In-vitro-Koinfektionsstudien mit Toxoplasma gondii und Eimeria tenella in primären Hühnermakrophagen Institut für Parasitologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im Feburar 2020 91 Seiten, 3 Publikationen, 2 eingreichte Manuskripte, 17 Abbildungen, 5 Tabellen, 188 Literaturangaben Schlüsselwörter: Toxoplasma gondii, Eimeria tenella, Koinfektion, Makrophagen, in vitro, Wirt-Parasit-Interaktion, Parasitenwachstum, Wirtsimmunantwort, Cell-imaging Einleitung: Toxoplasma gondii und Eimeria tenella sind intrazelluläre apikomplexe Parasiten, die in Hühnern weit verbreitet sind. Während Infektionen mit dem zoonotischen Erreger T. gondii beim Geflügel im Allgemeinen subklinisch verlaufen, kann E. tenella in Hühnerbeständen schwere Erkrankungen und wirtschaftliche Verluste verursachen. Aufgrund der hohen Seroprävalenz beider Parasiten bei Hühnern sind Koinfektionen wahrscheinlich. Hühnermakrophagen sind wichtig für die Wirtsimmunantwort gegen diese beiden Protozoen. Es ist jedoch wenig über die Wirt-Parasit- sowie Parasit-Parasit-Interaktion in Hühnermakrophagen während einer Koinfektion bekannt. Ziele der Arbeit: Ein geeignetes In-vitro-Koinfektionsmodell für T. gondii- und E. tenella-Infektionen in primären Hühnermakrophagen wurde erstellt und angewendet, um die Makrophagenantwort auf beide Parasitenarten und Koinfektionen zu untersuchen. Tiere, Material und Methoden: Von Monozyten abgeleitete Makrophagen wurden aus Hühnerblut isoliert und aufgereinigt. Eine Koinfektion mit zwei Tachyzoiten des RH-Stammes von T. gondii und zwei Sporozoiten des E. tenella-Houghton-Stammes pro Zelle wurde gleichzeitig oder nacheinander in vitro durchgeführt. Morphologische Veränderungen der Makrophagen und die Parasitenentwicklung wurden mittels Konfokalmikroskopie (CLSM) 2, 6, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach Infektion (hpi) visualisiert. Die Parasitenvermehrung wurde evaluiert, indem die Expression des 529-bp-Fragments von T. gondii und des ITS-1-Genfragments von E. tenella durch qPCR bewertet wurden. Die Makrophagen-Phagozytose wurde durch Exposition gegenüber pH-sensitiven fluoreszierenden Biopartikeln stimuliert und durch ein dreidimensionales Modell unter Verwendung von CLSM und Imaris®-Software 2, 6, 12 und 24 hpi quantifiziert. Weiterhin wurden während der Infektion relevante Zytokine (IL-6, IL-10, IL-12, iNOS, TNF-α und IFN-γ) durch Genexpressionsanalyse 24, 48 und 72 hpi untersucht. Zusätzlich wurden die Zellinvasion durch und das Überleben von T. gondii im Verlauf einer sequentiellen Infektion evaluiert, indem Makrophagen zuvor der Infektion mit E. tenella ausgesetzt waren. Die Motilität invasiver Tachyzoiten wurde innerhalb von 20 hpi durch Live-Cell-Imaging verfolgt. Ergebnisse: Die Makrophagen zeigten eine deutliche immunologische Reaktion und Phagozytoseaktivierung ab 2 hpi. Signifikante Veränderungen der Morphologie mit erhöhter Zellvakuolisierung und -ablösung wurden ab 24 hpi während der Koinfektion beobachtet. Bei zuvor E. tenella-exponierten Makrophagen fiel auf, dass T. gondii bei hoher Motilität über 4 Stunden an der Makrophagenmembran anhaftete, bevor es zu einer Penetration kam. Ab 24 hpi vermehrten sich T. gondii in koinfizierten Makrophagen besser als E. tenella. Eine Koinfektion hemmte die Phagozytoseaktivität von Makrophagen nach 2 hpi erheblich, so dass Biopartikel nicht aufgenommen wurden (12 hpi). Mittels qPCR wurde gezeigt, dass bei sequenzieller Koinfektion 2 hpi circa 4-fach weniger T. gondii überlebten als bei Monoinfektion (P < 0,05). Die Anzahl beider Parasiten nahm während der simultanen Koinfektion zu, aber bei der sequentiellen Koinfektion war die Vermehrung von T. gondii im Vergleich zur Monoinfektion bis 24 hpi auf etwa die Hälfte reduziert. Bis 72 hpi verdoppelte sich die Anzahl von E. tenella, während T. gondii bei Koinfektion in diesem Zeitraum auf dem gleichen Niveau wie 48 hpi blieb. Die mRNA-Expression von iNOS (48 hpi), TNF-α (72 hpi) und von IL-10 (48 hpi und 72 hpi) war während der Koinfektion im Vergleich zur E. tenella Monoinfektion signifikant (P < 0,05) erhöht. Schlussfolgerungen: In dem Koinfektionsmodell wurde eine Interaktion zwischen T. gondii und E. tenella beobachtet. Zusätzlich zu den morphologischen Veränderungen und der Phagozytosehemmung der Makrophagen unterschieden sich die Parasitenvermehrung sowie die Zytokinexpression zwischen Koinfektion und Monoinfektion. E. tenella beeinträchtigt das aktive Eindringen von T. gondii in Wirtszellen, wie dies erfolgt, ist