate that even though the two receptors can exert similar roles by sharing resemblances in terms of structure and general response to hormone, they can also carry out distinct functions. These variations can be attributed to the fact that most of the structural domains shared by ERs exhibit a low level of homology, especially at the AF-1 domain. Consequently, the majority of the post-translational modifications sites (PTMs) on ERs are not shared between both isoforms. In fact, ligand-induced and ligand-independent activities of ERs are critically influenced by PTMs. PTMs controls the multiple aspects of ER-dependent activation by modulating ERs ligand binding, specificity, cellular localization, dimerization, interaction with their cognate DNA response element, combinatory recruitment of transcriptional coregulators, stability and transcriptional arrest. Hence, by their discrepancies, ERs will be differently influenced by the cellular environment. Furthermore, as the deregulation of different signalling pathway in cancers is associated with ER-dependant tumour progression and in the acquisition of a therapeutic resistant phenotype, it is crucial to understand the how PTMs affect ERs transactivation in order to eventually propose and/or develop adequate treatment. The results presented in this thesis were carried out with the objective of gaining a better understanding of PTM’s roles on ERβ transcriptional control which, as opposed to ERα, remain unclear. We demonstrate here a dynamic regulation of ERβ by phosphorylation, ubiquitination and sumoylation. Furthermore, as all the newly identified PTM are located within de AF-1 domain of ERβ, our results highlight the key role of this domain in the regulation of ligand-dependent and independent transcriptional properties of this receptor. The first study shows that in response to MAPK, specific serine residues in the AF-1 of ERβ are phosphorylated and play an important role in the regulation of ERβ ligand-independent activity by the ubiquitin-proteasome pathway. In fact, the activation-degradation cycle of ERβ induced by MAPK is regulated upon phosphorylation of these serines coordinating ERβ ubiquitination, subnuclear mobility and stability by promoting the recruitment of the ubiquitin ligase E6-AP. Moreover, this molecular process plays part in the differential regulation of ERα and ERβ activity upon proteasome inhibition. In the second paper, we demonstrate that ERβ activity and stability in presence of estrogen is closely regulated by the phosphorylation-dependent sumoylation of the AF-1 domain, amplified by GSK-3 action. SUMO-1 attachment prevents ERβ degradation by competing with ubiquitin at the same acceptor site and dictates ERβ transcriptional inhibition, as opposed to ERα, by altering estrogen-responsive target promoter occupancy and gene expression in breast cancer cells. Furthermore, these findings uncover a novel phosphorylated sumoylation motif (pSuM) and offer a valuable tool to predict novel SUMO substrates under protein kinase regulation. In combination to our better understanding on how intracellular signals controls ERβ transcriptional activity, our results highlight the significant role of PTMs in ERs isoforms discrepancies and allows supplementary comprehension of their respective physiopathologicals roles.

