Orientadora: Mirela Tinucci Costa / Banca: Gervásio Henrique Bechara / Banca: Paulo Cesar Ciarlini / Resumo: A babesiose e a erliquiose canina são doenças comuns em cães, transmitidas pelo vetor Rhipicephalus sanguineus. Os sinais e sintomas dessas doenças não são específicos. A detecção dos parasitos em esfregaços sanguíneos nem sempre é possível e a detecção sorológica pode indicar apenas que o animal teve contato com o agente, mas não necessariamente a doença ativa. Na Colômbia existem poucas pesquisas sobre a epidemiologia e diagnóstico de erliquiose e babesiose em cães, as poucas existentes se basearam na detecção dos hemoparasitas em esfregaços sanguíneos, ou de anticorpos específicos. Sendo assim propos-se este estudo com o objetivo de pesquisar a erliquiose e a babesiose em esfregaços sangüíneos associados a provas sorológicas e moleculares em cães da região centro-oriental de Colômbia. Amostras de sangue e soro de 91 cães, provenientes das cidades de Bogotá (n=21), Villavicencio (n=31) e Bucaramanga (n=39) foram submetidas a pesquisa parasitológica, detecção de anticorpos anti-B. canis e anti-E. canis e detecção molecular de Babesia canis e Ehrlichia canis. Os resultados mostraram que dentre as 91 amostras testadas, 4% e 5% delas apresentaram E. canis e B. canis, respectivamente nas pesquisas parasitológicas dos esfregaços sanguíneos. Nas mesmas amostras, 82% e 51% delas apresentaram anticorpos anti-E. canis e anti-B. canis, respectivamente e, em 40% e 5%, foram detectados os DNA de E. canis e de B. canis, respectivamente. Os amplicons foram confirmados por seqüenciamento e o DNA de E. canis e de B. canis obtidos mostraram similaridade genética de 98% a 99% com amostras de E. canis e de B. canis isoladas em outros países, as árvores filogenéticas dos agentes pesquisados foram / Abstract: Canine babesiosis and ehrlichiosis are common diseases in dogs, and are transmitted by the vector Rhipicephalus sanguineus. The clinical signs of these diseases are not specific. Detection of parasites in blood smears is not always possible and the serological detection could only indicate that the animal has had contact with the agent and not necessarily that the disease is being developed. In Colombia, there are few reports on canine babesiosis and ehrlichiosis's epidemiology and diagnosis, being them based only on the detection of haemoparasites in blood smears and detection of antibodies. The purpose of the present study was to investigate the presence of Ehrlichia sp. and Babesia sp. in blood smears, associated with serological and molecular detection of these parasites in dog blood samples from the middle east region of Colombia. Blood and sera samples from 91 dogs from Bogotá (n=21), Villavicencio (n=31) and Bucaramanga cities (n=39) were submitted to parasitological, serological and molecular detection of B. canis and E. canis. Among the 91 samples tested, 4% and 5% presented E. canis morulae and B. canis piroplasms in blood smears, respectively. Moreover, 82% and 51% of samples presented antibodies anti-E. canis and anti-B. canis, respectively. E. canis and B. canis DNA were detected in 40% and 5% of samples, respectively. The amplicons were confirmed by sequencing and the found DNA from E. canis and B. canis showed a genetic identity of 98% to 99% among samples from E. canis and B. canis isolated from other countries. Finally, phyllogenetic trees were constructed from both agents / Mestre

Orientadora: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Fernando Luiz de Lucca / Banca: Maria Célia Bertolini / Banca: Aramis Augusto Pinto / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Resumo: O presente estudo objetivou clonar e analisar a expressão do gene p28 da amostra Jaboticabal de Ehrlichia canis e avaliar sua utilização no diagnóstico molecular e sorológico da erliquiose canina. A PCR, baseada no gene p28 de E. canis, foi capaz de detectar o DNA de um único parasita entre um bilhão de células. Amostras sangüíneas de cães com suspeita clínica de erliquiose foram testadas pela PCR, baseada no gene p28 e pela nested PCR para detecção do gene 16S rRNA. O fragmento amplificado do gene p28 foi observado em 51,25% (n=41) das 80 amostras examinadas, e todas elas foram positivas para o gene 16S rRNA de E. canis, entretanto, em outros 21,25% (n=17) das amostras apenas o gene 16S rRNA foi detectado. A caracterização molecular do gene p28 mostrou similaridade com outras amostras de E. canis. Para a expressão da proteína recombinante P28, foram testados dois sistemas diferentes com linhagens de Escherichia coli BL21(DE3), BL21 Star(DE3)pLysS, BL21(DE3) pLysS e BL21-CodonPlus(DE3)-RIL. A análise pelo Western-blotting revelou reatividade de várias frações protéicas com anticorpo policlonal anti-E. canis. Porém, quando a membrana foi incubada com anticorpo monoclonal para detecção de moléculas de histidina, não houve reatividade, mostrando a ausência de expressão da proteína P28. / Abstract: The aim of this study was to clone and express the p28 gene of Ehrlichia canis Jaboticabal strain and evaluate its application in molecular and serological diagnosis of canine ehrlichiosis. The p28-based PCR was able to detect E. canis DNA of one parasite among one billion cells. Blood samples from dogs for which a diagnosis of canine ehrlichiosis was suspected were tested by p28-based PCR and by 16S rRNA-based nested PCR. Amplified fragment from p28 gene were observed in 51.25% (n=41) among 80 assayed samples and all of this positive samples were also positives for 16S rRNA gene of E. canis, however in 21.25% (n=17) only 16S rRNA gene was detected. The molecular characterization of p28 gene showed similarity with others strains of E. canis. Expression of P28 recombinant protein was tested with two different systems and in Escherichia coli BL21(DE3), BL21 Star(DE3)pLysS, BL21(DE3) pLysS and BL21-CodonPlus(DE3)-RIL strains. After expression induction, Westernblotting showed reactivity of some protein fractions against anti-E. canis antibodies. However, when samples were incubated with anti-histidine monoclonal antibodies, they did not react, demonstrating non-expression of P28 protein. / Doutor