derzeit noch nicht geklärt. / In vitro co-infection studies on Toxoplasma gondii and Eimeria tenella in primary poultry macrophages Institute of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in February 2020 91 pages, 3 publications, 2 submitted manuscripts, 17 figures, 5 tables, 188 references Keywords: Toxoplasma gondii, Eimeria tenella, co-infection, macrophages, in vitro, host-parasite interaction, parasite growth, host immune response, cell imaging. Introduction: Toxoplasma gondii and Eimeria tenella are intracellular apicomplexan parasites that are widely distributed in chicken. Whereas infections with the zoonotic pathogen T. gondii are generally subclinical in poultry, E. tenella may cause severe disease and economical loss in chicken herds. Due to the high seroprevelences with both parasites in chicken, co-infections are likely to exist. Chicken macrophages are essential in the host innate immune response against these two protozoa. However, little is known about the host-parasite and parasite-parasite interaction in chicken macrophages during co-infection. Objectives: A suitable in vitro model for both T. gondii and E. tenella infection in chicken primary macrophages was established and applied to study the course of infection in mono- or co-infection. Animals, materials and methods: Monocyte-derived macrophages were isolated and purified from chicken blood. Co-infection with two T. gondii RH strain tachyzoites and two E. tenella Houghton strain sporozoites per cell were performed simultaneously or sequentially in vitro. Morphologic alterations of macrophages and parasite development were visualized by confocal laser scanning microscopy (CLSM) at 2, 6, 12, 24, 48 and 72 hours post infection (hpi). Parasite growth was evaluated by assessing expression of the 529-bp fragment of T. gondii and ITS-1 gene fragment of E. tenella by qPCR in parallel. Macrophage phagocytosis was stimulated by exposure to pH sensitive fluorescent bioparticles and quantified by a three-dimensional model using CLSM and Imaris® software at 2, 6, 12 and 24 hpi. Furthermore, infection-related cytokines (IL-6, IL-10, IL-12, iNOS, TNF-α and IFN-γ) were evaluated by gene expression analysis at 24, 48, 72 hpi. The course of sequential infection was evaluated to determine cell invasion and survival of T. gondii in macrophages previously exposed to E. tenella sporozoites. Motility of invasive stages was tracked at the early phase of infection (within 20 hpi) by real time life cell imaging. Results：By cell imaging, macrophages displayed distinctly immunologic activation and phagocytosis at 2 hpi and thereafter. Significant changes of morphology with increased cell vacuolation and detachment were observed on 24 hpi during co-infection. T. gondii tachyzoites adhered for more than 4 hours to host cells displaying high motility instead of cell entry during the early sequential co-infection. However, T. gondii showed better replication than E. tenella in co-infected macrophages from 24 hpi onwards. Co-infection caused inhibition of phagocytosis by macrophages and bioparticles were not incorporated into co-infected cells at 12 hpi by CLSM. By qPCR, it was shown that approximately 4-fold less T. gondii survived in sequentially co-infected cultures at 2 hpi as compared to mono-infection (P < 0.05). Replication of both parasites increased during simultaneous co-infection whereas only half numbers of replicated T. gondii was found in sequential co-infection compared to mono-infection at 24 hpi. At the end of the study period (72 hpi), E. tenella multiplication tended to double increase while T. gondii replication was not distinctly altered during co-infection compared to 48 hpi. Expression of mRNA for iNOS at 48 hpi, for TNF-α at 72 hpi and for IL-10 at 48 and 72 hpi was significantly elevated during co-infection compared to mono-infection (P < 0.05). Conclusions：Mutual interaction between T. gondii and E. tenella were observed in the selected co-infection model. Increased macrophage stress may explain vacuolization and phagocytosis inhibition. In addition to morphologic alterations of macrophages, cytokine up/down- regulation differed between co-infected and mono-infected macrophage cultures. It appears that E. tenella, impairs the active penetration of T. gondii into host cells which deserves further study. The established in vitro infection model may serve to investigate host immune response of macrophages to diverse intracellular pathogens that infect chicken.

