Chez l’homme, des données cliniques décrivent une association entre des pathologies hépatiques et des désordres de la fertilité masculine. Plusieurs modèles expérimentaux de cholestase ont permis de confirmer ce lien et de souligner un impact sur la physiologie testiculaire. De manière intéressante, une telle corrélation existe aussi bien à l’âge adulte que dans des modèles animaux en période pré-pubertaire. Pour autant, le lien moléculaire pouvant expliquer cette association physiopathologique n’a pas été exploré. L’ensemble des hépatopathies a pour dénominateur commun une augmentation des taux plasmatiques d’acides biliaires et ce dès les stades les plus précoces de la maladie. Dans ce contexte, l’hypothèse de l’impact délétère des acides biliaires sur la fonction reproductrice reste à définir. Notre projet de recherche s’articule autour de l’analyse d’un modèle murin d’atteinte hépatique induite par un régime supplémenté en acide cholique. Nos résultats principaux montrent que : 1) lors d’une exposition pubertaire, l’activation supra-physiologique des signalisations Fxrα conduit à un défaut de maturation sexuelle associé à une altération de la fonction endocrine du testicule ; 2) dans un contexte d’exposition à l’âge adulte, l’activation excessive du récepteur membranaire Tgr5 par les acides biliaires est associées à une hypofertilité. Celle-ci s’accompagne d’une altération de la spermatogenèse consécutive à un détachement progressif de l’épithélium séminifère et à une apoptose spécifique des spermatides ; 3) enfin, nos conclusions démontrent pour la première fois l’impact transgénérationnel de l’exposition aux acides biliaires. Sur deux générations successives, les descendants des mâles adultes nourris par un régime supplémenté en acide cholique présentent des anomalies développementales et métaboliques. Dépendantes de l’action de Tgr5, ces dernières sont attribuées à des altérations de l’épigénome des spermatozoïdes issus des mâles exposés aux acides biliaires. En conclusion, nos données démontrent que, dans des conditions cholestatiques, les acides biliaires altèrent les fonctions de reproduction notamment par leurs impacts sur les fonctions testiculaires. Au regard du nombre croissant de personnes souffrant de troubles hépatiques, ces effets délétères des acides biliaires pourraient contribuer à l’augmentation de l’incidence de l’infertilité masculine. Des molécules agonistes des signalisations FXRα et TGR5 sont aujourd’hui envisagées dans le cadre du traitement de pathologies courantes de notre société. Dans ce contexte, notre étude permettra d’alerter les instances sanitaires quant aux conséquences de l’accès à de tels traitements sur la fertilité et la santé des générations futures. / Clinical data describe an association between liver diseases and disorders of male fertility. Several experimental models of cholestasis have confirmed this link and highlight an impact on testicular physiology. Interestingly, such correlation exists in adult as well as in during pre-pubertal animals. However, the molecular links have not been explored yet. The increase of plasma bile acids levels is a common feature of liver diseases. In this context, the hypothesis of the deleterious impact of bile acids on reproductive function remains to be defined. For that purpose, we used a mouse model of liver injury induced by a diet supplemented with cholic acid. Main results show that: 1) supra-physiological activation of Fxra, during pubertal period, alters endocrine function of the testis and then sexual maturation. 2) during adult age excessive activation of membrane receptor TGR5 by bile acids leads to subfertility. This is associated with impaired spermatogenesis due to a detachment of the seminiferous epithelium and specific apoptosis of spermatids. 3) Finally, we show for the first time the transgenerational impact of bile acid exposure. Two generations of progenies from males exposed to bile acid-diet show developmental and metabolic abnormalities. These effects, mediated by TGR5, are correlated with alterations of the spermatozoa epigenome. In conclusion, our data demonstrate that bile acids affect reproductive functions with impacts on testicular functions. In line with the increasing number of people with liver diseases, the deleterious effects of bile acids may contribute to the incidence of male infertility. Interestingly, agonists of FXRα and TGR5 are now considered in the treatment of several diseases. In this context, our study might alert health authorities regarding the potential consequences of these treatments on fertility and health futures generations.

