Foi realizado um programa de seqüenciamento de cDNAs obtidos de bibliotecas da fase de germinação do fungo aquático Blastocladiella emersonii. Os dados gerados, em conjunto com o projeto de seqüenciamento de cDNAs da fase de esporulação do fungo, permitiram a descoberta de aproximadamente 4.900 genes diferentes de B. emersonii (Ribichich et al., 2005). Os genes putativos foram anotados e associados com as categorias funcionais descritas pelo Gene Ontology Consortium e encontram-se na base de dados http://www.blasto.iq.usp.br. O perfil de expressão dos genes foi avaliado por Northern digital e vários transcritos apresentaram perfil de expressão regulado durante a germinação. Numa segunda etapa deste trabalho, cerca de 3.600 genes putativos de B. emersonii foram arranjados em lâminas de vidro e empregados como sondas para a investigação da expressão gênica global em células de diferentes tempos após a indução da germinação. Analisamos ainda, as diferenças entre a germinação induzida em meio nutriente e a germinação em solução inorgânica, na qual os indutores efetivos da germinação foram adenina ou íons potássio. Na germinação em meio nutriente mais de 900 genes, cerca de 26% do total presente nos micro-arranjos, mostraram-se diferencialmente expressos em pelo menos um dos tempos analisados. Foram induzidos durante a germinação, principalmente, genes envolvidos no crescimento celular, incluindo biossíntese de proteínas, transcrição e ativação do metabolismo energético. No entanto, estes genes não foram induzidos quando a germinação ocorreu em solução inorgânica. Verificamos ainda que vários transcritos envolvidos com a percepção do meio extracelular e com a sinalização celular, codificando proteínas necessárias para disparar o programa de germinação, encontram-se presentes nos zoósporos. Além disso, observamos que alguns dos transcritos encontrados nos zoósporos foram reprimidos na germinação em meio nutriente, mas mantiveram níveis elevados de expressão quando a germinação foi feita em solução inorgânica, indicando que os nutrientes exercem um papel importante na regulação da expressão de determinados genes nesta fase do desenvolvimento. / We conducted large scale cDNA sequencing from libraries obtained using RNA from germinating cells of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. Data obtained in this work, along with cDNAs from sporulating cells, lead to the discovery of nearly 4.900 different genes from B. emersonii (Ribichich et al., 2005). The putative genes were annotated and associated with the functional categories described by the Gene Ontology Consortium and are available at the web site http://www.blasto.iq.usp.br. The expression patterns of these genes were evaluated by digital Northern analysis and we detected several transcripts that presented expression profile regulated during germination. In a second approach, nearly 3.600 putative genes from B. emersonii were spotted into glass slides and used as probes to investigate the global gene expression pattern in cells isolated at different times after induction of germination. We also analyzed the differences between the germination triggered in nutrient medium and the germination in inorganic solution, in which the effective inducers of germination were either adenine or potassium ions. More than 900 genes were differentially expressed during germination in nutrient medium in at least one of the time points analyzed, which correspond to 26 % of the total genes in the microarrays. The genes induced during this process were mainly those involved in cellular growth, including protein biosynthesis, transcription and energetic metabolism. However, these genes were not induced when germination occurred in inorganic solution. In addition, we verified that many transcripts involved in sensing the environment and also in signal transduction, encoding proteins necessary to trigger the germination program, were present in the zoospores. Another finding is that some of the transcripts found in zoospores were repressed when germination proceeded in nutrient medium, but were maintained at high levels when germination occurred in inorganic solution, suggesting that nutrients exert an important role in regulating the expression of some genes in this stage of development.

The field of proteogenomics operates at the interface between proteomics and genomics, and has emerged during the past decade to exploit the vast quantities of high-throughput sequence data. A range of different proteogenomics approaches have been developed, which integrate mass spectrometry data with genome sequence data to provide empirical evidence for protein-coding genes. However, current methods may not be optimized as they do not fully consider the splicing complexity in eukaryotes and there is currently no best practice method. To address this, we investigate the level of proteomics support for Ensembl gene models in human, and a selection of model organisms. We find a disparity between the number of splice variants confirmed by extant data, and the number that can theoretically be confirmed using current proteomics technologies. We then go on to investigate EST-based proteogenomics methods, which enabled the discovery of novel peptide sequences in the chicken genome, which represent hitherto unannotated genes, amended gene models, polymorphisms, and genes missing from the genome assembly. Different approaches for searching mass spectrometry data against transcript sequences are explored, and we show that searching mass spectra against protein sequences predicted by the EORF and ESTScan2 translation tools results in the best sensitivity.