Der Einzeller Eimeria tenella zählt zu den hochpathogenen Parasiten des Haushuhns und ist Verursacher der Blinddarm-Kokzidiose, eine Erkrankung, die zu hohen ökonomischen Belastungen in der Geflügelindustrie führt. Zur Zeit existiert noch kein Impfstoff, der auf Basis von einzelnen Antigenen wirksam ist. Insbesondere die Identifizierung und Charakterisierung von sekretorischen Proteinen, welche an der Parasit-Wirtszell-Interaktion beteiligt sind, könnte einen Beitrag zur Entwicklung einer Immunprophylaxe darstellen. Ziel dieser Arbeit war es, sekretorische E. tenella-Proteine zu identifizieren und ausgewählte cDNA-Sequenzen in DNA-Immunisierungsstudien zu überprüfen. Um ein DNA-Immunisierungsprotokoll für Hühner zu erarbeiten, wurden die cDNAs von drei schon bekannten E. tenella-Antigenen alleine oder in Fusion zur cDNA des stabilisierenden enhanced green fluorescence protein (EGFP) in zwei unterschiedliche DNA-Immunisierungsvektoren (pCDNA3, pVR1012) kloniert. Die Überprüfung der Serokonversion zeigte, dass nach DNA-Immunisierung von Hühnern mit beiden Vektoren bzw. mit und ohne EGFP-Fusion vergleichbare Immunantworten induziert wurden. D.h. mit dem etablierten DNA-Immunisierungsprotokoll konnte eine Expression heterologer (Eimerien) Gene im Huhn erzielt werden. Um neue sekretorische E. tenella-Proteine zu identifizieren wurden bioinformatische und experimentelle Methoden eingesetzt. Über die bioinformatischen Analysen wurden aus E. tenella-expressed sequence tag (EST)-Datenbanken 54 putativ sekretierte E. tenella-Sequenzen extrahiert für die aufgrund ihrer beschriebenen Funktion und Lokalisierung eine Beteiligung an der Wirts-Parasit-Interaktion abgeleitet wurde. Mittels funktioneller Komplementierung in Hefen konnten aus einer E. tenella-Sporozoiten-cDNA-Bank 25 sekretorische Sequenzen identifiziert werden. Die cDNA-Sequenzen von 13 neu identifizierten sekretorischen Proteinen wurden in DNA-Immunisierungsstudien überprüft. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Methoden geeignet sind, um sekretorische Proteine von E. tenella zu identifizieren. Aufgrund der Erkenntnisse dieser Arbeit, sollten jedoch weitere verbesserte Immunisierungsprotokolle erarbeitet werden, um die immunprotektive Wirkung der isolierten Kandidaten-Antigene von E. tenella in Hühnern zu überprüfen. Wie die vorliegende Arbeit bestätigt, eignet sich die Methode der DNA-Immunisierung vermutlich als Grundlage solcher Verfahren, wobei zukünftig die Induktion der essentiellen intestinalen Immunantwort im Vordergrund stehen sollte. / The protozoan parasite Eimeria tenella is highly pathogenic in chickens and causes caecal coccidosis that contribute to high economic losses in poultry farming. At the moment no vaccine based on a single antigen is available. The identification and characterization of proteins that are involved in host parasite interaction could particularly contribute to the development of immunoprophylactic control strategies. In order to establish a DNA immunisation protocol, cDNA of three already known E. tenella antigens were subcloned alone or in fusion to the stabilising fusion partner enhanced green flurescence protein (EGFP) into two different DNA immunisation vectors (pCDNA3, pVR1012). Following DNA immunisation of chickens using both vectors with or without EGFP fusion, respectively, the induction of comparable immune responses were shown by serum conversion. This implies it was possible to achieve heterologous (Eimeria) gene expression in chickens with the established immunisation protocol. In order to identify new E. tenella secretory proteins bioinformatic and experimental approaches were used. Following bioinformatic analysis 54 putatively secretory E. tenella sequences were identified for which roles in host parasite interaction were surmised, due to their localisation and function. The identification of secreted proteins from a E. tenella sporozoite cDNA library using a functional complementation assay in yeast resulted in 25 unique sequences. The cDNA of 13 newly identified secretory proteins were tested in DNA immunisation studies. The results showed that both methods are capable of identifying secretory proteins of E. tenella. Owing to the results presented here, new immunisation protocols should be established to test the immune protective capacity of candidate antigens of E. tenella in chickens. The present study confirmed the method of DNA immunisation as a basic tool for such new protocols. In future, however, DNA immunisation protocols should focus on the induction of essential intestinal immune responses.