La régulation de la transcription des gènes par les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ joue un rôle important dans la croissance cellulaire et dans le développement du cancer du sein. Une augmentation de l’expression de CXCR4 et de son ligand SDF-1/CXCL12 corrèle avec un phénotype plus agressif du cancer du sein. Ici, nous démontrons un mécanisme de boucle de régulation positive entre la signalisation de CXCR4/SDF-1 et l’activité transcriptionnelle des ERs dans des cellules cancéreuses mammaires. L’activité transcriptionnelle de ER et l’expression de gènes cibles de ER, dont SDF-1 lui-même, sont augmentées dans la lignée cancéreuse mammaire MCF-7 en réponse à SDF-1. Ces effets sont bloqués par l’anti-estrogène fulvestrant et par la délétion de CXCR4. Par ailleurs, l’expression des gènes et la prolifération des cellules cancéreuses mammaires MCF-7 en réponse à l’estrogène sont altérées par l’inhibition de CXCR4. La signalisation par les facteurs de croissance joue un rôle important dans le cancer du sein. La surexpression et la dérégulation de la signalisation par le récepteur à activité tyrosine kinase ErbB2 corrèlent avec un phénotype tumoral mammaire plus agressif et un moins bon pronostic. Cependant, comment la signalisation de ErbB2 et de CXCR4 sont fonctionnellement reliées dans la régulation de la réponse de ER dans les cellules cancéreuses mammaires n’est pas connue. Nous démontrons ici que CXCR4 régule négativement l’expression protéique de ErbB2 et de son partenaire d’interaction ErbB3 ainsi que la phosphorylation de ErbB2. CXCR4 altère l’activation de la voie PI3-K/Akt par le dimère ErbB2/ErbB3 en réponse à héréguline alors qu’en présence de SDF-1, les niveaux d’activation sont récupérés. Nous avons trouvé que héréguline-β promouvoit la phosphorylation de la sérine 339 de CXCR4, un site important pour l’internalisation et la signalisation du récepteur. De plus, le recrutement de ErbB2 à CXCR4 est favorisé par ErbB3 et héréguline-β. L’activité transcriptionnelle ainsi que l’expression des gènes cibles de ER en réponse à l’héréguline sont relevées avec l’expression de CXCR4 et partiellement récupérées avec l’addition de SDF-1. Ces résultats démontrent que le recrutement de CXCR4 à ErbB2 altère la signalisation médiée par ErbB2/ErbB3 ainsi que l’activité hormonale de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. Nous travaux ont permis d’identifier et de caractériser l’impact de la signalisation médiée par des récepteurs membranaires sur la réponse transcriptionnelle de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. La signalisation membranaire est un facteur pouvant contribuer à la résistance aux thérapies endocriniennes et donc cibler les récepteurs impliqués s’avèrerait utile pour améliorer les traitements existants et mettre au point de nouvelles approches. / Induction of estrogen-regulated gene transcription by estrogen receptors ERα and ERβ plays an important role in breast cancer development and growth. High expression of the chemokine receptor CXCR4 and its ligand CXCL12/SDF-1 has also been correlated with aggressive breast tumor phenotypes. Here, we describe a positive regulatory loop between CXCR4/SDF-1 signaling pathway and ER transcriptional competence in human breast cancer cells. Treatment of breast carcinoma MCF-7 cells with SDF-1 increased ER transcriptional activity and expression of ER target genes, including SDF-1 itself. These effects were blocked by the antiestrogen ICI-182780 and by CXCR4 silencing, and conversely, estrogen-induced gene expression and growth of MCF-7 cells were impaired upon CXCR4 inhibition. Growth factor signaling also plays an important role in breast cancer. Overexpression and deregulated signaling of receptor tyrosine kinase ErbB2 correlate with aggressive breast tumor phenotype and poor outcomes. However, how ErbB2 and CXCR4 signaling is functionally related to regulate ER response in breast cancer cells is not known. Here we show that steady-state levels of ErbB2 and its dimeric partner ErbB3, as well as ErbB2 tyrosine phosphorylation were negatively regulated with the expression of CXCR4. CXCR4 downregulated ErbB2/ErbB3 dimer activation of the PI3-K/Akt pathway in response to ErbB3 ligand heregulin-β, whereas addition of SDF-1 restored activation levels. We found that heregulin-β promoted CXCR4 phosphorylation at serine 339, an important site for CXCR4 internalization and signaling. In addition, ErbB2 recruitment to CXCR4 was enhanced by ErbB3 and heregulin-β. Transcriptional activity and gene expression measurement showed that the hormonal repression of ER was relieved with the expression of CXCR4 and partially recuperated with the addition of SDF-1. Together, these results show that CXCR4 recruitment to ErbB2 alters ErbB2/ErbB3 signaling pathway and downstream regulation of ER hormonal activity in in breast cancer cells. Our work has enabled us to identify and characterize the impact of membrane receptors signaling on ER transcriptionnal response in breast cancer cells. Membrane signaling is one of the factors involved in endocrine therapy resistance and targeting the receptors implicated could be benificial to improve existing treatments and to work on the creation of new ones.

