A produção de proteínas terapêuticas recombinantes compreende moléculas complexas e de alto valor agregado, incluindo a enzima glucocerebrosidase (GCase). Sua deficiência resulta na Doença de Gaucher, passível de tratamento por meio da terapia de reposição enzimática. A forma ativa da GCase recombinante usada na terapia apresenta resíduos terminais de manose expostos no seu perfil de glicosilação. Perfil este que espera-se ser reproduzido por meio da construção de uma linhagem de Pichia pastoris com um padrão de glicosilação humanizado, por meio da deleção de dois genes envolvidos no sistema de glicosilação da levedura: alg3 e och1, responsáveis pela posterior hiper-manosilação característica desse organismo. Assim, a expressão da GCase será usada como modelo no desenvolvimento desta linhagem de Pichia pastoris que permita a expressão de glicoproteínas com um perfil humanizado específico de glicosilação. Além da produção da linhagem mutante pela técnica de CRISPR/Cas9, propomos a construção de duas linhagens controle: uma expressando a proteína GCase para análise do seu padrão selvagem de glicosilação em P. pastoris e outra expressando a proteína Cas9 de Streptoccocus pyogenes (SpCas9). A linhagem P. pastoris/GCase foi construída testando-se duas sequências sinal de secreção diferentes: fosfatase alcalina (PHO1) e albumina humana (Alb). Resultados de western blot mostraram a GCase no lisado celular e baixos níveis de proteína secretada no sobrenadante de cultura, sendo mais expresso na linhagem contendo a sequência PHO1. A linhagem P. pastoris/SpCas9 foi construída e a enzima SpCas9 foi detectada via western blot no lisado celular após indução com metanol. Para a produção da linhagem com padrão de glicosilação humanizado propôs-se a deleção dos genes alg3 e och1 e a inserção, pela via de reparo por recombinação homóloga (HDR), de marcas de resistência aos antibióticos higromicina ou canamicina. Para tal, propusemos a construção de dois vetores finais de expressão do sistema CRISPR/Cas9 em P. pastoris, cada um contendo a enzima SpCas9 e os RNAs guia (gRNAs) para deleção do gene alg3 ou och1, e também a construção de dois fragmentos para HDR contendo o gene de resistência ao antibiótico flanqueado por regiões de 1Kb de homologia com a região de deleção do gene alg3 ou och1. A construção dos vetores e fragmentos para HDR foram inicialmente feitas por meio de técnicas de clonagem clássica. No entanto, apesar de inúmeras tentativas, resultados de PCR e sequenciamento mostraram o insucesso das construções. Partiu-se então para a técnica de Gibson Assembly®, através da qual os dois fragmentos para HDR foram construídos. Porém, os vetores de expressão contendo SpCas9 e os gRNAs ainda apresentam dificuldades na sua construção. Esforços ainda estão sendo feitos para a construção dos vetores e consequente tentativa de estabelecimento das linhagens mutantes. O sucesso no estabelecimento de um sistema de expressão de proteínas heterólogas com este padrão de glicosilação humano específico permitirá a obtenção e possível comercialização da GCase em sua forma terapêutica. Além disso, permitirá possíveis edições genômicas futuras para um padrão de maior complexidade de glicosilação humanizado, criando uma plataforma nacional para produção de outras glicoproteínas terapêuticas de interesse biotecnológico. / The production of therapeutic recombinant protein comprises complex and high valued molecules, including the glucocerebrosidase enzyme (GCase). Its deficiency results in Gaucher Disease, susceptible of treatment by enzymatic replacement therapy. The active form of recombinant GCase employed in therapy presents exposed terminal mannose residues in its glycosylation pattern. We hope to reproduce such pattern by constructing a Pichia pastoris strain with a specific human glycosylation pattern through the deletion of two genes involved in yeast glycosylation system, alg3 and och1, responsible for the final hyper-mannosylation characteristic of this organism. Therefore, the expression of GCase will be a case model for the development of the recombinant Pichia pastoris strain that could allow the expression of glycoproteins with a specific humanized glycosylation profile. Despite the establishment of the mutant strain using the CRISPR/Cas9 technique, we propose the construction of two control strains: one expressing the