Coccidiosis is a disease caused by protozoa of the genus Eimeria ssp. These protozoa are intracellular parasites of enterocytes that rupture the host cell, causing damage to the intestinal mucosa. The lesions caused by Eimeria reduce nutrient uptake by broilers, affecting their productivity gain, and also represent a portal of entry for other enteropathogens. The aim of this study was to assess the correlation between lesions caused by Eimeria and the prevalence of coccidiosis and other gastrointestinal disorders among broilers reared in Brazil from 2012 to 2014. Intestinal health was evaluated at 82 poultry houses in Brazil, totaling 5,528 birds aged 12 to 40 days. The rearing period was divided into two phases: phase 1 (12 to 21 days) and phase 2 (22 to 40 days). The broilers, at least three per shed, were collected from three different sites. The following gastrointestinal aspects were analyzed in the present study: presence of cell desquamation, excess fluid, excess mucus, ingestion of contaminated litter, thickened intestinal walls, thin intestinal walls, movement of food bolus, abnormal intestinal tonus, Turkish towel appearance, verminosis, and necrotic enteritis. The classification of the scores for gross lesions caused by Eimeria acervulina, Eimeria maxima, and Eimeria tenella followed the method proposed by Johnson & Reid, [8] and the oocyst count of E. maxima (E. maxima micro) in the mucosa was performed under a light microscope at 100X magnification. The statistical analysis of the Pearson correlation coefficient was carried out by the SAS 9.3 software program [16], using a 95% confidence interval. The results of this study revealed that E. acervulina was the most prevalent (mean of 13.5%) species in both rearing stages. Also, there was a positive correlation with thin intestinal walls and abnormal intestinal tonus in phases 1 and 2, as well as a positive correlation with ingestion of contaminated litter in phase 2. The second highest prevalence was that of E. maxima (mean of 6.75%), with a positive correlation with excess mucus, thickened and thin intestinal walls in phase 1, and a positive correlation with cell desquamation, excess fluid, and Turkish towel appearance in phase 2. E. tenella yielded the lowest prevalence rates (mean of 4.35) among the analyzed Eimeria species, showing a positive correlation with excess fluid in phases 1 and 2 and with thickened intestinal walls and lesions caused by E. maxima in phase 2. The microscopic analysis demonstrated that E. maxima was found in 18% of mucosal scrapings in phase 1, which accounts for a subclinical coccidiosis rate of 282.98% compared with clinical coccidiosis. A positive correlation was observed for E. maxima micro between thickened intestinal walls and lesions caused by E. maxima. E. maxima was detected in mucosal scrapings of 29.6% of the broilers in phase 2, accounting for a subclinical coccidiosis rate of 236.37% compared with clinical coccidiosis. E. maxima micro revealed a positive correlation with excess fluid, necrotic enteritis, E. acervulina, E. maxima, and E. tenella in phase 2. The comparison between the rearing periods showed that subclinical coccidiosis affected 64.45% more broilers in phase 2 than in phase 1. In the gross analysis, E. acervulina was the most prevalent species in both rearing periods. A lesion score equal to 1 was the most frequent among all Eimeria species. Subclinical coccidiosis affected a significant number of broilers in the analyzed Brazilian flocks, and was correlated with several factors that reduce intestinal health. It may be concluded that monitoring is of utmost importance to find out the status of intestinal health of poultry. The microscopic detection of E. maxima (mean of 23.8%) is correlated with factors that negatively affect intestinal health. / A coccidiose é uma enfermidade causada por protozoários do gênero Eimeria ssp. Esses são parasitas intracelulares de enterócitos que rompem a célula hospedeira causando lesões na mucosa intestinal. As lesões causadas pelas Eimerias resultam em redução na capacidade de absorção de nutrientes, afetando o ganho produtivo dos frangos de corte, e representam uma porta de entrada para outros enteropatógenos. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi analisar a correlação entre as lesões causadas pelas Eimerias, e a prevalência de coccidiose e de demais alterações encontradas no trato gastrointestinal de frangos de corte produzidos, no Brasil, no período de 2012 a 2014. As avaliações da saúde intestinal foram realizadas em 82 integrações de frangos de corte, no Brasil, totalizando 5.528 aves analisadas com idades entre 12 e 40 dias. O período de produção analisado foi dividido em duas fases: 1ª fase (12 aos 21 dias) e 2ª fase (22 aos 40 dias). Os frangos necropsiados foram coletados em três diferentes pontos e no mínimo três aves por galpão. No presente estudo foram analisadas as seguintes alterações do trato gastrintestinal: presença de descamação celular, excesso de fluido, excesso de muco, ingestão de cama, intestino espesso, intestino fino, passagem de alimento, tônus alterado, toalha turca, verminose e enterite necrótica. A definição dos escores macroscópicos de lesão causados pelas Eimeria acervulina, Eimeria maxima, Eimeria tenella seguiram a metodologia de Johnson & Reid [8], e a contagem de oocistos na mucosa para E. maxima (E. maxima micro) foi realizada com auxílio de microscópio óptico com aumento de 100 X. A análise estatística do coeficiente de correlação de Pearson foi feita com o programa SAS 9.3., com intervalo de confiança de 95%. Os resultados desse estudo demonstraram que a espécie E. acervulina foi a que apresentou maior prevalência (média de 13,5%) em ambas as fases de produção avaliadas. Ainda, referente à E. acervulina, observou-se correlação positiva com intestino fino e tônus intestinal alterado na 1ª e 2ª fase, bem como correlação positiva com ingestão de cama apenas na 2ª fase. A segunda maior prevalência foi da espécie E. maxima (média de 6,75%), obteu-se correlação positiva com excesso de muco, intestino espesso e fino na 1a fase e correlação positiva com descamação celular, excesso de fluído e toalha turca na 2a fase avaliada. A E. tenella representou a menor prevalência (média de 4,35) entre as espécies de Eimerias analisadas, apresentando uma correlação positiva na 1ª e 2ª fase com o excesso de fluído e na 2ª fase com o intestino espesso e com lesões de E. maxima. Na avaliação microscópica, a E. maxima esteve presente em 18% dos raspados de mucosa realizados na 1ª fase, o que representa uma coccidiose subclínica de 282,98% com relação a coccidiose clínica. Para a E. maxima micro foi detectada correlação positiva entre os achados com o intestino espesso e com as lesões de E. maxima. Na 2ª fase, E. maxima foi encontrada nos raspados de mucosa de 29,6% das aves, representando uma coccidiose subclínica de 236,37% com relação à coccidiose clínica. A E. maxima micro apresentou na 2ª fase uma correlação positiva com o excesso de fluido, enterite necrótica, E. acervulina, E. maxima e E. tenella. Na análise comparativa entre os períodos, a coccidiose subclínica acometeu 64,45% mais frangos de corte na 2ª fase em relação a 1ª fase. Na avaliação macroscópia de lesões relacionadas à coccidiose, a E. acervulina foi a espécie de maior prevalência em ambas fases de produção. O escore de lesão mais frequente para todas as espécies de Eimerias foi o de grau 1. A coccidiose subclínica acometeu um número expressivo de frangos de corte do plantel brasileiro e foi correlacionada com diversos fatores de diminuição de saúde intestinal. Concluiu-se que o monitoramento é de suma importância para conhecer o status de saúde intestinal dos lotes avícolas. Pois, a E. maxima microscópica está presente (média de 23,8%) com correlação aos fatores que reduzem a saúde intestinal.