A mosca domestica (Musca domestica) é um dos insetos largamente distribuído e conhecido pelo homem. A larva de M. domestica possui no conteúdo luminal do ventrículo anterior e médio uma atividade proteolítica com pH ótimo entre 3,0 3,5 e propriedades cinéticas similares a catepsina-D. Três cDNAs codificantes para preprocatepsina-D (ppCAD1, ppCAD2 e ppCAD3) foram clonados a partir de uma biblioteca de cDNA ventricular de larvas de M. domestica. As sequências possuem o peptídeo sinal, o propeptídeo e a enzima madura contendo os resíduos catalíticos e todos os resíduos de ligação ao substrato conservados, achados em uma catepsina-D lisossomal bovina. Um cladograma de sequências de aminoácidos de catepsinas-D de insetos e vertebrados depositados no GENBANK formou um grande grupo dividido em duas ramificações monofiléticas: Uma com sequências de vertebrados e a outra com sequências de catepsinas-D lisossomais de insetos incluindo a ppCAD1. A sequência do pepsinogênio humana, ppCAD2, ppCAD3 e uma sequência de D. melanogaster são excluídas desse grande grupo indicando uma função não lisossomal para essas sequências. ppCAD3 deve corresponder a uma catepsina-D digestiva encontrada no conteúdo luminal em larvas do inseto devido: (1) Análise por RT-PCR indicam que os transcritos codificantes para a CAD3 são expressos no ventrículo anterior e porção proximal do ventrículo médio. (2) pCAD3 recombinante após autoativação sob condições ácidas possui um pH ótimo entre 2,5 3,0 que é próximo ao pH luminal do ventrículo médio onde essa enzima atua. (3) Imunoblots das proteínas de diferentes tecidos e marcadas com o anticorpo preparado contra a pCAD3 foi positiva apenas nos tecidos e conteúdo do ventrículo anterior e médio. (4) CAD3 é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção e próxima a microvilosidades nas células do ventrículo anterior e médio. Esses dados suportam a idéia que ao se adaptar a um hábito detritivo, a CAD digestiva da mosca (e de outros Diptera Cyclorrhapha) resultou do mesmo gene ancestral da catepsina-D lisossomal intracelular, da mesma forma que se acredita que ocorreu com a pepsina em vertebrados. Uma limitada quantidade de informações de sequências de DNA e aspectos moleculares de M. domestica é disponível até o presente momento. Nós então propusemos gerar sequências de ESTs a partir de uma bibilioteca de cDNA ventricular da larva desse inseto. Um total de 826 ESTs randomicamente selecionados presentes no ventrículos de larvas de M. domestica foram seqüenciados e analisados com programas de bioinformática e separado em 323 clusters. As sequências foram manualmente anotadas e separadas em 3 categorias: (S) produtos provavelmente secretados, (H) produtos de metabolismo em geral (housekeeping) e (U) produtos sem função conhecida. Cento e sessenta clusters (423 ESTs) codificavam para proteínas secretadas tais como: lisozimas, lipases, tripsinas, quimotripsinas, dipeptidades, carboxipeptidase e α-amilases. Cento e trinta e dois clusters (190 ESTs) codificavam para sequências de metabolismo em energético, síntese de proteínas, transdução de sinal e outras funções celulares. Noventa e cinco clusters (231 ESTs) codificaram para proteínas sem similaridades com proteínas conhecidas no banco de dados. Estudos de expressão, localização e imunocitoquímica de sequências alvos deverão no futuro nos fornecer um melhor entendimento da fisiologia digestiva da larva de Musca domestica em detalhes moleculares. Uma enzima lipolítica (LipMD) foi identificada no item anterior. A sequência de aminoácidos obtidas é homóloga a lipases e contém os três bem conservados resíduos de aminoácidos que compõe a tríade catalítica (Ser183, His273 e Asp208) para esse grupo de enzimas. O fragmento de cDNA codificante para a LipMD foi clonado em vetor pAE (Ramos et al., 2004) e expresso em E. coli produzindo uma enzima com massa molecular de 37,3 kDa. A LipMD recombinante foi purificada e é capaz de hidrolizar tributirina e um grande número de substratos (pNP-acetato a pNP-esterato) e possui um pH ótimo próximo de 7,5. Analise por RT-PCR mostrou que os transcritos codificantes para a LipMD são expressos apenas no ventrículo anterior. Western-blots após SDS-PAGE das proteínas de vários tecidos e marcados com o anticorpo produzido contra a LipMD revelou a ocorrência da enzima principalmente no conteúdo luminal do ventrículo anterior. A LipMD é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção próximas a microvilosidades no interior das células do ventrículo anterior. Esta enzima pode atuar como uma enzima lipolítica digestiva secretada nessa região do ventrículo de larvas de M. domestica / The house fly, Musca domestica is one the best known and most widely distributed insects known to humans. M. domestica larvae display in anterior and middle midgut contents, a proteolytic activity with pH optimum of 3.0-3.5 and kinetical properties like cathepsin-D. Three cDNAs coding for preprocatepsin D-like proteinases (ppCAD1, ppCAD2, ppCAD3) were cloned from a M. domestica midgut cDNA library. The sequences encoding the signal peptide, propeptide and mature enzyme having all conserved catalytic and substrate binding residues found in bovine lysosomal cathepsin-D. A cladogram of sequences of insect and vertebrate cathepsin-D-like proteinases deposited on GENBANK form a large grouping divided into two monophyletic branches: one with vertebrate and the other with insect lysosomal sequences including ppCAD1. Human pepsinogen, ppCAD2, ppCAD3, and a sequence from Drosophila melanogaster are excluded indicating a nonlysosomal function for them. CAD3 should correspond to the digestive