GCase protein for analysis of its wild type glycosylation pattern and another one expressing the Cas9 protein from Streptoccocus pyogenes (SpCas9). The P. pastoris/GCase strain was constructed testing two different secretion signal sequences: alkaline fosfatase (PHO1) and human albumin (Alb). Western blot results have shown GCase in cell lysate and in low expression levels in culture supernatant, being more expressed in the strain containing the PHO1 signal sequence. P. pastoris/SpCas9 strain was constructed and SpCas9 enzyme was detected via western blot in cell lysate after the induction with methanol. To produce the strain with the humanized glycosylation pattern, the deletion of alg3 and och1 genes was proposed along with the insertion, by homology directed repair pathway (HDR), of hygromycin and kanamycin antibiotics resistance marks. In order to do so, we have proposed the construction of two final expression vectors of the CRISPR/Cas9 system in P. pastoris, each one containing SpCas9 enzyme and the guide RNAs (gRNAs) for deletion of alg3 or och1, and also the construction of two fragments for HDR containing the antibiotics resistance gene flanked by 1Kb regions of homology with the deleted regions of alg3 or och1. Vectors and HDR fragments constructions were initially performed using classic cloning techniques. However, despite numerous tries, PCR and sequencing results have shown the failure of the constructions. Then, we moved on to the Gibson Assembly® technique, through which the two HDR fragments were built. Still, the expression vectors containing SpCas9 and the gRNAs presented difficulties in its assembly. Efforts continue to be made to successfully construct the remaining vectors and to establish the mutant lineage. Success in the establishment of a heterologous protein expression system with specific human glycosylation pattern will allow the obtainment and possible commercialization of the therapeutic form of GCase. Furthermore, it will also allow possible future genomic editing to a high complexity human glycosylation pattern, creating a national platform for the production of other therapeutic glycoproteins of biotechnological interest.

A produção de proteínas terapêuticas recombinantes compreende moléculas complexas e de alto valor agregado, incluindo a enzima glucocerebrosidase (GCase). Sua deficiência resulta na Doença de Gaucher, passível de tratamento por meio da terapia de reposição enzimática. A forma ativa da GCase recombinante usada na terapia apresenta resíduos terminais de manose expostos no seu perfil de glicosilação. Perfil este que espera-se ser reproduzido por meio da construção de uma linhagem de Pichia pastoris com um padrão de glicosilação humanizado, por meio da deleção de dois genes envolvidos no sistema de glicosilação da levedura: alg3 e och1, responsáveis pela posterior hiper-manosilação característica desse organismo. Assim, a expressão da GCase será usada como modelo no desenvolvimento desta linhagem de Pichia pastoris que permita a expressão de glicoproteínas com um perfil humanizado específico de glicosilação. Além da produção da linhagem mutante pela técnica de CRISPR/Cas9, propomos a construção de duas linhagens controle: uma expressando a proteína GCase para análise do seu padrão selvagem de glicosilação em P. pastoris e outra expressando a proteína Cas9 de Streptoccocus pyogenes (SpCas9). A linhagem P. pastoris/GCase foi construída testando-se duas sequências sinal de secreção diferentes: fosfatase alcalina (PHO1) e albumina humana (Alb). Resultados de western blot mostraram a GCase no lisado celular e baixos níveis de proteína secretada no sobrenadante de cultura, sendo mais expresso na linhagem contendo a sequência PHO1. A linhagem P. pastoris/SpCas9 foi construída e a enzima SpCas9 foi detectada via western blot no lisado celular após indução com metanol. Para a produção da linhagem com padrão de glicosilação humanizado propôs-se a deleção dos genes alg3 e och1 e a inserção, pela via de reparo por recombinação homóloga (HDR), de marcas de resistência aos antibióticos higromicina ou canamicina. Para tal, propusemos a construção de dois vetores finais de expressão do sistema CRISPR/Cas9 em P. pastoris, cada um contendo a enzima SpCas9 e os RNAs guia (gRNAs) para deleção do gene alg3 ou och1, e também a construção de dois fragmentos para HDR contendo o