A cutícula dos insetos é composta principalmente por uma variedade de proteínas que interagem com filamentos de quitina, um polímero de N-acetilglicosamina, para formar um envoltório rígido que protege e dá forma ao organismo. O crescimento dos insetos depende da renovação periódica da cutícula, que se desprende durante a apólise e é digerida enquanto a epiderme sintetiza uma nova cutícula substituta. Tal renovação caracteriza a muda e metamorfose e é coordenada por hormônios, com destaque para os ecdisteróides. O atual trabalho objetivou caracterizar a expressão diferencial de genes do tegumento (cutícula e epiderme subjacente), além de elucidar aspectos de regulação e função no contexto da muda e metamorfose, com foco nos genes codificadores de proteínas estruturais e enzimas cuticulares. Para este fim, utilizamos o tegumento de fases específicas da muda pupal-adulta, isto é, de pupas (Pw), de pupas em apólise (Pp) e de adultas faratas (Pbl) para análises de microarrays de cDNA. As análises dos microarrays mostraram 761 e 1173 genes diferencialmente expressos nos tegumentos de adultas faratas (Pbl) em comparação com pupas (Pw) ou pupas em apólise (Pp), respectivamente. A categorização destes genes, segundo os critérios do Gene Ontology, distinguiu totalmente o tegumento de adultas faratas (Pbl) dos tegumentos de pupas (Pw) ou pupas em apólise (Pp) tanto em relação ao critério Processo Biológico quanto em relação à Função molecular, evidenciando grande mudança na expressão gênica durante a construção do exoesqueleto definitivo nas adultas faratas (Pbl). Os microarrays mostraram aumento estatisticamente significante da expressão de 24 genes cuticulares no tegumento de adultas faratas. Este resultado foi validado por RT-PCR em tempo real (qRT-PCR) para 23 destes genes (AmelCPR3, AmelCPR4, AmelCPR6, AmelCPR14, AmelCPR15, AmelCPR17, AmelCPR23, AmelCPR24, AmelCPR25, AmelCPR28, AmelCPR29, AmelCPR30, apd-1, apd-2, apd-3, CPLCP1, Am-C, Am-D, AmelTwdl1, AmelTwdl2, GB12449, GB12811 e GB11550), e por RT-PCR semiquantitativa para o gene Amlac2. Além disto, a maior expressão de outros 2 genes cuticulares (AmelCPR1 e AmelCPR2) em adultas faratas foi demonstrada por qRT-PCR. Estes genes cuticulares positivamente regulados no tegumento de adultas faratas (Pbl) devem estar envolvidos com a formação e diferenciação do exoesqueleto definitivo. O aumento da expressão gênica neste período da muda (Pbl) é regulado pela variação do título de ecdisteróides e ocorre enquanto o título deste hormônio decai, após ter atingido o pico indutor da apólise na fase de desenvolvimento precedente (Pp). Ao contrário, as análises por qRT-PCR mostraram que 2 outros genes cuticulares (AmelCPF1 e AmelCPR1) são negativamente regulados no tegumento de adultas faratas em comparação com pupas, sugerindo que são específicos de cutícula pupal. Estes genes foram inibidos pelo aumento dos níveis de ecdisteróides, que induz a apólise. Vinte e um entre os 24 genes cuticulares diferencialmente expressos nos microarrays codificam proteínas pertencentes às famílias CPF, CPR, Apidermina, CPLCP, Análoga a peritrofina e Tweedle. Os outros 3 genes diferencialmente expressos (GB12449, GB12811, GB11550) não tinham sido ainda caracterizados como genes cuticulares. Dois deles, GB12449 e GB12811, foram sequenciados para validação da predição e para a caracterização das respectivas estruturas genômicas. Experimentos de hibridação in situ com sonda fluorescente (FISH) nos permitiram localizar altos níveis de transcritos destes genes no citoplasma de células da epiderme de adultas faratas, sugerindo fortemente sua natureza cuticular e envolvimento na construção do exoesqueleto definitivo. O presente estudo consiste na primeira análise global de expressão de genes do tegumento de uma espécie de himenóptero social. Os resultados apresentados levaram à identificação de genes com expressão associada à muda pupal-adulta e formação do exoesqueleto definitivo. Este trabalho contribui com novos dados moleculares para o aprofundamento do conhecimento da metamorfose de A. mellifera. / The insect cuticle is mainly composed of proteins that interact with chitin filaments to form a rigid structure that protects and shapes the organism. Insects grow through the periodic renewal of the cuticle, which is shed at each apolysis episode, and subsequently digested while the epidermis synthesizes the cuticle of the next stage. These molting events are coordinated by hormones, mainly ecdysteroids. The current work aimed to characterize differential