Coccidiosis in chicken causes great economic losses. Increasing resistance of Eimeria species to anticoccidials has forced the search for alternative methods of control. The present study evaluates the anticoccidial activity of some anti-Eimeria tenella antibody fragments expressed in pea plants. Both in vitro and in vivo infection assays including indirect immunofluorescence, in vivo evaluation of antibody neutralization and cell culture invasion-inhibition assays were used to study the inhibitory effect of these antibody fragments on E. tenella sporozoites. Seven of nine antibody fragments (Ab1, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 and Ab9) showed binding to sporozoites of E. tenella in an indirect immunofluorescence test. Only two antibodies (Ab4 and Ab5) cross reacted with sporozoites of E. maxima, E. acervulina and E. brunetti. The localization of specific fluorescence differed between species. Ab binding with sporozoites was seen in the area of both anterior and posterior refractile bodies in case of E. tenella, E. brunetti, and E. maxima but was only observed in the posterior refractile body in case of E. acervulina. No antibody binding was observed on merozoites. The suitability of antibody fragments to alter the infectivity of E. tenella sporozoites to Madin Darby Bovine Kidney cells (MDBK) was examined in vitro and the invasion-inhibition rates were quantified by flow cytometry. To assess the inhibitory effect on parasite reproduction, the in vivo antibody neutralization assay was done by retrograde infection of chicken with sporozoites previously incubated with antibody fragments. In vitro invasion rates were reduced by incubation with antibody fragments by approximately 24 to 45 %, with Ab6 and Ab7 showing the most distinct effect. However, proliferation rates (PR) of the respective MDBK cultures were also clearly reduced by 15 to 26 %. PR of MDBK cells treated with 1:1000, 1:100, 1:10 and undiluted mixed antibody fragments were reduced by 1%, 10%, 16%, and 26% with a reduction of invasion rates by 0%, 9%, 15% and 18%, respectively. Immune sera reduced the invasion rates by 16% to 70% and increased PR of the host cells. It appeared that the preparations of the antibody fragments contained compounds cytotoxic to MDBK cells and thus invasion inhibition could not be unequivocally evaluated in vitro. However, after incubation with antibody fragments sporozoites displayed a reduced ability to reproduce after intracloacal application to chicken (especially Ab1, Ab3, Ab5 and Ab9). Other antibody fragments (Ab2, Ab4, Ab6, Ab7 and Ab8) were less capable to reduce sporozoite infectivity and reproduction. More investigations are still required to study the possible use of antibody fragments and their application to infected chicken exposed to coccidiosis.