La régulation de la transcription des gènes par les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ joue un rôle important dans la croissance cellulaire et dans le développement du cancer du sein. Une augmentation de l’expression de CXCR4 et de son ligand SDF-1/CXCL12 corrèle avec un phénotype plus agressif du cancer du sein. Ici, nous démontrons un mécanisme de boucle de régulation positive entre la signalisation de CXCR4/SDF-1 et l’activité transcriptionnelle des ERs dans des cellules cancéreuses mammaires. L’activité transcriptionnelle de ER et l’expression de gènes cibles de ER, dont SDF-1 lui-même, sont augmentées dans la lignée cancéreuse mammaire MCF-7 en réponse à SDF-1. Ces effets sont bloqués par l’anti-estrogène fulvestrant et par la délétion de CXCR4. Par ailleurs, l’expression des gènes et la prolifération des cellules cancéreuses mammaires MCF-7 en réponse à l’estrogène sont altérées par l’inhibition de CXCR4. La signalisation par les facteurs de croissance joue un rôle important dans le cancer du sein. La surexpression et la dérégulation de la signalisation par le récepteur à activité tyrosine kinase ErbB2 corrèlent avec un phénotype tumoral mammaire plus agressif et un moins bon pronostic. Cependant, comment la signalisation de ErbB2 et de CXCR4 sont fonctionnellement reliées dans la régulation de la réponse de ER dans les cellules cancéreuses mammaires n’est pas connue. Nous démontrons ici que CXCR4 régule négativement l’expression protéique de ErbB2 et de son partenaire d’interaction ErbB3 ainsi que la phosphorylation de ErbB2. CXCR4 altère l’activation de la voie PI3-K/Akt par le dimère ErbB2/ErbB3 en réponse à héréguline alors qu’en présence de SDF-1, les niveaux d’activation sont récupérés. Nous avons trouvé que héréguline-β promouvoit la phosphorylation de la sérine 339 de CXCR4, un site important pour l’internalisation et la signalisation du récepteur. De plus, le recrutement de ErbB2 à CXCR4 est favorisé par ErbB3 et héréguline-β. L’activité transcriptionnelle ainsi que l’expression des gènes cibles de ER en réponse à l’héréguline sont relevées avec l’expression de CXCR4 et partiellement récupérées avec l’addition de SDF-1. Ces résultats démontrent que le recrutement de CXCR4 à ErbB2 altère la signalisation médiée par ErbB2/ErbB3 ainsi que l’activité hormonale de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. Nous travaux ont permis d’identifier et de caractériser l’impact de la signalisation médiée par des récepteurs membranaires sur la réponse transcriptionnelle de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. La signalisation membranaire est un facteur pouvant contribuer à la résistance aux thérapies endocriniennes et donc cibler les récepteurs impliqués s’avèrerait utile pour améliorer les traitements existants et mettre au point de nouvelles approches. / Induction of estrogen-regulated gene transcription by estrogen receptors ERα and ERβ plays an important role in breast cancer development and growth. High expression of the chemokine receptor CXCR4 and its ligand CXCL12/SDF-1 has also been correlated with aggressive breast tumor phenotypes. Here, we describe a positive regulatory loop between CXCR4/SDF-1 signaling pathway and ER transcriptional competence in human breast cancer cells. Treatment of breast carcinoma MCF-7 cells with SDF-1 increased ER transcriptional activity and expression of ER target genes, including SDF-1 itself. These effects were blocked by the antiestrogen ICI-182780 and