gene de resistência ao antibiótico flanqueado por regiões de 1Kb de homologia com a região de deleção do gene alg3 ou och1. A construção dos vetores e fragmentos para HDR foram inicialmente feitas por meio de técnicas de clonagem clássica. No entanto, apesar de inúmeras tentativas, resultados de PCR e sequenciamento mostraram o insucesso das construções. Partiu-se então para a técnica de Gibson Assembly®, através da qual os dois fragmentos para HDR foram construídos. Porém, os vetores de expressão contendo SpCas9 e os gRNAs ainda apresentam dificuldades na sua construção. Esforços ainda estão sendo feitos para a construção dos vetores e consequente tentativa de estabelecimento das linhagens mutantes. O sucesso no estabelecimento de um sistema de expressão de proteínas heterólogas com este padrão de glicosilação humano específico permitirá a obtenção e possível comercialização da GCase em sua forma terapêutica. Além disso, permitirá possíveis edições genômicas futuras para um padrão de maior complexidade de glicosilação humanizado, criando uma plataforma nacional para produção de outras glicoproteínas terapêuticas de interesse biotecnológico. / The production of therapeutic recombinant protein comprises complex and high valued molecules, including the glucocerebrosidase enzyme (GCase). Its deficiency results in Gaucher Disease, susceptible of treatment by enzymatic replacement therapy. The active form of recombinant GCase employed in therapy presents exposed terminal mannose residues in its glycosylation pattern. We hope to reproduce such pattern by constructing a Pichia pastoris strain with a specific human glycosylation pattern through the deletion of two genes involved in yeast glycosylation system, alg3 and och1, responsible for the final hyper-mannosylation characteristic of this organism. Therefore, the expression of GCase will be a case model for the development of the recombinant Pichia pastoris strain that could allow the expression of glycoproteins with a specific humanized glycosylation profile. Despite the establishment of the mutant strain using the CRISPR/Cas9 technique, we propose the construction of two control strains: one expressing the GCase protein for analysis of its wild type glycosylation pattern and another one expressing the Cas9 protein from Streptoccocus pyogenes (SpCas9). The P. pastoris/GCase strain was constructed testing two different secretion signal sequences: alkaline fosfatase (PHO1) and human albumin (Alb). Western blot results have shown GCase in cell lysate and in low expression levels in culture supernatant, being more expressed in the strain containing the PHO1 signal sequence. P. pastoris/SpCas9 strain was constructed and SpCas9 enzyme was detected via western blot in cell lysate after the induction with methanol. To produce the strain with the humanized glycosylation pattern, the deletion of alg3 and och1 genes was proposed along with the insertion, by homology directed repair pathway (HDR), of hygromycin and kanamycin antibiotics resistance marks. In order to do so, we have proposed the construction of two final expression vectors of the CRISPR/Cas9 system in P. pastoris, each one containing SpCas9 enzyme and the guide RNAs (gRNAs) for deletion of alg3 or och1, and also the construction of two fragments for HDR containing the antibiotics resistance gene flanked by 1Kb regions of homology with the deleted regions of alg3 or och1. Vectors and HDR fragments constructions were initially performed using classic cloning techniques. However, despite numerous tries, PCR and sequencing results have shown the failure of the constructions. Then, we moved on to the Gibson Assembly® technique, through which the two HDR fragments were built. Still, the expression vectors containing SpCas9 and the gRNAs presented difficulties in its assembly. Efforts continue to be made to successfully construct the remaining vectors and to establish the mutant lineage. Success in the establishment of a heterologous protein expression system with specific human glycosylation pattern will allow the obtainment and possible commercialization of the therapeutic form of GCase. Furthermore, it will also allow possible future genomic editing to a high complexity human glycosylation pattern, creating a national platform for the production of other therapeutic glycoproteins of biotechnological interest.