CAD found in enzyme assays because: (1) The mRNA for CAD3 is expressed (RT-PCR) only in the anterior and proximal middle midgut. (2) Recombinant pCAD3, after auto activation has a pH optimum of 2.5-3.0 that is close to the luminal pH of M. domestica midgut. (3) Immunoblots of proteins from different tissues and stained with antiserum prepared against recombinant pCAD3 were positive only for the anterior and middle midgut tissue and contents. (4) CAD3 is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior and middle midgut cells. The data support the view that on adapting to a detritivorous habit M. domestica digestive CAD (and of other Diptera Cyclorrhapha) resulted from the same archetypical gene as the intracellular cathepsin-D, paralleling what happened with vertebrates. A limited amount of data regarding DNA sequences and molecular aspects of Musca domestica species is avaliable. We proposed to generate ESTs sequences from a cDNA library constructed from larval midguts. A total of 826 randomly selected midgut derived cDNAs were sequenced and assembled based on their similarities into 323 clusters. The sequences were classified into three categories: (S) probably secretory products, (H) housekeeping products and (U) products with unknown cell localization and function. One hundred and sixty clusters (423 ESTs) encode putative secreted proteins such as lysozymes, lipases, trypsins, chymotrypsins, dipeptidases, carboxypeptidases A and α-amylases. One hundred and thirty two clusters (190 ESTs) encode housekeeping sequences associated with energy metabolism, protein syntesis, signal transduction and other cellular functions. Ninety five clusters (213 ESTs) encode proteins with no similarity with known proteins. Expression and high-throughput bioassay screening of target sequences must provide us with a better understanding of the digestive physiology of Musca domestica midgut larvae, in molecular detail. A lipolytic enzyme (LipMD) was identified from expressed sequence tags (EST) constructed from midgut larvae cDNA library. The deduced amino acid sequence is homologous to lipases and contained the three well-conserved amino acid residues, Ser183, His273, and Asp208, which form the catalytic triad of the enzyme. The cDNA fragment encoding for LipMD was cloned into a pAE vector (Ramos et al., 2004) and expressed in E. coli producing an enzyme with a molecular mass of 37.3 kDa. The recombinant LipMD was purified and was able to hydrolyse tributyrin and a broad range of substrates, from C2 to C18 p-nitrophenyl-esters and displayed an optimal pH of approximately 7.5. RT-PCR analysis in tissue homogenates (anterior, middle and posterior midguts, hemolymph, fat body and Malpighian tubules) showed that LipMD mRNA transcripts were expressed only in anterior midgut. Western-blots after SDS PAGE of proteins from different tissues and stained with anti-LipMD serum revealed that the enzyme occurs mainly in the anterior midgut lumen. LipMD is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior midgut cells. LipMD is a candidate to be the digestive lipolytic enzyme found in that midgut region

A mosca domestica (Musca domestica) é um dos insetos largamente distribuído e conhecido pelo homem. A larva de M. domestica possui no conteúdo luminal do ventrículo anterior e médio uma atividade proteolítica com pH ótimo entre 3,0 3,5 e propriedades cinéticas similares a catepsina-D. Três cDNAs codificantes para preprocatepsina-D (ppCAD1, ppCAD2 e ppCAD3) foram clonados a partir de uma biblioteca de cDNA ventricular de larvas de M. domestica. As sequências possuem o peptídeo sinal, o propeptídeo e a enzima madura contendo os resíduos catalíticos e todos os resíduos de ligação ao substrato conservados, achados em uma catepsina-D lisossomal bovina. Um cladograma de sequências de aminoácidos de catepsinas-D de insetos e vertebrados depositados no GENBANK formou um grande grupo dividido em duas ramificações monofiléticas: Uma com sequências de vertebrados e a outra com sequências de catepsinas-D lisossomais de insetos incluindo a ppCAD1. A sequência do pepsinogênio humana, ppCAD2, ppCAD3 e uma sequência de D. melanogaster são excluídas desse grande grupo indicando uma função não lisossomal para essas sequências. ppCAD3 deve corresponder a uma catepsina-D digestiva encontrada no conteúdo luminal em larvas do inseto devido: (1) Análise por RT-PCR indicam que os transcritos codificantes para a CAD3 são expressos no ventrículo anterior e porção proximal do ventrículo médio. (2) pCAD3 recombinante após autoativação sob condições ácidas possui um pH ótimo entre 2,5 3,0 que é próximo ao pH luminal do ventrículo médio onde essa enzima atua. (3) Imunoblots das proteínas de diferentes tecidos e marcadas com o anticorpo preparado contra a pCAD3 foi positiva apenas nos tecidos e conteúdo do ventrículo anterior e médio. (4) CAD3 é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção e próxima a microvilosidades nas células do ventrículo anterior e médio. Esses dados suportam a idéia que ao se adaptar a um hábito detritivo, a CAD digestiva da mosca (e de outros Diptera Cyclorrhapha) resultou do mesmo gene ancestral da catepsina-D lisossomal intracelular, da mesma forma que se acredita que ocorreu com a pepsina em vertebrados. Uma limitada quantidade de informações de sequências de DNA e aspectos moleculares de M. domestica é disponível até o presente momento. Nós então propusemos gerar sequências de ESTs a partir de uma bibilioteca de cDNA ventricular da larva desse inseto. Um total de 826 ESTs randomicamente selecionados presentes no ventrículos de larvas de M. domestica foram