by CXCR4 silencing, and conversely, estrogen-induced gene expression and growth of MCF-7 cells were impaired upon CXCR4 inhibition. Growth factor signaling also plays an important role in breast cancer. Overexpression and deregulated signaling of receptor tyrosine kinase ErbB2 correlate with aggressive breast tumor phenotype and poor outcomes. However, how ErbB2 and CXCR4 signaling is functionally related to regulate ER response in breast cancer cells is not known. Here we show that steady-state levels of ErbB2 and its dimeric partner ErbB3, as well as ErbB2 tyrosine phosphorylation were negatively regulated with the expression of CXCR4. CXCR4 downregulated ErbB2/ErbB3 dimer activation of the PI3-K/Akt pathway in response to ErbB3 ligand heregulin-β, whereas addition of SDF-1 restored activation levels. We found that heregulin-β promoted CXCR4 phosphorylation at serine 339, an important site for CXCR4 internalization and signaling. In addition, ErbB2 recruitment to CXCR4 was enhanced by ErbB3 and heregulin-β. Transcriptional activity and gene expression measurement showed that the hormonal repression of ER was relieved with the expression of CXCR4 and partially recuperated with the addition of SDF-1. Together, these results show that CXCR4 recruitment to ErbB2 alters ErbB2/ErbB3 signaling pathway and downstream regulation of ER hormonal activity in in breast cancer cells. Our work has enabled us to identify and characterize the impact of membrane receptors signaling on ER transcriptionnal response in breast cancer cells. Membrane signaling is one of the factors involved in endocrine therapy resistance and targeting the receptors implicated could be benificial to improve existing treatments and to work on the creation of new ones.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O câncer de mama é a neoplasia que mais acomete mulheres no mundo. Dentre os fatores prognósticos levados em consideração estão os receptores hormonais. O receptor de estrógeno beta (ERβ) é um dos receptores hormonais que pode ser encontrado na mama, mas que até então não é utilizado como um marcador preditivo de prognóstico tumoral por conta da sua ação paradoxal. Células tumorais de mama da linhagem MCF-7 foram utilizadas neste trabalho para averiguar a função dicotômica do ERβ no processo tumoral. De tal forma que foi avaliado alguns dos processos que são observados nas etapas do desenvolvimento do câncer de mama, como proliferação, transição epitélio-mesênquima (EMT) e investigação das células -tronco cancerosas (CSCs) . Para isso, foram utilizados o agonista de ERβ, Diarilpropionitrilo (DPN), o agonista ambíguo (ERα e ERβ) estradiol (E2) e o fator de crescimento transformante beta (TGF-β), indutor de EMT. As células que receberam tratamento com DPN obtiveram maior número de CSCs comparadas às que não foram cultivadas com esse agonista, resultado encontrado pela técnica de citometria de fluxo. As células que tiveram um tratamento prévio com TGF-β demonstraram menor taxa de proliferação e aumento na expressão de p21, uma proteína com ação bloqueadora de ciclina D1, cuja expressão ficou inalterada nos tratamentos com TGF-β e agonista de ERβ. A respeito dos genes relacionados a EMT (SLUG, SNAIL,VIMENTINA, ZEB1,TWIST1,RBFOX2,CICLINAD1 e p21), ERβ inibiu a expressão dos mesmos, sugerindo que esse receptor induza o fenômeno denominado transição mesenquimal epitelial (MET). Nesse cenário, DPN causou a diminuição da expressão de SLUG, SNAIL, TWIST, contrastando com a