Durant ma thèse, j’ai étudié l’implication d’un variant du récepteur aux œstrogènes α, ERα36, dans l’initiation et la progression du cancer du sein. Au laboratoire, son expression dans les cancers testiculaires avait été montrée comme étant inductrice de la prolifération cellulaire in vitro et in vivo après une exposition à un mélange de polluants environnementaux, considérés comme perturbateurs endocriniens oestrogéno-mimétique : les alkylphénols. Une analyse rétrospective d’échantillons de tumeurs mammaires a montré, par la modélisation de réseaux d’interactions géniques, que l’expression d’ERα36 était corrélée avec l’expression de marqueurs de migration cellulaire, caractéristiques de la progression tumorale. La surexpression d’ERα36 par transfection in vitro et dans un modèle unique de souris Knocked In exprimant ERalpha36 dans la glande mammaire ont montré qu’ERα36 est suffisant pour altérer le phénotype épithélial des cellules mammaires saines. Une exposition aux alkylphénols qui stimulent son expression endogène accentue les altérations cellulaires observées et contribue à l’acquisition transgénérationnelle de propriétés relatives à une transformation tumorale. Les analyses de ce projet pluridisciplinaire se sont appuyées sur des expertises biologiques, mathématiques et bioinformatiques et ont permis de mettre en évidence pour la première fois le rôle potentiel d’ERα36 dans l’initiation tumorale et de confirmer son implication dans la progression du cancer du sein. Enfin, nous avons montré que l’exposition à des doses environnementales d’alkylphénols lors de la période de périnatalité peut conduire à une modification transgénérationnelle de la différenciation de la glande mammaire sous le contrôle d’ERα36 et ainsi augmenter le risque de cancer mammaire / This work was dedicated to study how a variant of estrogen receptor α, ERα36, acts in initiation and progression of breast cancer. In the laboratory, his expression in testicular cancer was shown to stimulate cell proliferation in vitro and in vivo after environmental pollutant exposure. The compounds studied, the alkylphenols, are endocrine disruptors, interfering with normal estrogen signaling. Gene interaction network modelling from retrospective analysis of breast cancer samples showed that ERα36 expression was correlated with the expression of cell migration markers, typical of tumor progression. In vitro ERα36 overexpression and in a unique mouse Knocked In model, expressing ERα36 in the mammary gland, showed that ERα36 is sufficient to alter epithelial phenotype of normal breast cells. Alkylphenols exposure, that stimulated ERα36 endogenous expression, increased cellular alterations and contributed to transgenerational acquisition of properties related to neoplastic transformation. Analysis of this multidisciplinary project were based on biological expertise, mathematics and bioinformatic tools. These results enabled to highlight for the first time the potential role of ERα36 in tumor initiation and confirmed his involvement in breast cancer progression. Finally, we showed that exposure to environmental doses of alkylphenols during the perinatal period can lead to transgenerational modification of mammary gland differentiation under ERα36 control and eventually may increase breast cancer risk

Afin de protéger durablement les écosystèmes face aux rejets planifiés ou accidentels de radionucléides dans l’environnement, il est essentiel d’évaluer l’impact de l’exposition des organismes aux radiations ionisantes sur le long terme, à l’échelle de plusieurs générations. Dans ce contexte, ce travail de doctorat vise à améliorer la caractérisation des processus moléculaires et la prédiction des effets transgénérationnels lors d’une exposition aux radiations gamma. Une approche expérimentale concerne l’étude des modifications épigénétiques radio-induites, c’est-à-dire des modifications des mécanismes régulant l’activité des gènes sans modification de la séquence d’ADN elle-même et de leur transmission au fil des générations. Cette étude a permis de mettre en évidence que certaines modifications de la méthylation de l’ADN, l’un des mécanismes épigénétiques les plus étudiés, peuvent être transmises par la lignée germinale aux les générations non-exposées (génération F3) suite à une exposition parentale (génération F0) externe aux radiations gamma (6,5 µGy.h-1 et 41,3 mGy.h-1) pendant 25 jours. Dans une seconde approche, un modèle mécaniste DEBtox (Budget Energétique Dynamique appliqué à la toxicologie) est modifié pour permettre l’analyse des effets des radiations gamma sur la croissance et la reproduction de D. magna à l’échelle de plusieurs générations. Pour ce faire, on utilise des compartiments de dommage, dont le niveau peut être hérité d’une génération à la suivante. Le modèle est ajusté aux données avec des méthodes d’inférence bayésienne afin d’estimer les paramètres tout en tenant compte des incertitudes qui leur sont associées. / In order to durably protect ecosystems facing planned or accidental releases of radionuclides, the long-term impact of organism exposure to ionizing radiation must be studied on a multigenerational scale. The aim of this PhD is to improve the characterization of molecular processes and the prediction of transgenerational effects during a gamma irradiation. First, an experimental approach investigated on radio-induced modifications of epigenetic processes, i.e. changes in mechanisms that regulate gene expression without changing DNA sequence itself and on the transmission of these modifications to subsequent generations. Significant changes in DNA methylation, a well-studied epigenetic mechanism, detected in generation F3 clearly showed that epigenetic modifications could be transmitted to unexposed generations, in response to the exposure of a parental generation (F0) to external gamma radiation (6.5 µGy.h-1 et 41.3 mGy.h-1) for 25 days. Second, a mechanistic modelling approach used a modified version of the DEBtox model (Dynamic Energy Budget model applied to toxicology) in order to analyze effects of gamma radiation on D. magna growth and reproduction over several generations. To that end, damage compartments, with damage levels that were transmitted from one generation to the next, were included. The model was fitted to data using Bayesian inference methods, in order to estimate the parameters while considering their associated uncertainty.

Les activités anthropiques liées à l'industrie nucléaire contribuent à des rejets continus de radionucléides dans les écosystèmes terrestres et aquatiques. Les travaux réalisés au cours de ce doctorat visent à apporter de nouvelles connaissances relatives aux effets des radiations ionisantes au cours d’une exposition multigénérationnelle de l’invertébré aquatique, Daphnia magna. Une irradiation gamma externe à des débits de doses pertinents du point de vue environnemental a été réalisée sur D. magna pendant trois générations successives. Les résultats mettent en évidence une accumulation et une transmission d’altérations de l’ADN au fil des générations, en parallèle d’une augmentation de la sensibilité des daphnies. Les données d’irradiation gamma et celles d’une étude antérieure de contamination alpha ont été analysées à l’aide du modèle mathématique DEBtox. Le modèle montre que les deux types de rayonnements agissent différemment sur les daphnies au cours des générations. Ce projet de recherche indique clairement qu’à l’avenir il est important d’étudier et de comprendre les effets transgénérationnels des radiations ionisantes à faibles doses. / Anthropogenic activities related to the nuclear industry contribute to continuous discharges of radionuclides into terrestrial and aquatic ecosystems. The aim of this PhD was to bring new knowledge on the effects of ionizing radiation during a multigenerational expose of the aquatic invertebrate, Daphnia magna. An external gamma radiation at environmentally relevant dose rates was performed on D. magna over three successive generations. Results show an accumulation and a transmission of DNA alterations over generations, in parallel of an increase in sensitivity of organisms. Gamma radiation data and those of a previous study of alpha contamination were analyzed using the mathematical model DEBtox. The model shows that the two types of radiation act differently on daphnia over generations. This research clearly indicates the importance of further studying and understanding transgenerational effects induced by low doses radiation in the future.