gene expression in the integument (cuticle and underlying epidermis) during the ecdysteroid-regulated pupal-to-adult molt. Special attention was given to the structure and expression of genes encoding proteins and enzymes involved in cuticle formation and differentiation. To achieve these goals, we used thoracic integument of newly-ecdysed pupae (Pw), pupae in apolysis (Pp) and pharate adults (Pbl) in cDNA microarray analyses. The microarray analysis showed 761 and 1173 differentially expressed genes in the pharate adult integument (Pbl) in comparison to pupae (Pw) or pupae in apolysis (Pp), respectively. Gene Ontology terms for Biological Process and Molecular Function completely distinguished the integument of pharate adults (Pbl) from the integument of pupae (Pw) or pupae in apolysis (Pp). The microarray analysis discriminated 24 cuticular genes with a significant expression increase in the pharate adult integument. This was validated by real time RT-PCR analysis (qRT-PCR) for 23 of these genes (AmelCPR3, AmelCPR4, AmelCPR6, AmelCPR14, AmelCPR15, AmelCPR17, AmelCPR23, AmelCPR24, AmelCPR25, AmelCPR28, AmelCPR29, AmelCPR30, apd-1, apd-2, apd-3, CPLCP1, Am-C, Am-D, AmelTwdl1, AmelTwdl2, GB12449, GB12811 and GB11550), and by semiquantitative RT-PCR for Amlac2. In addition, the increased expression of other two cuticular genes (AmelCPR1 and AmelCPR2) was confirmed by qRT-PCR. These up-regulated cuticular genes in pharate adult integument apparently are involved in adult cuticle formation and differentiation, which occurs while the ecdysteroids titers decay, after reaching the peak that induces apolysis in the preceding phase (Pp). In contrast, two cuticular genes (AmelCPF1 e AmelCPR1) were confirmed by qRT-PCR analysis as negatively regulated in the integument of pharate adults compared to pupae, suggesting that they are specific to pupal cuticle. Therefore, these genes were inhibited by the increasing ecdysteroid levels that induce apolysis. Twenty one of the 24 cuticular genes differentially expressed in the microarrays encode proteins belonging to the CPF, CPR, Apidermin, CPLCP, Analogous to peritrofins and Tweedle families. The other three differentially expressed genes (GB12449, GB12811, GB11550) had not yet been assigned as cuticular genes. Two of them (GB12449 and GB12811) were sequenced, thus allowing prediction validation and gene structure characterization. In situ hybridization experiments using fluorescent probe (FISH) localized high expression of these genes in the pharate adult epidermis, strongly suggesting their involvement in the construction of the adult exoskeleton. This study is the first global gene expression analysis of the integument from a social hymenopteran species. The expression of genes in the integument was associated to the molting process and to the adult exoskeleton formation. This work contributes with new molecular data for a deeper understanding of A. mellifera metamorphosis.

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Electrophysiological techniques are important tools in the study of substances that interfere with the behavior of animals. In this study, the existence of gustatory sensilla on the chelicerae of R. sanguineus was investigated by scanning electron microscopy (SEM). Also, the electrophysiological responses of the neurons present in this sensilla in nonfed ticks to substances with the potential to act as phagostimulant, such as salts (KCl and NaCl), sugars (glucose, sucrose and fructose), the nucleotide adenosine triphosphate (ATP), the tripeptide reduced glutathione (GSH) and two purine (guanine and hypoxanthine) were assessed. Phytoecdysteroids (PES), compounds analogous to ecdysteroids, known as the molting hormones in arthropods, were also tested in electrophysiology. The PES ecdysone (E), 20-hidroxyecdysone (20E), ponasterone A (PonA), makisterone A (MakA), inokosterone (Inok) and Pterosterone (Pte) were tested on nonfed and fed ticks. To evaluate the influence the PEs identified as active in electrophysiology on feeding behavior of R. sanguineus, attachment bioassays in vivo were proceeded. The images obtained with SEM revealed the existence of a pore in the inner digit of the chelicerae, involved in taste perception in these ticks. The results obtained in electrophysiology showed strong activity of R. sanguineus cheliceral neurons to glucose and GSH, at concentrations above 10-4 M, to ATP from 10-2 M, and salts from 10-1 M. The action potentials observed in response to ATP at all used concentrations (from 10-6 M to 10-2 M), and to KCl at 1 M were from different neurons, while the action potentials to the other potentially phagostimulant stimuli were from a single neuron. Considering the responses to PEs in nonfed ticks, MakA and Pte triggered action potentials frequencies greater than the negative control, with detection thresholds of 10-6 M and 10-12 M, respectively. The action potentials amplitudes for these substances as well as for 20E and PonA were higher than those for the control, indicating the activity of a different neuron from that observed for the negative control. In fed ticks, only Pte at 10-4 M remained active. In the behavior assays, there was no difference in attachment between PEs and the control and no interference in the biological parameters was observed. The results obtained in this study showed the ability of R. sanguineus to detect in their cheliceral taste sensilla substances with different natures, as potential phagostimulants and PEs. Further studies in this area are needed to elucidate the role of these substances in the chemical ecology of these ticks. / Rhipicephalus sanguineus é um ectoparasita de cães domésticos, também encontrado em outros mamíferos, inclusive no homem. Tem elevada importância nas medicinas humana e veterinária, podendo transmitir agentes patogênicos causadores de doenças, como as febres botonosa e maculosa em humanos e a babesiose e a erliquiose em cães. Seu controle é feito com o uso de acaricidas químicos, o que, ao longo do tempo, selecionou populações deste carrapato resistentes a estes produtos. Para a elaboração de estratégias de controle deste carrapato é necessário conhecer sua ecologia. Técnicas eletrofisiológicas são ferramentas importantes na identificação de substâncias que interferem no comportamento de animais. Neste trabalho foi investigada a existência de sensilas gustativas nas quelíceras de R. sanguineus por meio da microscopia eletrônica de varredura (MEV). Também se avaliou a resposta eletrofisiológica dos neurônios destas sensilas, em carrapatos não alimentados, a substâncias com potencial para efeito fagoestimulante, tais como sais (KCl e NaCl), açúcares (glicose, sacarose e frutose), o nucleotídeo trifosfato de adenosina (ATP) e o tripeptídeo glutationa reduzida (GSH), assim como purinas (guanina e hipoxantina). Fitoecdisteróides (FES), compostos análogos aos ecdisteróides, conhecidos como hormônios da muda em artrópodes, foram igualmente avaliados pela eletrofisiologia. Foram empregados carrapatos antes e após a alimentação e os seguintes FEs: ecdisona (E), 20-hidroxiecdisona (20E), ponasterona A (PonA), makisterona A (MakA), inokosterona (Inok) e pterosterona (Pte). Para avaliar a interferência, no comportamento de alimentação de R. sanguineus, dos FEs que foram identificados ativos na eletrofisiologia, foram empregados testes de fixação in vivo. As imagens obtidas com a MEV evidenciaram a existência de um poro no dígito interno das quelíceras, envolvido na percepção gustativa, nesses carrapatos. Os resultados obtidos com a eletrofisiologia revelaram forte atividade de neurônios quelicerais de R. sanguineus à glicose e à GSH, em concentrações acima de 10-4 M, ao ATP, a partir de 10-2 M, e aos sais a partir de 10-1 M. Os potenciais de ação observados em resposta ao estímulo com ATP, em todas as concentrações empregadas (de 10-6 M a 10-2 M), e ao KCl a 1 M foram oriundos de diferentes neurônios, enquanto que aos demais estímulos potencialmente fagoestimulantes foram provenientes de um único neurônio. Quanto aos FEs, em carrapatos não alimentados, MakA e Pte desencadearam frequências de potenciais de ação superiores ao controle negativo, com limiares de detecção de 10-6 M e 10-12 M, respectivamente. As amplitudes dos potenciais de ação para estas substâncias bem como para 20E e PonA foram maiores que as do controle, indicando a atividade de um neurônio diferente do observado para o controle negativo. Nos carrapatos após alimentação, somente Pte à 10-4M permaneceu ativa. Nos testes comportamentais, não houve diferença de fixação entre os tratamentos com FEs e com o controle negativo e nem interferência do FEs nos parâmetros biológicos avaliados. Os resultados obtidos no presente estudo evidenciaram a capacidade de R. sanguineus em detectar, em suas sensilas gustativas quelicerais, substâncias de diferentes naturezas, como potenciais fagoestimulantes e FEs. Mais estudos nesta área são necessários visando esclarecer o papel destas substâncias na ecologia química destes carrapatos.