A perda auditiva hereditária é uma característica com grande heterogeneidade genética. Mais de uma centena de genes já foram relacionados com a audição e, com o advento do sequenciamento massivo em paralelo, novas variantes têm sido identificadas como candidatas a causar surdez hereditária. Porém, estudos funcionais para verificação do efeito das mutações candidatas são necessários. Modelos animais permitem estudos funcionais eficientes para confirmação do efeito de mutações em genes candidatos, sendo uma ferramenta poderosa para compreender melhor os efeitos genéticos, moleculares, fisiológicos e comportamentais destas alterações. Previamente, foi identificada em nosso laboratório uma mutação de sentido trocado em um gene que codifica um coativador nuclear como principal candidata a causar surdez hereditária em uma família de São Paulo. A função principal deste gene é regular positivamente a transcrição gênica mediada por receptores nucleares. Contudo, não há dados na literatura sobre a expressão e o papel deste gene no sistema auditivo. Desta forma, tivemos como objetivo principal investigar a expressão do gene candidato em sistemas mecanossensoriais de camundongo e zebrafish. Detectamos, por meio de RT-PCR, a expressão do RNAm na cóclea inteira e no órgão de Corti associado à estria vascular de camundongos com idades P4, P10 e P16. Posteriormente, experimentos de qRT-PCR mostraram maior expressão nos estágios P10 e P16, em relação ao estágio P4, com parcela significativa da expressão gênica concentrada no órgão de Corti associado à estria vascular. Com relação à proteína, foi detectada, por meio de ensaios de imunofluorescência, a sua expressão nos cortes histológicos de cóclea de camundongos P4, P10 e P14, em várias estruturas diferentes da cóclea: membrana basilar, membrana de Reissner, órgão de Corti, estria vascular, limbo espiral e gânglio espiral. Experimentos de hibridação in situ em zebrafish inteiro foram realizados e a expressão do RNAm foi observada na orelha interna de larvas com idade 3 e 5 dias pós-fertilização (dpf) e de juvenis com 5 e 7 semanas pós-fertilização (spf). Nossos experimentos forneceram dados inéditos que sugerem um papel conservado deste gene no desenvolvimento do sistema auditivo de camundongos e no desenvolvimento e fisiologia do sistema auditivo de zebrafish. Para investigarmos se a falta de expressão do gene afeta o sistema auditivo realizamos experimentos visando à edição gênica do gene candidato por meio do sistema CRISPR/Cas9 em zebrafish. Dada a dificuldade para a padronização da técnica, não obtivemos resultados conclusivos durante o período de estudo. Nosso trabalho mostrou pela primeira vez a expressão do RNAm e da proteína no sistema auditivo de modelos animais, o que é fundamental para reforçar o potencial papel da mutação na surdez hereditária identificada na família. Desta maneira, contribuímos para a delineação de futuros experimentos funcionais que elucidem o papel deste gene e da mutação correspondente no desenvolvimento e na fisiologia do sistema auditivo / Hereditary hearing loss is a characteristic with high genetic heterogeneity. More than one hundred genes have been related to hearing and, with the advent of massive parallel sequencing, new variants have been identified as candidates for causing hereditary deafness. However, functional studies to verify the effect of candidate mutations are necessary. Animal models provide efficient functional studies to confirm the effect of mutations and candidate genes, being a powerful tool to understanding the genetic, molecular, physiological and behavioural effects of these genetic variants. Previously, a missense mutation in a gene coding a nuclear receptor coactivator has been identified in our laboratory as the main candidate for causing hereditary hearing loss in a family from São Paulo. The main function of this gene is to positively regulate gene transcription mediated by nuclear receptors. However, there is no data in the literature about its expression or about its function in the hearing system. Thus, we aimed to investigate its expression in mechanosensory systems of mice and zebrafish. Through RT-CPR, we have detected expression of the mRNA in whole cochlea and in organ of Corti associated to stria vascularis of P4, P10 and P16 mice. In addition, qRT-PCR revealed higher expression in P10 and P16 stages, compared to P4 stage, and that a significant fraction of the expression is concentrated in the organ of Corti associated to stria vascularis. Regarding the protein, immunofluorescence assays revealed expression of the coactivator in histological sections of P4, P10 and P14 mice cochlea, with fluorescencent signals in several structures: basilar mebrane, Reissner\'s membrane, organ of Corti, stria vascularis, spiral limbus and spiral ganglion. Whole-mount in situ hybridization assays were conducted in zebrafish, revealing the mRNA expression in the inner ear of 3 and 5 days-post-fertilization (dpf) larvae and of 5 and 7 