L'évaluation de l'impact écologique d'une exposition aux rayonnements ionisants est devenue une préoccupation majeure. L'objectif de ce doctorat était d'étudier les effets multigénérationnels d'une irradiation gamma chronique selon une approche intégrée, des traits d'histoire de vie aux mécanismes subcellulaires chez un organisme modèle, le nématode Caenorhabditis elegans. L'étude des effets d'une irradiation gamma chronique sur les traits d'histoire de vie de C. elegans a d'abord été effectuée. Pour cela, trois générations ont été exposées et deux générations ont été placées en environnement « contrôle » après exposition parentale. Puis, différents mécanismes subcellulaires pouvant expliquer les effets observés sur les traits d'histoire de vie ont été par la suite caractérisés. Les résultats obtenus ont mis en évidence que (i) la reproduction était le critère d'effet le plus sensible, (ii) une augmentation de la radiosensibilité était observée sur trois générations exposées et (iii) les effets de la génération parentale étaient transmis aux générations non-exposées. Une augmentation de l'apoptose, une diminution du stock de spermatozoïdes et du nombre de cellules mitotiques semblent expliquer la diminution de la reproduction dans les générations exposées. Seule une diminution du nombre de spermatozoïdes a été observée en parallèle d'une diminution de la reproduction dans les générations placées non exposées. Ce projet de recherche a permis d'apporter des connaissances sur les effets multigénérationnels d'une irradiation gamma et montre l'intérêt d'utiliser une approche intégrée pour mieux comprendre les mécanismes d'action liés à l'action d'un polluant. / The environmental risk assessment of chronic exposure to ionizing has become a major concern. The aim of this PhD was to study the multigenerational effects of chronic gamma radiation in an integrated manner (to the life history traits from the subcellular mechanisms) in a model organism, the nematode Caenorhabditis elegans. First, studying the effects of chronic gamma radiation on the life history traits of C. elegans was performed. For that, three generations have been exposed to different dose rates and two generations have been placed in "control" environment after parental exposure. The second part of this thesis aimed to characterize the different subcellular mechanisms that could explain the observed effects on the life history traits after multigenerational exposure. The results showed that (i) the reproduction was the most sensitive endpoint to gamma radiation, (ii) an increase in radiosensitivity was observed over three exposed generations and (iii) the effects of the parental generation were transmitted to the non-exposed generations. An increase in apoptosis, a reduction in the stock of sperm, and to a lesser extent, a decrease in the number of mitotic cells, could explain the observed decrease in reproduction for the exposed generations. Only a decrease in sperm number was observed in parallel with a reduction in the cumulative number of larvae in the non-exposed generations. This research contributes to our knowledge on the multigenerational effects of gamma irradiation and shows the importance of an integrated approach to better understand the mechanisms of action related to the action of a pollutant and improve the environmental risk assessment.

La présence de taureaux sub-fertiles sur le marché de l’Insémination Animale (IA) influence négativement l’efficacité des élevages. L’évaluation de la fertilité des taureaux, basée sur l’analyse combinée de marqueurs génétiques, morphologiques, cinétiques et métaboliques de la semence, n’est pas suffisante pour identifier les taureaux sub-fertiles avant leur entrée en production. Cela suggère l’implication d’autres facteurs, notamment d’origines épigénétiques. Parmi les marques épigénétiques, la méthylation de l’ADN tient une place essentielle : son remaniement est en effet indispensable aux processus fondamentaux que sont la différenciation des cellules germinales, la spermatogénèse et le développement embryonnaire précoce. Alors que chez l’Homme, de nombreuses études ont montré que des altérations des profils de méthylation spermatiques sont associées à la sub-fertilité, très peu de données existent chez le bovin. L’objectif de ce travail de thèse est la caractérisation du méthylome de la semence bovine et l’identification de nouveaux marqueurs fiables de la fertilité mâle à un stade précoce. Cette étude s’inscrit dans un large projet intitulé SeQuaMol (pour « Qualité Moléculaire de la Semence »), mis en place au sein d’un laboratoire commun entre l’INRA et la fédération ALLICE. La caractérisation du méthylome spermatique bovin a été réalisée en utilisant une approche multi-échelle (globale, pangénomique et séquence-spécifique). Les analyses ont permis de révéler l’hypométhylation très marquée du spermatozoïde