A cutícula dos insetos é composta principalmente por uma variedade de proteínas que interagem com filamentos de quitina, um polímero de N-acetilglicosamina, para formar um envoltório rígido que protege e dá forma ao organismo. O crescimento dos insetos depende da renovação periódica da cutícula, que se desprende durante a apólise e é digerida enquanto a epiderme sintetiza uma nova cutícula substituta. Tal renovação caracteriza a muda e metamorfose e é coordenada por hormônios, com destaque para os ecdisteróides. O atual trabalho objetivou caracterizar a expressão diferencial de genes do tegumento (cutícula e epiderme subjacente), além de elucidar aspectos de regulação e função no contexto da muda e metamorfose, com foco nos genes codificadores de proteínas estruturais e enzimas cuticulares. Para este fim, utilizamos o tegumento de fases específicas da muda pupal-adulta, isto é, de pupas (Pw), de pupas em apólise (Pp) e de adultas faratas (Pbl) para análises de microarrays de cDNA. As análises dos microarrays mostraram 761 e 1173 genes diferencialmente expressos nos tegumentos de adultas faratas (Pbl) em comparação com pupas (Pw) ou pupas em apólise (Pp), respectivamente. A categorização destes genes, segundo os critérios do Gene Ontology, distinguiu totalmente o tegumento de adultas faratas (Pbl) dos tegumentos de pupas (Pw) ou pupas em apólise (Pp) tanto em relação ao critério Processo Biológico quanto em relação à Função molecular, evidenciando grande mudança na expressão gênica durante a construção do exoesqueleto definitivo nas adultas faratas (Pbl). Os microarrays mostraram aumento estatisticamente significante da expressão de 24 genes cuticulares no tegumento de adultas faratas. Este resultado foi validado por RT-PCR em tempo real (qRT-PCR) para 23 destes genes (AmelCPR3, AmelCPR4, AmelCPR6, AmelCPR14, AmelCPR15, AmelCPR17, AmelCPR23, AmelCPR24, AmelCPR25, AmelCPR28, AmelCPR29, AmelCPR30, apd-1, apd-2, apd-3, CPLCP1, Am-C, Am-D, AmelTwdl1, AmelTwdl2, GB12449, GB12811 e GB11550), e por RT-PCR semiquantitativa para o gene Amlac2. Além disto, a maior expressão de outros 2 genes cuticulares (AmelCPR1 e AmelCPR2) em adultas faratas foi demonstrada por qRT-PCR. Estes genes cuticulares positivamente regulados no tegumento de adultas faratas (Pbl) devem estar envolvidos com a formação e diferenciação do exoesqueleto definitivo. O aumento da expressão gênica neste período da muda (Pbl) é regulado pela variação do título de ecdisteróides e ocorre enquanto o título deste hormônio decai, após ter atingido o pico indutor da apólise na fase de desenvolvimento precedente (Pp). Ao contrário, as análises por qRT-PCR mostraram que 2 outros genes cuticulares (AmelCPF1 e AmelCPR1) são negativamente regulados no tegumento de adultas faratas em comparação com pupas, sugerindo que são específicos de cutícula pupal. Estes genes foram inibidos pelo aumento dos níveis de ecdisteróides, que induz a apólise. Vinte e um entre os 24 genes cuticulares diferencialmente expressos nos microarrays codificam proteínas pertencentes às famílias CPF, CPR, Apidermina, CPLCP, Análoga a peritrofina e Tweedle. Os outros 3 genes diferencialmente expressos (GB12449, GB12811, GB11550) não tinham sido ainda caracterizados como genes cuticulares. Dois deles, GB12449 e GB12811, foram sequenciados para validação da predição e para a caracterização das respectivas estruturas genômicas. Experimentos de hibridação in situ com sonda fluorescente (FISH) nos permitiram localizar altos níveis de transcritos destes genes no citoplasma de células da epiderme de adultas faratas, sugerindo fortemente sua natureza cuticular e envolvimento na construção do exoesqueleto definitivo. O presente estudo consiste na primeira análise global de expressão