seqüenciados e analisados com programas de bioinformática e separado em 323 clusters. As sequências foram manualmente anotadas e separadas em 3 categorias: (S) produtos provavelmente secretados, (H) produtos de metabolismo em geral (housekeeping) e (U) produtos sem função conhecida. Cento e sessenta clusters (423 ESTs) codificavam para proteínas secretadas tais como: lisozimas, lipases, tripsinas, quimotripsinas, dipeptidades, carboxipeptidase e α-amilases. Cento e trinta e dois clusters (190 ESTs) codificavam para sequências de metabolismo em energético, síntese de proteínas, transdução de sinal e outras funções celulares. Noventa e cinco clusters (231 ESTs) codificaram para proteínas sem similaridades com proteínas conhecidas no banco de dados. Estudos de expressão, localização e imunocitoquímica de sequências alvos deverão no futuro nos fornecer um melhor entendimento da fisiologia digestiva da larva de Musca domestica em detalhes moleculares. Uma enzima lipolítica (LipMD) foi identificada no item anterior. A sequência de aminoácidos obtidas é homóloga a lipases e contém os três bem conservados resíduos de aminoácidos que compõe a tríade catalítica (Ser183, His273 e Asp208) para esse grupo de enzimas. O fragmento de cDNA codificante para a LipMD foi clonado em vetor pAE (Ramos et al., 2004) e expresso em E. coli produzindo uma enzima com massa molecular de 37,3 kDa. A LipMD recombinante foi purificada e é capaz de hidrolizar tributirina e um grande número de substratos (pNP-acetato a pNP-esterato) e possui um pH ótimo próximo de 7,5. Analise por RT-PCR mostrou que os transcritos codificantes para a LipMD são expressos apenas no ventrículo anterior. Western-blots após SDS-PAGE das proteínas de vários tecidos e marcados com o anticorpo produzido contra a LipMD revelou a ocorrência da enzima principalmente no conteúdo luminal do ventrículo anterior. A LipMD é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção próximas a microvilosidades no interior das células do ventrículo anterior. Esta enzima pode atuar como uma enzima lipolítica digestiva secretada nessa região do ventrículo de larvas de M. domestica / The house fly, Musca domestica is one the best known and most widely distributed insects known to humans. M. domestica larvae display in anterior and middle midgut contents, a proteolytic activity with pH optimum of 3.0-3.5 and kinetical properties like cathepsin-D. Three cDNAs coding for preprocatepsin D-like proteinases (ppCAD1, ppCAD2, ppCAD3) were cloned from a M. domestica midgut cDNA library. The sequences encoding the signal peptide, propeptide and mature enzyme having all conserved catalytic and substrate binding residues found in bovine lysosomal cathepsin-D. A cladogram of sequences of insect and vertebrate cathepsin-D-like proteinases deposited on GENBANK form a large grouping divided into two monophyletic branches: one with vertebrate and the other with insect lysosomal sequences including ppCAD1. Human pepsinogen, ppCAD2, ppCAD3, and a sequence from Drosophila melanogaster are excluded indicating a nonlysosomal function for them. CAD3 should correspond to the digestive CAD found in enzyme assays because: (1) The mRNA for CAD3 is expressed (RT-PCR) only in the anterior and proximal middle midgut. (2) Recombinant pCAD3, after auto activation has a pH optimum of 2.5-3.0 that is close to the luminal pH of M. domestica midgut. (3) Immunoblots of proteins from different tissues and stained with antiserum prepared against recombinant pCAD3 were positive only for the anterior and middle midgut tissue and contents. (4) CAD3 is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior and middle midgut cells. The data support the view that on adapting to a detritivorous habit M. domestica digestive CAD (and of other Diptera Cyclorrhapha) resulted from the same archetypical gene as the intracellular cathepsin-D, paralleling what happened with vertebrates. A limited amount of data regarding DNA sequences and molecular aspects of Musca domestica species is avaliable. We proposed to generate ESTs sequences from a cDNA library constructed from larval midguts. A total of 826 randomly selected midgut derived cDNAs were sequenced and assembled based on their similarities into 323 clusters. The sequences were classified into three categories: (S) probably secretory products, (H) housekeeping products and (U) products with unknown cell localization and function. One hundred and sixty clusters (423 ESTs) encode putative secreted proteins such as lysozymes, lipases, trypsins, chymotrypsins, dipeptidases, carboxypeptidases A and α-amylases. One hundred and thirty two clusters (190 ESTs) encode housekeeping sequences associated with energy metabolism, protein syntesis, signal transduction and other cellular functions. Ninety five clusters (213 ESTs) encode proteins with no similarity with known proteins. Expression and high-throughput bioassay screening of target sequences must provide us with a better understanding of the digestive physiology of Musca domestica midgut larvae, in molecular detail. A lipolytic enzyme (LipMD) was identified from expressed sequence tags (EST) constructed from midgut larvae cDNA library. The deduced amino acid sequence is homologous to lipases and contained the three well-conserved amino acid residues, Ser183, His273, and Asp208, which form the catalytic triad of the enzyme. The cDNA fragment encoding for LipMD was cloned into a pAE vector (Ramos et al., 2004) and expressed in E. coli producing an enzyme with a molecular mass of 37.3 kDa. The recombinant LipMD was purified and was able to hydrolyse tributyrin and a broad range of substrates, from C2 to C18 p-nitrophenyl-esters and displayed an optimal pH of approximately 7.5. RT-PCR analysis in tissue homogenates (anterior, middle and posterior midguts, hemolymph, fat body and Malpighian tubules) showed that LipMD mRNA transcripts were expressed only in anterior midgut. Western-blots after SDS PAGE of proteins from different tissues and stained with anti-LipMD serum revealed that the enzyme occurs mainly in the anterior midgut lumen. LipMD is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior midgut cells. LipMD is a candidate to be the digestive lipolytic enzyme found in that midgut region