expressão obtida no tratamento com TGF-β que, além desses genes, também demonstrou aumento na expressão de ZEB1, RBFOX2 e vimentina. O efeito do TGF-β na EMT foi revertido ao associá-lo com DPN. Os dados corroboram com a literatura acerca do possível papel pró tumoral de ERβ no aumento da proliferação celular e da geração das células-tronco cancerígenas de mama (BSCs), além de ir ao encontro do fenótipo relacionado a MET nos tratamentos com DPN sozinho ou associado ao TGF-β. Com esses resultados, torna-se claro no nosso trabalho que dependendo o que é avaliado em relação a ação do ERβ, previamente tratado ou não com TGF-β, o seu efeito dicotômico ainda é observado. / Breast cancer is the most common neoplasm of women in the world. Among the prognostic factors taken into consideration are the hormonal receptors. The estrogen receptor beta (ERβ) is one of the hormone receptors that can be found in the breast, but is not used as a predictive marker of tumor prognosis due to its paradoxical action. Tumor cells of the MCF-7 lineage were used in this work to ascertain the dichotomic function of ERβ in the tumor process. Thus, we evaluated some of the processes that are observed in the stages of breast cancer development, such as proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT) and cancer stem cell research (CSCs). For this, ERβ agonist Diarilpropionitrile (DPN), ambiguous agonist (ERα and ERβ) estradiol (E2) and transforming growth factor beta (TGF-β), inducer of EMT, were used. Cells receiving TGF- β treatment obtained a higher number of CSCs compared to those that were not cultured with this agonist, a result found by the flow cytometry technique. Cells that were pretreated with TGF-β demonstrated a lower rate of proliferation and increased expression of p21, a protein with cyclin D1 blocking action, whose expression was unchanged in TGF-β and ERβ agonist treatments. Regarding the EMT-related genes (SLUG, SNAIL, VIMENTINA, ZEB1, TWIST1, RBFOX2, CYCLINAD1 and p21), ERβ inhibited their expression, suggesting that this receptor induces the phenomenon called epithelial mesenchymal transition (MET). In this scenario, DPN caused a decrease in the expression of SLUG, SNAIL, TWIST, in contrast to TGF-β expression, which, in addition to these genes, also showed increased expression of ZEB1, RBFOX2 and VIMENTIN. The effect of TGF-β on EMT was reversed by associating it with DPN. The data corroborate with the literature about the possible ERβ pro-tumor role in increasing cell proliferation and the generation of breast cancer stem cells (BSCs), in addition to the MET related phenotype in treatments with DPN alone or associated to TGF-β. With these results, it becomes clear in our work that depending on what is evaluated in relation to the action of ERβ, previously treated or not with TGF-β, its dichotomous effect is still observed. / Dissertação (Mestrado)

<p>U ovoj doktorskoj disertaciji&nbsp; razvijen&nbsp; je fluorescentni test u kvascu za identifikaciju potencijalnih prirodnih ili sintetičkih liganada&nbsp; ER&alpha;, ER&beta; ili AR i kvantifikaciju&nbsp; njihovog&nbsp; afiniteta&nbsp; vezivanja sa mogućno&scaron;ću testiranja čitavih biblioteka modifikovanih steroida i ksenoestrogena. Takođe, opisana&nbsp; je primena optimizovanog biosenzora&nbsp; za&nbsp; procenu&nbsp; estrogenog&nbsp; potencijala sintetskih steroida i odabranih biljnih ekstrakata bogatih jedinjenjima fitoestrogenih osobina. U cilju potpunijeg sagledavanja