de genes do tegumento de uma espécie de himenóptero social. Os resultados apresentados levaram à identificação de genes com expressão associada à muda pupal-adulta e formação do exoesqueleto definitivo. Este trabalho contribui com novos dados moleculares para o aprofundamento do conhecimento da metamorfose de A. mellifera. / The insect cuticle is mainly composed of proteins that interact with chitin filaments to form a rigid structure that protects and shapes the organism. Insects grow through the periodic renewal of the cuticle, which is shed at each apolysis episode, and subsequently digested while the epidermis synthesizes the cuticle of the next stage. These molting events are coordinated by hormones, mainly ecdysteroids. The current work aimed to characterize differential gene expression in the integument (cuticle and underlying epidermis) during the ecdysteroid-regulated pupal-to-adult molt. Special attention was given to the structure and expression of genes encoding proteins and enzymes involved in cuticle formation and differentiation. To achieve these goals, we used thoracic integument of newly-ecdysed pupae (Pw), pupae in apolysis (Pp) and pharate adults (Pbl) in cDNA microarray analyses. The microarray analysis showed 761 and 1173 differentially expressed genes in the pharate adult integument (Pbl) in comparison to pupae (Pw) or pupae in apolysis (Pp), respectively. Gene Ontology terms for Biological Process and Molecular Function completely distinguished the integument of pharate adults (Pbl) from the integument of pupae (Pw) or pupae in apolysis (Pp). The microarray analysis discriminated 24 cuticular genes with a significant expression increase in the pharate adult integument. This was validated by real time RT-PCR analysis (qRT-PCR) for 23 of these genes (AmelCPR3, AmelCPR4, AmelCPR6, AmelCPR14, AmelCPR15, AmelCPR17, AmelCPR23, AmelCPR24, AmelCPR25, AmelCPR28, AmelCPR29, AmelCPR30, apd-1, apd-2, apd-3, CPLCP1, Am-C, Am-D, AmelTwdl1, AmelTwdl2, GB12449, GB12811 and GB11550), and by semiquantitative RT-PCR for Amlac2. In addition, the increased expression of other two cuticular genes (AmelCPR1 and AmelCPR2) was confirmed by qRT-PCR. These up-regulated cuticular genes in pharate adult integument apparently are involved in adult cuticle formation and differentiation, which occurs while the ecdysteroids titers decay, after reaching the peak that induces apolysis in the preceding phase (Pp). In contrast, two cuticular genes (AmelCPF1 e AmelCPR1) were confirmed by qRT-PCR analysis as negatively regulated in the integument of pharate adults compared to pupae, suggesting that they are specific to pupal cuticle. Therefore, these genes were inhibited by the increasing ecdysteroid levels that induce apolysis. Twenty one of the 24 cuticular genes differentially expressed in the microarrays encode proteins belonging to the CPF, CPR, Apidermin, CPLCP, Analogous to peritrofins and Tweedle families. The other three differentially expressed genes (GB12449, GB12811, GB11550) had not yet been assigned as cuticular genes. Two of them (GB12449 and GB12811) were sequenced, thus allowing prediction validation and gene structure characterization. In situ hybridization experiments using fluorescent probe (FISH) localized high expression of these genes in the pharate adult epidermis, strongly suggesting their involvement in the construction of the adult exoskeleton. This study is the first global gene expression analysis of the integument from a social hymenopteran species. The expression of genes in the integument was associated to the molting process and to the adult exoskeleton formation. This work contributes with new molecular data for a deeper understanding of A. mellifera metamorphosis.