Blastocladiella emersonii é um fungo aquático da classe dos quitridiomicetos, notável pelas mudanças morfogenéticas que ocorrem durante o seu ciclo de vida. Neste trabalho isolamos 8.495 seqüências expressas (ESTs) deste fungo, que representam 3.226 seqüências únicas putativas. Destas seqüências, 37% foram classificadas segundo o processo biológico onde estariam envolvidas, de acordo com o sistema de anotação do Gene Ontology (GO). Analisamos os perfis de expressão in silico das ESTs usando estatística Bayesiana e os resultados obtidos foram validados por Northern blot para sete perfis de expressão selecionados. Pudemos encontrar boa correlação entre vários padrões de expressão e determinados processos biológicos. Foram selecionadas algumas seqüências potencialmente envolvidas com a esporulação do fungo para melhor caracterização. Analisamos a expressão de dois genes codificando centrinas (BeCenl e BeCen2) pertencentes a subfamílias distintas. Centrinas são proteínas ligantes de cálcio envolvidas em diferentes processos como o direcionamento do aparelho flagelar e a duplicação dos centros organizadores de microtúbulos (MTOCs). Observamos que os níveis da proteína BeCenl, que não havia sido descrita em fungos, apresentam um máximo aos 150 min da esporulação, defasado do pico de expressão do seu mRNA que ocorre aos 90 min deste estágio. A proteína BeCen2 está presente em níveis constantes durante todo a ciclo de vida do fungo, embora o seu mRNA apresente um pico de expressão aos 120 min da esporulação. Experimentos de imunofluorescência localizaram a proteína BeCenl no citoplasma e no corpo basal do zoósporo. Estes dados sugerem que BeCenl atue na re-orientação e movimento dos corpos basais e BeCen2 na duplicação dos MTOCs. Investigamos também a expressão de dois genes codificando proteína-quinases dependentes de ciclina putativas (BeCdkl e BeCdk2). Apenas uma Cdk (Cdkl) foi descrita em fungos como diretamente envolvida no controle do ciclo celular. Ambos os genes apresentam expressão diferencial, com níveis máximos de mRNA para os dois casos aos 90 min da esporulação. Por outro lado, a proteína BeCdkl está presente durante todo o ciclo de vida do fungo e foi localizada no núcleo e no capacete nuclear dos zoósporos. Um transportador putativo de hexose (Bemst) foi também analisado, com base na regulação por glicose de genes envolvidos com o ciclo celular observada em eucariotos. Verificou-se que os níveis do mRNA de Bemst diminuem drasticamente durante a esporulação, mas glicose ou outras hexoses não afetaram a expressão de Bemst. / Blastocladiella emersonii is an aquatic fungus that belongs to the class of chytridiomycetes, notable for the morphogenetic processes which occur during its life cycle. In this work we have isolated 8,495 expressed sequence tags (ESTs) from this fungus, representing 3,226 putative unigenes. From these unigenes, 37% were classified into a biological process, as a result of Gene Ontology (GO) annotation. Furthermore, we analyzed the expression profile in silico of each transcript using Bayesian Statistics and seven of these profiles were validated by Northern blot analysis. In addition, we found a good correlation between several of these expression patterns and certain biological processes. Some ESTs potentially involved in the sporulation of the fungus were selected to be further characterized. We analyzed the expression of two genes encoding two centrins (BeCenl and BeCen2) of distinct subfamilies. Centrins are calcium-binding proteins involved in different processes such as basal body orientation and duplication of the microtubuleorganizing centers (MTOCs). The amount of BeCenl, a centrin ortholog not previously described in fungi, presents a maximum at 150 min of sporulation, whereas the peak of its mRNA occurs at 90 min of this stage. Protein BeCen2 presents constant levels during the entire life cycle of the fungus, even though its mRNA shows a peak of expression at 120 min of sporulation. In addition, immunofluorescent studies localized BeCenl in the cytoplasm and the basal body of zoospores. These results suggest that BeCenl plays a role in re-orientation and movement of basal bodies and BeCen2 in MTOCs duplication. We also investigated the expression of two genes encoding putative cyclin-dependent protein kinases (BeCdkl and BeCdk2). Only one type of Cdk (Cdkl) directly involved in cell cycle control has been described in other fungi. Both genes were found to be differentially expressed, with maximum mRNA levels being detected in either case at 90 min of sporulation. In contrast, BeCdk1 is present throughout the life cycle of the fungus and was immunolocalized in the nuc1eus and the nuclear cap of zoospores. A putative hexose transporter (Bemst) was also investigated, taking into account the regulation by glucose of cell cycle controlled genes in eukaryotes. We found that Bemst mRNA levels decrease drastically during sporulation, but glucose and other hexoses had no effect on Bemst expression.