mehanizma&nbsp; delovanja&nbsp; odabranih&nbsp; modifikovanih&nbsp; steroida&nbsp; ispitana&nbsp; je&nbsp; njihova antiproliferativna aktivnost prema ćelijskim&nbsp; linijama estrogen receptor pozitivnog kancera dojke&nbsp; (MCF-7) i kancera prostate (PC-3), dok su&nbsp; in silico metodom molekularnog&nbsp; dokinga&nbsp; predviđene&nbsp; energije&nbsp; i&nbsp; geometrije&nbsp; vezivanja&nbsp; ovih&nbsp; jedinjenja za ligand-vezujuće&nbsp; domene&nbsp; ER&alpha; i ER&beta;. Drugi deo ovog rada obuhvata razvoj testa za&nbsp; ispitivanje aktivnosti humanog enzima aromataze,&nbsp; heterologno eksprimiranog u ćelijama&nbsp; kvasca&nbsp; Saccharomyces cerevisiae&nbsp; i/ili&nbsp; bakterija Escherichia coli, u prisustvu&nbsp; ili&nbsp; odsustvu&nbsp; inhibitora.&nbsp; Interakcije modifikovanih&nbsp; steroida, odabranih na osnovu strukture,&nbsp; sa&nbsp; aromatazom&nbsp; ispitane&nbsp; su&nbsp; osetljivim spektroskopskim metodama, praćenjem promene spinskog stanja Fe iz hem grupe ili promene fluorescencije ostatka&nbsp; triptofana&nbsp; iz&nbsp; aktivnog&nbsp; centra usled konformacione&nbsp; promene&nbsp; proteina, izazvane interakcijom sa ligandom. Razvijeni in vitro testovi bez upotrebe radioaktivnih izotopa su, osim&nbsp; visoke efikasnosti&nbsp; i&nbsp; bezbednosti&nbsp; po&nbsp; korisnika&nbsp; i&nbsp; okolinu, pokazali&nbsp; specifičnost&nbsp; i&nbsp; ekonomičnost&nbsp; u preliminarnom&nbsp; skriningu&nbsp; liganada&nbsp; steroidnih receptora&nbsp; i inhibitora aromataze. Jedinjenja&nbsp; kod kojih je detektovana&nbsp; značajna biolo&scaron;ka aktivnost mogu potencijalno poslužiti kao osnova za razvoj terapeutika u lečenju hormon-zavisnih bolesti i stanja, koja danas predstavljaju globalni zdravstveni problem.</p> / <p>In&nbsp; this&nbsp; doctoral&nbsp; dissertation,&nbsp; a&nbsp; fluorescent&nbsp; assay&nbsp; in&nbsp; yeast&nbsp; was&nbsp; developed&nbsp; for&nbsp; identification&nbsp; of&nbsp; potential&nbsp; natural or synthetic ligands of ER&alpha;, ER&beta; or AR and<br />quantification&nbsp; of&nbsp; their&nbsp; binding&nbsp; affinity,&nbsp; as&nbsp; well&nbsp; asevaluation&nbsp; of&nbsp; the&nbsp; estrogenic&nbsp; potential&nbsp; of&nbsp; synthetic steroids&nbsp; and&nbsp; selected&nbsp; plant&nbsp; extracts&nbsp; rich&nbsp; in phytoestrogen&nbsp; content.&nbsp; The&nbsp; assay&nbsp; could&nbsp; be&nbsp; used&nbsp; to&nbsp; screen&nbsp; libraries&nbsp; of&nbsp; modified&nbsp; steroids&nbsp; and xenoestrogens.&nbsp; In&nbsp; order&nbsp; to&nbsp; better&nbsp; understand&nbsp; the biomedical&nbsp; potential&nbsp; of&nbsp; selected&nbsp; modified&nbsp; steroids, results&nbsp; were&nbsp; compared&nbsp; to&nbsp; antiproliferative&nbsp; activity against&nbsp; estrogen&nbsp; receptor&nbsp; positive&nbsp; breast&nbsp; cancer (MCF-7)&nbsp; and&nbsp; prostate&nbsp; cancer&nbsp; (PC-3)&nbsp; cell&nbsp; lines. Binding&nbsp; energies&nbsp; and&nbsp; the&nbsp; geometry&nbsp; of&nbsp; binding&nbsp; of these&nbsp; compounds&nbsp; for&nbsp; ER&alpha;&nbsp; and&nbsp; ER&beta;&nbsp; ligand&nbsp; binding domains&nbsp; were&nbsp; predicted&nbsp; in&nbsp; silico&nbsp; by&nbsp; molecular&nbsp; docking&nbsp; methods.