Uma das marcantes características morfológicas e funcionais dos crustáceos e de outros artrópodes é a presença de um exoesqueleto que cria uma barreira física para o crescimento desses animais. Nos crustáceos, a muda é um evento cíclico, dividido em 5 estágios, e um deles compreende a troca desse exoesqueleto, permitindo o aumento de tamanho. O início, período e a frequência do ciclo de muda dependem da idade e do sexo do animal e de fatores ambientais e fisiológicos. Hormônios como os ecdiesteróides e o hormônio inibidor da muda produzidos e secretados pelos órgãos Y e X, respectivamente, atuam diretamente no ciclo de muda, porém outros hormônios podem regular, de forma positiva ou negativa, este processo. A melatonina é um hormônio encontrado amplamente no reino animal, porém em crustáceos, diferentemente do que ocorre nos vertebrados, a sua síntese e secreção não estão relacionadas com a presença ou ausência de luz, e seu papel na muda tem sido pouco investigado. Os animais foram aclimatados no laboratório à temperatura 22±2 °C e ciclo claro-escuro 12h:12h LD, sendo os experimentos realizados nesta mesma condição. Considerando o acima exposto, os objetivos do presente trabalho foram (1) verificar a produção de melatonina no siri azul Callinectes sapidus, através da investigação da expressão das enzimas AANAT e ASMT no pedúnculo óptico e hepatopâncreas, bem como os níveis hemolinfáticos da indolamina; (2) avaliar se existe um perfil oscilatório diário na expressão gênica dos fatores relacionados com a muda, CasMIH e CasEcR1; (3) verificar se a manipulação com melatonina exógena influencia essa expressão. Para isso, técnicas de imunohistoquímica, citometria de fluxo, ensaio imunoenzimático e PCR quantitativo foram empregadas. Nossos resultados demonstraram uma oscilação dos níveis hemolinfáticos de melatonina em siris em pré-muda, com pico às 8 horas; entretanto, no estágio de intermuda os níveis deste hormônio foram menores e constantes ao longo de 24 horas. Não pudemos comprovar a presença das enzimas da via de síntese da melatonina, uma vez que os anticorpos utilizados não apresentaram homologia às proteínas de C. sapidus. Quanto à expressão gênica, uma oscilação diária semelhante nos transcritos dos genes CasMIH e CasEcR1 ocorreu no hepatopâncreas, independente do estágio de muda. No pedúnculo óptico a oscilação dos genes em questão também foi semelhante, mas apenas na pré-muda; na intermuda houve entre eles uma relação de anti-fase. A administração de melatonina exógena (10-7 mol/siri) levou à inibição da expressão dos genes em relação ao controle: no caso de CasMIH foi de 99,7% no pedúnculo óptico e 100% no hepatopâncreas e o CasEcR1 sofreu inibição de 77% no pedúnculo óptico e 99% no hepatopâncreas. A presença de melatonina na hemolinfa é um forte indício de que o animal a sintetiza e pode estar atuando no ciclo de muda, uma vez que a administração deste hormônio inibiu a transcrição dos genes relacionados ao processo. Diante disso, fica mais clara a relevância de entender a flutuação de hormônios que não estão classicamente envolvidos no ciclo de muda, essencial para o crescimento dos crustáceos, mas que podem apresentar a função de regular este processo, como a melatonina. Ademais, a melatonina poderá ser uma boa ferramenta a ser utilizada no cultivo do siri-azul, como agente indutor da redução do período de intermuda levando à uma ecdise precoce / One of the remarkable morphological and functional features of crustaceans and other arthropods is the presence of an exoskeleton that creates a physical barrier for the animal growth. In crustaceans, molting is a cyclic event usually divided into five stages, one of them comprising the exoskeleton exchange what thus allows the increase in size. The onset, period, and frequency of the molt cycle depend on the animal age and sex, as well as on environmental and physiological factors. Hormones such as ecdysteroids and the molt-inhibiting hormone produced and secreted by the Y- and X- organ, respectively, exert direct effects on the molt cycle. Nevertheless, other hormones are known to positively or negatively regulate this process, such as melatonin. Melatonin is a hormone widely found in the animal kingdom, but in crustaceans, differently from what happens in vertebrates, its synthesis and secretion are not regulated by the presence or absence of light. In fact, its role in the molting process has been poorly investigated. The animals were acclimated in the laboratory at 22±2 °C and light-dark cycle 12h:12h LD, and the experiments were performed under the same condition. Considering the above, the objectives of this study were to: 1) verify the production of melatonin in the blue crab Callinectes sapidus, through the evaluation of the expression of key enzymes involved in the synthesis of melatonin, AANAT and ASMT, in the eyestalk and hepatopancreas, as well as melatonin levels in the hemolymph; 2) evaluate whether there exists a daily oscillatory profile in gene expression of the related molt factors, CasMIH and CasEcR1; (3) whether the exogenous melatonin influences the expression of the latter genes. To achieve these goals, immunohistochemistry, flow cytometry, immunoenzymatic assay, and quantitative PCR techniques were used. Our results demonstrated an oscillation of the hemolymphatic levels of melatonin in premolt crabs, peaking at 8 AM; however, in the intermolt stage, the levels of this hormone were smaller and constant along 24 hours. We were not able to show the presence of the enzymes involved in melatonin synthesis, since the antibodies used had no homology with C. sapidus proteins. We also demonstrated a daily oscillatory profile of CasMIH and CasEcR1 transcripts in hepatopancreas independently of the molt stage. In the eyestalk the oscillatory profile of both genes was also similar, but only in the premolt stage; in intermolt, an antiphase relationship between both genes was found. The exogenous administration of melatonin (10-7 mol/crab) inhibited the expression of CasMIH by 99.7 and 100% in eyestalk and hepatopancreas, respectively, whereas CasEcR1 was inhibited by 77% and 99%, in the eyestalk and hepatopancreas, respectively, compared to saline-treated animals. The presence of melatonin in the hemolymph is a reliable indicator that the animal synthesizes the hormone, and thus melatonin may influence the molt cycle since it inhibited the expression of molt-related genes. Therefore, the relevance of understanding the oscillation of hormones that are not classically involved in the molt cycle - essential for crustacean growth - but which can regulate the process, becomes evident. From an economic standpoint, melatonin may be a useful tool in culturing blue crab, which ultimately can shorten the intermolt stage period leading to an early ecdysis