A cultura do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) se destaca como fonte protéica e mineral para as populações humanas, principalmente, para populações de baixa renda. Dentre os agentes patogênicos, o fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Lams. Scrib., causador da antracnose, é considerado o de maior importância devido aos seus efeitos destrutivos para o feijoeiro. Este estudo teve como objetivo avaliar a expressão de genes candidatos a atuarem na defesa da planta durante a interação incompatível do feijoeiro SEL 1308 e raça 73 do C. lindemuthianum, considerando diferentes tecidos (folhas, epicótilo e hipocótilo) e períodos de interação (24, 48, 72 e 96 horas). Além disso, o trabalho visou a validação de bibliotecas de ESTs (Expressed Sequence Tags) de feijoeiro (MELOTTO et al., 2005) e a análise da estabilidade de possíveis genes de referência para as análises de expressão por RT-qPCR. Foram utilizados 20 genes no estudo: 12 possivelmente responsivos ao patógeno e oito candidatos a genes de referência. A eficiência média das curvas de amplificação e valores dos ciclos e de quantificação (Cq) foram definidos no programa LinRegPCR. A estabilidade dos genes de referência foi avaliada nos programas geNorm e NormFinder. A expressão relativa dos genes alvos e normalizadores e as análises estatísticas foram determinadas no programa REST. As combinações de genes de referência Act2/Ukn2 e InsDeg/Act2 foram utilizadas para normalização dos genes-alvo por RT-qPCR. Os dados de expressão relativa dos transcritos entre as bibliotecas de ESTs foram validados pelo RT-qPCR. Os genes-alvo analisados foram todos responsivos ao sistema fitopatogênico avaliado, revelando perfil transcricional específico nos tecidos e período de interação com o patógeno. Os dados permitiram a disponibilização de genes de referência importantes para análise de expressão por RTqPCR em feijoeiro sob estresse biótico; e indícios para melhor entendimento dos processos envolvidos nos mecanismos de defesa do feijoeiro ao patógeno da antracnose / Common bean crop (Phaseolus vulgaris L.) highlight as protein and mineral source to the human population, especially, for low-income populations. Among the pathogens, Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Lams. - Scrib., which causes anthracnose, is considered the most important due to its destructive effects to common bean. This study aimed to evaluate the expression of candidate genes to act in defense of the plant during the incompatible interaction between common bean SEL 1308 and race 73 of C. lindemuthianum, considering different tissues (leaves, epicotyl and hypocotyl) and periods of interaction (24, 48, 72 and 96 hours). Also, this study attempted the validation of ESTs (Expressed Sequence Tags) libraries of common bean (MELOTTO et al., 2005) and the evaluation of candidate reference genes stability for expression analysis in RT-qPCR. Twenty genes were used: 12 candidate genes responsive to the pathogen and eight candidate reference genes. The average efficiency of amplification curves and the values of quantification cycles (Cq) were defined in LinRegPCR software. The stability of reference genes was evaluated using geNorm and NormFinder softwares. Relative expression of target and normalizer genes and statistical analysis were determined by REST software. The Act2/Ukn2 and InsDeg/Act2 reference genes combinations were used for normalization of target genes by RT-qPCR. The data of relative expression of transcripts between the libraries of ESTs were validated by RT-qPCR. All target genes analyzed were responsive to the pathogenic system evaluated, revealing specific transcriptional profiles in tissues and periods of interaction with the pathogen. The data provided the availability of normalizers important for expression analysis by RTqPCR in beans under biotic stress; and evidences to understand the processes involved in defense mechanisms of common bean against the anthracnose pathogen

A cultura do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) se destaca como fonte protéica e mineral para as populações humanas, principalmente, para populações de baixa renda. Dentre os agentes patogênicos, o fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Lams. Scrib., causador da antracnose, é considerado o de maior importância devido aos seus efeitos destrutivos para o feijoeiro. Este estudo teve como objetivo avaliar a expressão de genes candidatos a atuarem na defesa da planta durante a interação incompatível do feijoeiro SEL 1308 e raça 73 do C. lindemuthianum, considerando diferentes tecidos (folhas, epicótilo e hipocótilo) e períodos de interação (24, 48, 72 e 96 horas). Além disso, o trabalho visou a validação de bibliotecas de ESTs (Expressed Sequence Tags) de feijoeiro (MELOTTO et al., 2005) e a análise da estabilidade de possíveis genes de referência para as análises de expressão por RT-qPCR. Foram utilizados 20 genes no estudo: 12 possivelmente responsivos ao patógeno e oito candidatos a genes de referência. A eficiência média das curvas de amplificação e valores dos ciclos e de quantificação (Cq) foram definidos no programa LinRegPCR. A estabilidade dos genes de referência foi avaliada nos programas geNorm e NormFinder. A expressão relativa dos genes alvos e normalizadores e as análises estatísticas foram determinadas no programa REST. As combinações de genes de referência Act2/Ukn2 e InsDeg/Act2 foram utilizadas para normalização dos genes-alvo por RT-qPCR. Os dados de expressão relativa dos transcritos entre as bibliotecas de ESTs foram validados pelo RT-qPCR. Os genes-alvo analisados foram todos responsivos ao sistema fitopatogênico avaliado, revelando perfil transcricional específico nos tecidos e período de interação com o patógeno. Os dados permitiram a disponibilização de genes de referência importantes para análise de expressão por RTqPCR em feijoeiro sob estresse biótico; e indícios para melhor entendimento dos processos envolvidos nos mecanismos de defesa do feijoeiro ao patógeno da antracnose / Common bean crop (Phaseolus vulgaris L.) highlight as protein and mineral source to the human population, especially, for low-income populations. Among the pathogens, Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Lams. - Scrib., which causes anthracnose, is considered the most important due to its destructive effects to common bean. This study aimed to evaluate the expression of candidate genes to act in defense of the plant during