bovin. L’hypométhylation affecte des gènes importants pour la différenciation de la lignée germinale, les fonctions spermatiques, ainsi que des séquences satellites. L’identification de biomarqueurs de la fertilité a été réalisée en utilisant une approche pangénomique (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS). L’analyse a été effectuée sur une cohorte de 94 taureaux, dont les individus de races Holstein et Montbéliard ont été catégorisés en fonction de l’adéquation entre un indicateur génétique de la fertilité et leur fertilité réelle. Le dispositif inclus également des taureaux de 4 autres races pour obtenir une estimation de la variabilité épigénétique liée à la race. Cette analyse a nécessité l’optimisation et l’automatisation du protocole pour la préparation des banques RRBS à haut-débit, ainsi que la mise au point de l’ensemble de la procédure de traitement bio-informatique et statistique des données. Plusieurs milliers de biomarqueurs de la fertilité ont été identifiés et permettent de prédire de façon robuste le statut de fertilité. De plus, une démarche d’intégration des données de génotype et d’épigénotype a été amorcée, soulignant les interactions potentielles en ces strates d’informations. Enfin, nous avons mis en évidence l’influence de l’âge à la production de semence sur le méthylome. L’ensemble de ces données souligne que les modifications du méthylome spermatique peuvent affecter des gènes impliqués dans les processus précoces et plus tardifs du développement, ainsi que quelques voies du fonctionnement du spermatozoïde. L’ensemble des biomarqueurs identifiés serviront de base à la poursuite du projet SeQuaMol, dont l’aboutissement sera le développement d’outils technologiques et statistiques pouvant être utilisés en routine pour améliorer la prédiction de la fertilité mâle. / The presence of subfertile bulls in the market of Animal Insemination negatively influences the efficacy of breeding farms. The evaluation of bull fertility, based on the combined analysis of genetic, morphological, kinetic and metabolic markers of the semen, is not sufficient to identify subfertile bulls before entering semen production. It suggests the implication of other factors, especially epigenetic ones. Within the epigenetic markers, DNA methylation holds a crucial position: indeed, its reprogramming is indispensable to the fundamental processes that are germinal cell differentiation, spermatogenesis and the embryonic development. Whereas several studies have showed that the alteration of spermatic methylation profiles are associated with subfertility in humans, only a little data exists concerning bovines. The aim of this thesis is the characterization of the methylome of bovine semen and the identification of new reliable markers of male fertility at an early stage. This study is part of a larger project called SeQuaMol (Molecular Quality of Semen) which rely on a common laboratory between INRA and the ALLICE federation. The characterization of the bovine sperm methylome was achieved by using a multiscale approach (global, pangenomic and sequencespecific). The analyses made it possible to observe the hypomethylation of the bovine semen. Hypomethylation affects genes that are crucial for the differentiation of the germline, spermatic functions, and also on satellite sequences.The identification fertility biomarkers was carried out by using a pangenomic approach (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS). The analysis has been performed on a cohort of 94 bulls, including subjects of the Holstein race and Montbeliard race, categorized according to the adequacy between a genetic indicator of fertility and their actual fertility. The process also includes bulls from 4 other breeds in order to obtain an estimate of the genetic variability linked to the breed. This analysis has required the optimization and the automation of the protocol for the high throughput preparation of RRBS libraries, as well as the development of the whole bioinformatic pipeline and data statistics. Several thousands of biomarkers of fertility have been identified, which allow to predict in a robust way the fertility status. Furthermore, a process of integration of genotype and epigenotype data has been started, which underlines the potential interaction between these levels of information. Finally, we have highlighted the influence of the age of semen production on the methylome. Altogether, theses data suggest that modifications of the semen methylome can affect genes that are involved in the process of early and late embryo development, and parts of the functioning of the sperm cell. The biomarkers identified will form a basis for the pursuit of the SeQuaMol project, of which the completion will be the development of technological and statistical tools that may be used routinely to improve male’s fertility prediction.