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Many biotechnological techniques have been formed by new tools to the study of medicinal plants and for the production of homogenous and productive biomass. This work aimed to examine aspects of morphogenesis and callogenesis in Pfaffia glomerata and Pfaffia tuberosa as well as to evaluate the production of β-ecdysone in micropropagated plants, clones and calli in vitro. Nodal segments of two accessions (BRA and JB-UFSM) of P. glomerata were cultivated on Murashige and Skoog (MS) medium. In relation to P. tuberosa the process of disinfection, multiplication and acclimatization of the plants was studied. Studies referring to the induction of callus, organogenesis and embryogenesis were conducted using medium supplemented with auxins and cytokinins. Roots and aerial parts of the micropropagated plants, clones regenerated by indirect organogenesis and calli in vitro were analysed in relation to production of β-ecdysone by high efficiency liquid chromatography. Micropropagation proved to be a viable method for the production of P. glomerata plants on a commercial scale. The BRA accessions presented higher multiplication rate and β-ecdysone content when compared to JB-UFSM. Nodal segments of P. tuberosa showed an absence of microorganisms and a high survival rate after being washed with various disinfecting solutions. Better results in relation to micropropagation in this species were registered in medium with 1μM of thidiazuron, followed by subcultivation of shoots in medium without thidiazuron, where the plants showed excellent development and good adaptation to ex vitro conditions. After cultivation in the field, the β-ecdysone content found in these plants was similar to that found in wild plants in vivo. It was found that, in both studied species, the aerial parts of the plants accumulated a greater β-ecdysone content when compared to roots. Calli from nodal segments of P. glomerata showed differences in consistency, morphogenic potential and β-ecdysone content, depending on plant growth regulators concentrations added to the nutritive medium. In general, the production of this metabolite in the calli appear to be associated with the friable consistency and regeneration of shoots. In P. tuberosa the β-ecdysone content varied among the friable calli depending on the concentration of auxin and appear to be dependent on the regeneration of shoots. The P. glomerata calli presented a low plant regeneration frequency; the plants (clones) regenerated from calli presented normal morphology, but differed in relation to β-ecdysone content. In P. tuberosa several clones were regenerated from friable calli in medium MS with auxin or auxin and cytokinin. On the other hand, root explants formed embryogenic calli in medium MS with auxin and cytokinin. These biotechnological strategies involving cultivation techniques in vitro together with the dosage of β-ecdysone are pioneer studies for the genus and could be useful for the propagation and genetic breeding of these species of Brazilian ginseng. / Diversas técnicas biotecnológicas têm se constituído em novas ferramentas para o estudo de plantas medicinais, bem como para a produção de biomassa homogênea e produtiva. Em função disso, este estudo teve como objetivo estudar aspectos da morfogênese e a calogênese de Pfaffia glomerata e Pfaffia tuberosa e avaliar a produção de b-ecdisona em plantas micropropagadas, clones e calos in vitro. A micropropagação de acessos (BRA e JBUFSM) de P. glomerata foi conduzida a partir de segmentos nodais em meio nutritivo Murashige e Skoog (MS). Em P. tuberosa, estudou-se o processo de desinfestação, multiplicação e aclimatização das plantas. Estudos referentes à indução de calos, organogênese e embriogênese foram conduzidos em meio MS suplementado com auxinas e citocininas. Raízes e as partes aéreas das plantas micropropagadas, plantas (clones) regeneradas via organogênese indireta e calos cultivados in vitro foram analisados em relação ao conteúdo de b-ecdisona em cromatografia líquida de alta eficiência. A micropropagação mostrou ser um método adequado para a produção de mudas de P. glomerata, em escala comercial. O acesso BRA apresentou uma maior taxa de propagação em meio MS e um maior teor de b-ecdisona quando comparado ao acesso JB-UFSM. Segmentos nodais de P. tuberosa apresentaram ausência de microrganismos e uma alta taxa de sobrevivência após lavagens com várias soluções desinfestantes. Melhores resultados em relação à micropropagação nesta espécie foram registrados em meio MS acrescido de 1 μM de TDZ, seguido do subcultivo dos brotos em meio MS isento de fitoreguladores, no qual as plantas apresentaram excelente desenvolvimento e uma ótima adaptação às condições ex vitro. Após cultivo no solo, o teor de β-ecdisona encontrado nessas plantas foi similar ao encontrado em plantas nativas in vivo. Constatou-se que, em ambas as espécies estudadas, as partes aéreas das plantas acumularam um maior teor de β-ecdisona quando comparado ao sistema radicular. Calos de P. glomerata apresentaram diferenças quanto à consistência, potencial morfogênico e produção de b-ecdisona dependendo das concentrações dos fitoreguladores adicionados ao meio nutritivo. Em geral, a produção desse metabólito nos calos parece estar associada à consistência friável e a regeneração de brotos. Em P. tuberosa, o teor de β-ecdisona variou entre os calos friáveis organogênicos dependendo da concentração de auxina adicionada ao meio nutritivo; além disso, a presença de β-ecdisona nos calos parece ser dependente da regeneração de parte aérea. Os calos de P. glomerata apresentaram um baixa frequência de regeneração de brotos; as plantas (clones) regeneradas a partir dos calos apresentaram morfologia normal, mas diferiram quanto ao conteúdo de β-ecdisona. Em P. tuberosa, vários clones foram regenerados a partir de calos friáveis formados em meio MS com auxina ou auxina e citocinina. Por outro lado, explantes radiculares formaram calos embriogênicos apenas quando cultivados em meio com citocinina e auxina. Estas estratégias biotecnológicas envolvendo técnicas de cultivo in vitro juntamente com o doseamento de β-ecdisona são pioneiras para o gênero e poderão ser úteis para a propagação e o melhoramento dessas espécies de ginseng brasileiro.