the incompatible interaction between common bean SEL 1308 and race 73 of C. lindemuthianum, considering different tissues (leaves, epicotyl and hypocotyl) and periods of interaction (24, 48, 72 and 96 hours). Also, this study attempted the validation of ESTs (Expressed Sequence Tags) libraries of common bean (MELOTTO et al., 2005) and the evaluation of candidate reference genes stability for expression analysis in RT-qPCR. Twenty genes were used: 12 candidate genes responsive to the pathogen and eight candidate reference genes. The average efficiency of amplification curves and the values of quantification cycles (Cq) were defined in LinRegPCR software. The stability of reference genes was evaluated using geNorm and NormFinder softwares. Relative expression of target and normalizer genes and statistical analysis were determined by REST software. The Act2/Ukn2 and InsDeg/Act2 reference genes combinations were used for normalization of target genes by RT-qPCR. The data of relative expression of transcripts between the libraries of ESTs were validated by RT-qPCR. All target genes analyzed were responsive to the pathogenic system evaluated, revealing specific transcriptional profiles in tissues and periods of interaction with the pathogen. The data provided the availability of normalizers important for expression analysis by RTqPCR in beans under biotic stress; and evidences to understand the processes involved in defense mechanisms of common bean against the anthracnose pathogen

Blastocladiella emersonii é um fungo aquático da classe dos quitridiomicetos, notável pelas mudanças morfogenéticas que ocorrem durante o seu ciclo de vida. Neste trabalho isolamos 8.495 seqüências expressas (ESTs) deste fungo, que representam 3.226 seqüências únicas putativas. Destas seqüências, 37% foram classificadas segundo o processo biológico onde estariam envolvidas, de acordo com o sistema de anotação do Gene Ontology (GO). Analisamos os perfis de expressão in silico das ESTs usando estatística Bayesiana e os resultados obtidos foram validados por Northern blot para sete perfis de expressão selecionados. Pudemos encontrar boa correlação entre vários padrões de expressão e determinados processos biológicos. Foram selecionadas algumas seqüências potencialmente envolvidas com a esporulação do fungo para melhor caracterização. Analisamos a expressão de dois genes codificando centrinas (BeCenl e BeCen2) pertencentes a subfamílias distintas. Centrinas são proteínas ligantes de cálcio envolvidas em diferentes processos como o direcionamento do aparelho flagelar e a duplicação dos centros organizadores de microtúbulos (MTOCs). Observamos que os níveis da proteína BeCenl, que não havia sido descrita em fungos, apresentam um máximo aos 150 min da esporulação, defasado do pico de expressão do seu mRNA que ocorre aos 90 min deste estágio. A proteína BeCen2 está presente em níveis constantes durante todo a ciclo de vida do fungo, embora o seu mRNA apresente um pico de expressão aos 120 min da esporulação. Experimentos de imunofluorescência localizaram a proteína BeCenl no citoplasma e no corpo basal do zoósporo. Estes dados sugerem que BeCenl atue na re-orientação e movimento dos corpos basais e BeCen2 na duplicação dos MTOCs. Investigamos também a expressão de dois genes codificando proteína-quinases dependentes de ciclina putativas (BeCdkl e BeCdk2). Apenas uma Cdk (Cdkl) foi descrita em fungos como diretamente envolvida no controle do ciclo celular. Ambos os genes apresentam expressão diferencial, com níveis máximos de mRNA para os dois casos aos 90 min da esporulação. Por outro lado, a proteína BeCdkl está presente durante todo o ciclo de vida do fungo e foi localizada no núcleo e no capacete nuclear dos zoósporos. Um transportador putativo de hexose (Bemst) foi também analisado, com base na regulação por glicose de genes envolvidos com o ciclo celular observada em eucariotos. Verificou-se que os níveis do mRNA de Bemst diminuem drasticamente durante a esporulação, mas glicose ou outras hexoses não afetaram a expressão de Bemst. / Blastocladiella emersonii is an aquatic fungus that belongs to the class of chytridiomycetes, notable for the morphogenetic processes which occur during its life cycle. In this work we have isolated 8,495 expressed sequence tags (ESTs) from this fungus, representing 3,226 putative unigenes. From these unigenes, 37% were classified into a biological process, as a result of Gene Ontology (GO) annotation. Furthermore, we analyzed the expression profile in silico of each transcript using Bayesian Statistics and seven of these profiles were validated by Northern blot analysis. In addition, we found a good correlation between several of these expression patterns and certain biological processes. Some ESTs potentially involved in the sporulation of the fungus were selected to be further characterized. We analyzed the expression of two genes encoding two centrins (BeCenl and BeCen2) of distinct subfamilies. Centrins are calcium-binding proteins involved in different processes such as basal body orientation and duplication of the microtubuleorganizing centers (MTOCs). The amount of BeCenl, a centrin ortholog not previously described in fungi, presents a maximum at 150 min of sporulation, whereas the peak of its mRNA occurs at 90 min of this stage. Protein BeCen2 presents constant levels during the entire life cycle of the fungus, even though its mRNA shows a peak of expression at 120 min of sporulation. In addition, immunofluorescent studies localized BeCenl in the cytoplasm and the basal body of zoospores. These results suggest that BeCenl plays a role in re-orientation and movement of basal bodies and BeCen2 in MTOCs duplication. We also investigated the expression of two genes encoding putative cyclin-dependent protein kinases (BeCdkl and BeCdk2). Only one type of Cdk (Cdkl) directly involved in cell cycle control has been described in other fungi. Both genes were found to be differentially expressed, with maximum mRNA levels being detected in either case at 90 min of sporulation. In contrast, BeCdk1 is present throughout the life cycle of the fungus and was immunolocalized in the nuc1eus and the nuclear cap of zoospores. A putative hexose transporter (Bemst) was also investigated, taking into account the regulation by glucose of cell cycle controlled genes in eukaryotes. We found that Bemst mRNA levels decrease drastically during sporulation, but glucose and other hexoses had no effect on Bemst expression.