Zusammenfassung Einleitung: Eimeria tenella ist ein obligat intrazellulärer Parasit und Erreger der Blinddarmkokzidiose beim Huhn. Aufgrund des verbreiteten Einsatzes von Antikokzidia sind seit langem Resistenzentwicklungen bekannt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind komplex und nicht genau bekannt. Für den Nachweis von Resistenz gilt der Tierversuch als „Goldstandard“, er ist aber aufwändig, zeitraubend und ethisch problematisch. Ziele der Arbeit: Es sollte ein für die Erstellung von Sensitivitätsprofilen und Wirksamkeitsprüfungen geeignetes In-vitro-Modell für E. tenella entwickelt und validiert werden. Weiterhin sollte auf mit Antikokzidiaresistenz assoziierte Änderungen im Proteom von Kokzidien untersucht werden. Material, und Methoden: Monolayer von MDBK (Madin-Darby bovine kidney cells) dienten zur Kultivierung von E. tenella für den in vitro ASA (anticoccidial sensitivity assay). Als Parameter wurden die Inhibition (%ISIA, %IRIA) der Invasion durch Sporozoiten (SIA = sporozoite invasion inhibition assay) und der Erregerreproduktion (RIA = reproduction inhibition assay) mittels quantitativer PCR (qPCR) für E. tenella beurteilt. Die minimale Hemmkonzentration (MIC = minimal inhibitory concentration) wurde anhand einer Referenz (sensitiver Laborstamm Houghton, Ref-1) für Monensin (Mon), Salinomycin (Sal), Maduramicin (Mad), Lasalocid (Las) und Toltrazuril (Tol) bestimmt. Auf dieser Basis wurden ein zweiter Laborstamm (Wisconsin, Ref-2) und vier Feldstämme (T-376, FS-1, FS-2 und FS-3) im SIA und RIA getestet. 1.0 × 105 (SIA) und 5.0 × 104 (RIA) Sporozoiten/Well wurden verwendet. Die in vitro Ergebnisse wurden mit den in vivo Daten verglichen. Alle in vitro Versuche wurden in vier Replikaten durchgeführt. Insgesamt wurden 420 Hühner (1. Lebenstag: LT, Cobb-500) in fünf Tierversuche verwendet, um die Empfindlichkeit der E. tenella-Stämme gegen verschiedene Antikokzidia zu untersuchen. In jedem Tierversuch wurden 84 Tiere (12. LT) in 7 Gruppe (n = 12) eingeteilt. Hühner wurden mit 7,5 × 104 Oozysten je Tier am 14. LT infiziert. Die Wirksamkeitsprüfung für den alternativen Naturstoff Allicin erfolgte mittels RIA am Stamm Ref-1. Kontinuierlich in vitro als Tachyzoiten kultivierte T. gondii des RH-Stammes (Sen-RH) wurden unter ansteigenden Mon-Dosen in HFF-Zellen (human foreskin fibroblasts) über 8 Monate auf Resistenz (MonR-RH) selektiert. Es erfolgte eine stabile Isotopenmarkierung (SILAC). Für E. tenella wurden die sensitivenReferenzstämme ebenso wie die Feldstämme variabler Sensitivität isoabarisch-chemisch markiert (Tandem-Massenmarkierung, TMT). Die quantitativen Proteomanalysen erfolgten mit dem nanoUPLC-MS/MS. Ergebnisse: Für Ref-1 betrugen die MIC95 (MIC für eine 95%ige Inhibition) 0,25 (Mon), 0,5 (Sal), 1,0 (Mad), 0,5 (Las) und 5,0 (Tol) μg/ml. Die in vitro Sensitivitätsprofile für Ref-2, FS-1, FS-2, und FS-3 stimmten für die Ionophoren mit den Ergebnissen des Tierversuchs gut überein, für Tol war das aber nicht der Fall. Signifikante Korrelationen wurden für die %IRIA-Werte mit dem Oozystenindex (OI, r = 0,290-0,507; p < 0,05), dem lesion score (LS, r = 0,279-0,345; p < 0.05, für Ref-1, Ref-2 und FS-1) und der Gewichtszunahme im Tierversuch (WGNNC, r = 0.284-0.419; p < 0.05, für Ref-1 und FS-1) festgestellt. Allicin in einer Konzentration von 1,8 mg/ml ergab einen %IRIA von 99,0%, was einer guten Wirkung entspricht. Mittels SILAC wurden 1820 Proteine identifiziert, von denen 1024 Proteine in mehr als vier biologischen Replikaten quantifizierbar waren. Bei 52 Proteinen wurden signifikante Unterschiede zwischen Sen-RH und MonR-RH festgestellt (p < 0,05). Actin, beta-Tubulin cofactor D, Perforin-like Protein 1 (PLP1), und kleine GTPase-vermittelte Signaltransduktionsproteine (GTPases) wurden in T. gondii MonR-RH hochreguliert (p < 0,05). Insgesamt waren 42 Proteine bei der resistenten Mutante MonR-RH hochreguliert. Für E. tenella wurden 97 Proteine identifiziert und 25 Proteine wurden in allen drei biologischen Replikaten quantifiziert. Mon-resistente E. tenella zeigten signifikant hochreguliertes Actin (p < 