Uma das marcantes características morfológicas e funcionais dos crustáceos e de outros artrópodes é a presença de um exoesqueleto que cria uma barreira física para o crescimento desses animais. Nos crustáceos, a muda é um evento cíclico, dividido em 5 estágios, e um deles compreende a troca desse exoesqueleto, permitindo o aumento de tamanho. O início, período e a frequência do ciclo de muda dependem da idade e do sexo do animal e de fatores ambientais e fisiológicos. Hormônios como os ecdiesteróides e o hormônio inibidor da muda produzidos e secretados pelos órgãos Y e X, respectivamente, atuam diretamente no ciclo de muda, porém outros hormônios podem regular, de forma positiva ou negativa, este processo. A melatonina é um hormônio encontrado amplamente no reino animal, porém em crustáceos, diferentemente do que ocorre nos vertebrados, a sua síntese e secreção não estão relacionadas com a presença ou ausência de luz, e seu papel na muda tem sido pouco investigado. Os animais foram aclimatados no laboratório à temperatura 22±2 °C e ciclo claro-escuro 12h:12h LD, sendo os experimentos realizados nesta mesma condição. Considerando o acima exposto, os objetivos do presente trabalho foram (1) verificar a produção de melatonina no siri azul Callinectes sapidus, através da investigação da expressão das enzimas AANAT e ASMT no pedúnculo óptico e hepatopâncreas, bem como os níveis hemolinfáticos da indolamina; (2) avaliar se existe um perfil oscilatório diário na expressão gênica dos fatores relacionados com a muda, CasMIH e CasEcR1; (3) verificar se a manipulação com melatonina exógena influencia essa expressão. Para isso, técnicas de imunohistoquímica, citometria de fluxo, ensaio imunoenzimático e PCR quantitativo foram empregadas. Nossos resultados demonstraram uma oscilação dos níveis hemolinfáticos de melatonina em siris em pré-muda, com pico às 8 horas; entretanto, no estágio de intermuda os níveis deste hormônio foram menores e constantes ao longo de 24 horas. Não pudemos comprovar a presença das enzimas da via de síntese da melatonina, uma vez que os anticorpos utilizados não apresentaram homologia às proteínas de C. sapidus. Quanto à expressão gênica, uma oscilação diária semelhante nos transcritos dos genes CasMIH e CasEcR1 ocorreu no hepatopâncreas, independente do estágio de muda. No pedúnculo óptico a oscilação dos genes em questão também foi semelhante, mas apenas na pré-muda; na intermuda houve entre eles uma relação de anti-fase. A administração de melatonina exógena (10-7 mol/siri) levou à inibição da expressão dos genes em relação ao controle: no caso de CasMIH foi de 99,7% no pedúnculo óptico e 100% no hepatopâncreas e o CasEcR1 sofreu inibição de 77% no pedúnculo óptico e 99% no hepatopâncreas. A presença de melatonina na hemolinfa é um forte indício de que o animal a sintetiza e pode estar atuando no ciclo de muda, uma vez que a administração deste hormônio inibiu a transcrição dos genes relacionados ao processo. Diante disso, fica mais clara a relevância de entender a flutuação de hormônios que não estão classicamente envolvidos no ciclo de muda, essencial para o crescimento dos crustáceos, mas que podem apresentar a função de regular este processo, como a melatonina. Ademais, a melatonina poderá ser uma boa ferramenta a ser utilizada no cultivo do siri-azul, como agente indutor da redução do período de intermuda levando à uma ecdise precoce / One of the remarkable morphological and functional features of crustaceans and other arthropods is the presence of an exoskeleton that creates a physical barrier for the animal growth. In crustaceans, molting is a cyclic event usually divided into five stages, one of them comprising the exoskeleton exchange what thus allows the increase in size. The onset, period, and frequency of the molt cycle depend on the animal age and sex, as well as on environmental and physiological factors. Hormones such as ecdysteroids and the molt-inhibiting hormone produced and secreted by the Y- and X- organ, respectively, exert direct effects on the molt cycle. Nevertheless, other hormones are known to positively or negatively regulate this process, such as melatonin. Melatonin is a hormone widely found in the animal kingdom, but in crustaceans, differently from what happens in vertebrates, its synthesis and secretion are not regulated by the presence or absence of light. In fact, its role in the molting process has been poorly investigated. The animals were acclimated in the laboratory at 22±2 °C and light-dark cycle 12h:12h LD, and the experiments were performed under the same condition. Considering the above, the objectives of this study were to: 1) verify the production of melatonin in the blue crab Callinectes sapidus, through the evaluation of the expression of key enzymes involved in the synthesis of melatonin, AANAT and ASMT, in the eyestalk and hepatopancreas, as well as melatonin levels in the hemolymph; 2) evaluate whether there exists a daily oscillatory profile in gene expression of the related molt factors, CasMIH and CasEcR1; (3) whether the exogenous melatonin influences the expression of the latter genes. To achieve these goals, immunohistochemistry, flow cytometry, immunoenzymatic assay, and quantitative PCR techniques were used. Our results demonstrated an oscillation of the hemolymphatic levels of melatonin in premolt crabs, peaking at 8 AM; however, in the intermolt stage, the levels of this hormone were smaller and constant along 24 hours. We were not able to show the presence of the enzymes involved in melatonin synthesis, since the antibodies used had no homology with C. sapidus proteins. We also demonstrated a daily oscillatory profile of CasMIH and CasEcR1 transcripts in hepatopancreas independently of the molt stage. In the eyestalk the oscillatory profile of both genes was also similar, but only in the premolt stage; in intermolt, an antiphase relationship between both genes was found. The exogenous administration of melatonin (10-7 mol/crab) inhibited the expression of CasMIH by 99.7 and 100% in eyestalk and hepatopancreas, respectively, whereas CasEcR1 was inhibited by 77% and 99%, in the eyestalk and hepatopancreas, respectively, compared to saline-treated animals. The presence of melatonin in the hemolymph is a reliable indicator that the animal synthesizes the hormone, and thus melatonin may influence the molt cycle since it inhibited the expression of molt-related genes. Therefore, the relevance of understanding the oscillation of hormones that are not classically involved in the molt cycle - essential for crustacean growth - but which can regulate the process, becomes evident. From an economic standpoint, melatonin may be a useful tool in culturing blue crab, which ultimately can shorten the intermolt stage period leading to an early ecdysis