Two separate phylogenetic studies were performed for two different taxonomic levels within Hymenoptera. The first study examined the utility of expressed sequence tags for resolving relationships among hymenopteran superfamilies. Transcripts were assembled from 14,000 sequenced clones for 6 disparate Hymenopteran taxa, averaging over 660 unique contigs per species. Orthology and gene determination were performed using modifications to a previously developed computerized pipeline and compared against annotated insect genomes. Sequences from additional taxa were added from public databases with a final dataset of 24 genes for 16 taxa. The concatenated dataset recovered a robust and well-supported topology; however, there was extreme incongruity among individual gene trees. Analyses of sequences indicated strong compositional and transition biases, particularly in the third codon positions. The use of filtered supernetworks aided visualization of the existing congruent phylogenetic signal that existed across the individual gene trees. Additionally, treeness triangle plots indicated a strong residual signal in several gene trees and across codon positions in the concatenated dataset. However, most analyses of the concatenated dataset recovered expected relationships, known from other independent analyses. Thus, ESTs provide a powerful source of information for phylogenetic analysis, but results are sensitive to low taxonomic sampling and missing data. The second study examined subfamilial relationships within the parasitoid family Braconidae, using over 4kb of sequence data for 139 taxa. Bayesian inference of the concatenated dataset recovered a robust phylogeny, particularly for early divergences within the family. There was strong evidence supporting two independent lineages within the family: one leading to the noncyclostomes and one leading to the cyclostomes. Ancestral state reconstructions were performed to test the theory of ectoparasitism as the ancestral condition for all taxa within the family. Results indicated an endoparasitic ancestor for the family and for the non-cyclostome lineage, with an early transition to ectoparasitism for the cyclostome lineage. However, reconstructions of some nodes were sensitive to outgroup coding and will also be impacted with increased biological knowledge.

A avicultura brasileira tem alcançado altos índices de desempenho na produção de carne e ovos, como resultado da atualização constante de tecnologias no setor. A biotecnologia vem contribuindo nesse sentido, atuando especialmente em programas de seleção de animais com maior potencial de desenvolvimento e crescimento. Como toda a fisiologia animal é controlada direta e/ou indiretamente pela hipófise e hipotálamo, este trabalho propôs identificar e analisar genes expressos nestas estruturas de galinhas de duas linhagens divergentes quanto ao potencial de crescimento e avaliar a expressão dos genes correspondentes a transcritos cuja identidade não pôde ser revelada (sem similar nos bacos de dados), uma vez que estes podem representar possíveis genes novos. Para isto, foram construídas e analisadas bibliotecas a partir da hipófise e hipotálamo de aves de 21 dias de idade de uma linha macho de corte (TT) e uma linhagem de postura (CC), provenientes da Embrapa Suínos e Aves. Um total de 4.286 ESTs válidas foi obtido (no mínimo150 pb com qualidade PHRED acima de 20), correspondendo a 2.133 ESTs da biblioteca da linhagem TT e 2.153 ESTs da biblioteca da linhagem CC. O exercício de montagem, via programa Cap3, revelou 3.074 seqüências únicas, sendo 1.643 da biblioteca da linhagem TT e 1.649 da CC. Estas seqüências únicas foram automaticamente classificadas, de acordo com as categorias do GeneOntology, sendo que as seqüências de ambas as bibliotecas apresentaram uma distribuição similar entre os termos. Após montagem das ESTs e análise do padrão de expressão digital das seqüências constituintes, dos 389 contigs obtidos, 194 foram compostos por seqüências diferencialmente expressas entre as bibliotecas. Foram detectados 28 contigs contendo SNPs linhagem específicos, sendo 52 SNPs TT específicos e 25 CC específicos. Um total de 146 ESTs não pôde ter sua identidade revelada, porém destas, 133 puderam ser localizadas no genoma da galinha e apresentaram pelo menos uma fase de leitura aberta (ORF). Após análise de expressão gênica, os genes correspondentes a 78 destas ESTs sem identidade apresentaram-se diferencialmente expressos entre pelo menos dois dos tecidos de aves de uma linhagem comercial de corte de 21 dias de idade estudados: hipófise, hipotálamo, cérebro, fígado e músculo. Os resultados apresentados são promissores e merecem ser investigados em estudos futuros com o objetivo de identificar marcadores moleculares para programas de seleção e melhoramento animal. / The brazilian aviculture has reached a high development level in both meat and egg production as a result of constant technological atualization in the sector. Biotechnology can contribute in this way acting in selection programs of animals that show higher growth and development potential. The global animal physiology is direct or indirectly controlled by pituitary and hypothalamus. The aim of this work was to identify and analyse genes expressed in these structures of two divergent line chickens according to growth potential and evaluate the gene expression of corresponding transcripts classified as "no hit", once these ESTs could represent new genes. In this way, two pituitary and hypothalamus libraries of 21 days broiler (TT) and a layer (CC) chickens supplied by Embrapa Swine and Poultry National Research Center were constructed and analysed. A total of 4,286 valid ESTs was obtained (showing at least 150 bp with PHRED quality above 20) corresponding to 2,133 ESTs of TT line library and 2,153 ESTs of CC line library. The clustering process by Cap3 resulted in 3,074 unique sequences corresponding to 1,643 TT library sequences and 1,649 of CC sequences. These unique sequences were automatically annotated according GeneOntology categories and both library sequences showed a similar distribution between the terms. After ESTs clustering and northern digital analysis, 389 contigs were obtained – 194 of them showed differentially expressed sequences between the libraries. A total of 28 contigs showed line specific SNPs, corresponding to 52 TT specific SNPs and 25 CC specific SNPs. 146 ESTs were classified as "no hit" but 133 of these sequences were localized in chicken genome and showed open reading frame (ORF). After gene expression analysis, the genes of 78 "no hit" ESTs showed different expression level between the five tissues of commercial broilers with 21 days old: pituitary, hypothalamus, brain, liver and muscle. These results are promising and must be more investigated in future studies to identify molecular markers for use in animal selection and improvement programs.