weeks-post-fertilization (wpf) juveniles. Our experiments provided unprecedented data suggesting a conserved role of this gene in the development of the auditory system of mice and in the development and physiology of the auditory system of zebrafish. In order to investigate if the lack of the gene expression affects the auditory system, we performed experiments aiming genetic edition through CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Given the difficulty to standardize the technique, we could not obtain conclusive results during the study period. Our work has shown for the first time the expression of the candidate gene mRNA and protein in the auditory in animal models, which is fundamental to reinforce the potential role of the mutation in the hearing loss identified in the family. Thus, we have contributed to the delineation of future functional experiments that will unveil the role of the gene and its corresponding mutation in the development and physiology of the auditory system

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-01-08T14:33:50Z No. of bitstreams: 1 gustavotorresdesouza.pdf: 5085443 bytes, checksum: eada917698a8738ea1947743e940692c (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-01-23T11:05:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gustavotorresdesouza.pdf: 5085443 bytes, checksum: eada917698a8738ea1947743e940692c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-23T11:05:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gustavotorresdesouza.pdf: 5085443 bytes, checksum: eada917698a8738ea1947743e940692c (MD5) Previous issue date: 2017-08-08 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O advento sistema CRISPR/Cas9 tornou o processo de edição gênica consideravelmente mais fácil e direto, uma vez que retirou empecilhos técnicos relacionados aos sistemas já disponíveis. Desta forma, foram permitidos diversos avanços no entendimento da função de elementos genômicos, assim como a produção de embriões geneticamente modificados com diversas finalidades. O atual trabalho objetivou a edição gênica no gene da beta-lactoglobulina em células somáticas bovinas objetivando a produção futura de embriões da espécie geneticamente modificados. Considerando-se que a hipersensibilidade a essa proteína responde pela maior parte das alergias ao leite bovino, a produção de animais cujo leite não contenha essa molécula é de grande interesse para a indústria de laticínios. Durante os experimentos, foi possível obter uma linhagem de células bovinas MDBK expressando a enzima Cas9 (MDBK-Cas). Usando células MDBK e as células MBDK-Cas foi possível se obter com sucesso edições gênicas no locus beta-lactoglobulina utilizando-se os componentes do sistema CRISPR/Cas9 na forma de mRNA da proteína Cas9 e sgRNAs. Conclui-se que o sistema CRISPR/Cas9 pode ser usado com os sgRNA desenhados neste estudo para editar o gene da betalactoglobulina em células MDBK. Assim, células MDBK podem ser utilizadas como alvo o locus em estudo. Modelos de estudos para edição do genoma bovino. Em vista da escassa literatura constando de trabalhos em que tenha sido feita a edição gênica em embriões bovinos, os dados gerados por esse trabalho colaborarão para o avanço do estado da arte no que diz respeito a engenharia gênica de bovinos e no conhecimento do funcionamento do sistema CRISPR/Cas9. / The advent of the CRISPR / Cas9 system made the process of gene editing considerably easier and more straightforward, since it removed technical impediments related to the systems already available. In this way, several advances were made in the understanding of the function of genomic elements, as well as the production of genetically modified embryos for various purposes. The present work aimed at the genetic editing of the beta-lactoglobulin gene in bovine somatic cells aiming at the future production of genetically modified embryos of the species. Considering that hypersensitivity to this protein accounts for most of the allergies to bovine milk, the production of animals whose milk does not contain this molecule is of great interest to the dairy industry. During the experiments, it was possible to obtain a lineage of bovine MDBK cells expressing the Cas9 enzyme (MDBK-Cas). Using MDBK cells and MBDKCas cells it was possible to successfully obtain gene editions at the beta-lactoglobulin locus using the components of the CRISPR / Cas9 system as mRNA of the Cas9 protein and sgRNAs. It is concluded that the CRISPR / Cas9 system can be used with the sgRNAs designed in this study to edit the beta-lactoglobulin gene in MDBK cells. Thus, MDBK cells can be targeted as the locus under study. Models of studies for editing the bovine genome. In view of the scarce literature consisting of studies in which bovine embryos have been genetically engineered, the data generated by this work will contribute to the advancement of the state of the art regarding the genetic engineering of cattle and the knowledge of the functioning of the system CRISPR / Cas9.