0,05). Mikronemenproteine wurden in resistenten Toxoplasma (MIC8) und Eimeria (MIC4) herunter reguliert. Schlussfolgerungen: Das entwickelte In-vitro-Verfahren in Kombination mit der qPCR eignet sich zur Bewertung der Sensitivität von E. tenella gegenüber ionophoren Antikokzidia und erbringt Ergebnisse, die mit dem Tierversuch korrelieren. Das Modell kann Tierversuche zum Screening von Wirkstoffen reduzieren, aber nicht vollständig ersetzen, vor allem, wenn die Wirkung (auch) späte Entwicklungsstadien im Zyklus von E. tenella betrifft. Letzteres könnte die mangelnde Aussagekraft für Tol erklären. In T. gondii lässt sich Resistenz in vitro induzieren. Die Proteom-Analyse zeigte eine Verminderung der Invasion (↑ Actin, ↓ MIC8) und des Austritts (↓ PLP1), und eine Aktivierung der Replikation (↑ Actin, ↑ beta-Tubulin cofactor D, und ↑ GTPases proteine). Mon führt zu einer Erhöhung des intrazellulären Na+ gefolgt von einer Erhöhung der Ca++ Konzentrationen. Die Reduzierung der Expression von Proteinen in MonR-RH, die mit Invasion- und Austrittsaktivitäten zusammenhängen, zeigt an, dass dieser Stamm höhere Konzentrationen von Mon verträgt, indem er die ktitische Schwelle der zytosolischen Ca++ Konzentration erhöht ist, die erforderlich ist, um diese Prozesse zu provozieren.

Coccidiosis in chicken causes great economic losses. Increasing resistance of Eimeria species to anticoccidials has forced the search for alternative methods of control. The present study evaluates the anticoccidial activity of some anti-Eimeria tenella antibody fragments expressed in pea plants. Both in vitro and in vivo infection assays including indirect immunofluorescence, in vivo evaluation of antibody neutralization and cell culture invasion-inhibition assays were used to study the inhibitory effect of these antibody fragments on E. tenella sporozoites. Seven of nine antibody fragments (Ab1, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 and Ab9) showed binding to sporozoites of E. tenella in an indirect immunofluorescence test. Only two antibodies (Ab4 and Ab5) cross reacted with sporozoites of E. maxima, E. acervulina and E. brunetti. The localization of specific fluorescence differed between species. Ab binding with sporozoites was seen in the area of both anterior and posterior refractile bodies in case of E. tenella, E. brunetti, and E. maxima but was only observed in the posterior refractile body in case of E. acervulina. No antibody binding was observed on merozoites. The suitability of antibody fragments to alter the infectivity of E. tenella sporozoites to Madin Darby Bovine Kidney cells (MDBK) was examined in vitro and the invasion-inhibition rates were quantified by flow cytometry. To assess the inhibitory effect on parasite reproduction, the in vivo antibody neutralization assay was done by retrograde infection of chicken with sporozoites previously incubated with antibody fragments. In vitro invasion rates were reduced by incubation with antibody fragments by approximately 24 to 45 %, with Ab6 and Ab7 showing the most distinct effect. However, proliferation rates (PR) of the respective MDBK cultures were also clearly reduced by 15 to 26 %. PR of MDBK cells treated with 1:1000, 1:100, 1:10 and undiluted mixed antibody fragments were reduced by 1%, 10%, 16%, and 26% with a reduction of invasion rates by 0%, 9%, 15% and 18%, respectively. Immune sera reduced the invasion rates by 16% to 70% and increased PR of the host cells. It appeared that the preparations of the antibody fragments contained compounds cytotoxic to MDBK cells and thus invasion inhibition could not be unequivocally evaluated in vitro. However, after incubation with antibody fragments sporozoites displayed a reduced ability to reproduce after intracloacal application to chicken (especially Ab1, Ab3, Ab5 and Ab9). Other antibody fragments (Ab2, Ab4, Ab6, Ab7 and Ab8) were less capable to reduce sporozoite infectivity and reproduction. More investigations are still required to study the possible use of antibody fragments and their application to infected chicken exposed to coccidiosis.