&nbsp; The&nbsp; second&nbsp; part&nbsp; of&nbsp; this&nbsp; study includes development&nbsp; of&nbsp; an&nbsp; assay&nbsp; for&nbsp; study&nbsp; of&nbsp; aromatase&nbsp; activity&nbsp; in&nbsp; the&nbsp; presence&nbsp; or&nbsp; absence&nbsp; of inhibitors&nbsp; by&nbsp; heterologous&nbsp; expression&nbsp; of&nbsp; human aromatase&nbsp; in&nbsp; Saccharomyces&nbsp; cerevisiae&nbsp; and/or Escherichia&nbsp; coli&nbsp; cells,&nbsp; as&nbsp; model-organisms. Furthermore, interactions between modified steroids, selected&nbsp; according&nbsp; to&nbsp; their&nbsp; structure,&nbsp; and&nbsp; aromatase were&nbsp; tested&nbsp; using&nbsp; sensitive&nbsp; spectroscopic&nbsp; methods based on ligand-induced changes&nbsp; in&nbsp; the&nbsp; spin state of Fe&nbsp; from&nbsp; the&nbsp; heme&nbsp; group&nbsp; or&nbsp; changes&nbsp; in&nbsp; the fluorescence&nbsp; of&nbsp; a&nbsp; tryptophan&nbsp; residue&nbsp; in&nbsp; the&nbsp; active site.&nbsp; The&nbsp; non-radioactive&nbsp; in&nbsp; vitro&nbsp; assays&nbsp; developed&nbsp; here, besides high efficiency, user and environmental safety,&nbsp; also&nbsp; have&nbsp; greater&nbsp; specificity&nbsp; and&nbsp; are&nbsp; more cost-effective&nbsp; for&nbsp; preliminary&nbsp; screening&nbsp; of&nbsp; steroid receptor&nbsp; ligands&nbsp; and&nbsp; aromatase&nbsp; inhibitors. Additionally,&nbsp; compounds&nbsp; identified&nbsp; to&nbsp; express significant biological activity can serve as a basis for the&nbsp; development&nbsp; of&nbsp; potential&nbsp; therapeutics&nbsp; in&nbsp; the treatment&nbsp; of&nbsp; hormone-dependent&nbsp; diseases&nbsp; and conditions, a global health issue today.</p>

This thesis examines the rapid, non-genomic effects of estrogens on neural plasticity and learning. Estrogens are classically known to affect gene transcription events, however they have more recently been found to also rapidly activate second messenger systems within 1hr of administration. Therefore, we first examined the rapid effects of 17β-estradiol, and an estrogen receptor (ER) α and ERβ agonist on three different learning paradigms: object placement, object recognition, and social recognition. We found that both systemic injections and intrahippocampal delivery of 17β-estradiol and the ERα agonist improved performance on all 3 learning paradigms within 40min of hormone administration. However, the ERβ agonist administered systemically or intrahippocampally, improved performance only on the object placement learning paradigm, while having no effect on object recognition, and impairing social recognition at high doses. To elucidate how estrogens might rapidly affect learning, we examined how estrogens rapidly affect the neural plasticity of CA1 hippocampal neurons. We found that 17β-estradiol and the ERα agonist increased dendritic spine density in CA1 hippocampal neurons within 40min of administration, suggesting that estrogens rapidly increase the density of synapses within this brain region. Conversely, the ERβ agonist did not affect spine density, or decreased spine density. In addition, by using whole-cell patch clamp recordings of CA1 pyramidal neurons, we were able to determine that 17β-estradiol and the ERα agonist rapidly reduced AMPA receptor (but not NMDA receptor) mediated membrane depolarizations after 15min of hormone application. Similar to above, the ERβ agonist had no effect on AMPA or NMDA receptor mediated membrane depolarizations. These data suggest that estrogens rapidly promote the development of immature synapses (which contain low levels of synaptic AMPA receptors) within the CA1 hippocampus. Immature spines provide synaptic sites at which new memories can be stored and are thought of as “learning spines” (Kasai et al, 2003). Therefore, estrogens (through ERα) may rapidly induce the formation of hippocampal immature spines to promote learning. / Funded by NSERC