Caenorhabditis elegans es un nematodo de vida libre utilizado como organismo modelo en diferentes disciplinas de la ciencia. Su tamaño reducido, plan corporal anatómicamente simple, ciclo de vida corto y amplio repertorio de comportamientos, lo han transformado en un organismo muy útil en investigación. Además, emerge como un modelo de interés en la industria farmacéutica para realizar ensayos in vivo rápidos y económicos, y para la detección de compuestos con actividad biológica. C. elegans comparte características fisiológicas y farmacológicas con nematodos parásitos y además es sensible a la mayoría de las drogas antiparasitarias que se utilizan en el hombre y en los animales. Dado que es difícil trabajar con nematodos parásitos en el laboratorio, C. elegans ha emergido como un excelente modelo de nematodo parásito y ha contribuido al conocimiento de los mecanismos de acción de diversos fármacos. C. elegans cuenta con la mayor familia de receptores Cys-loop. En sus músculos, posee tres receptores Cys-loop principales: dos receptores nicotínicos (nAChRs), el L-AChR y el N-AChR, y el receptor de GABA, UNC-49. Los nAChRs median la contracción de los músculos de la pared del cuerpo mientras que los receptores de GABA median la relajación muscular, permitiendo el movimiento sinusoidal típico del nematodo. Estos receptores son los blancos moleculares de drogas antihelmínticas. El levamisol, actuando como agonista del L-AChR, genera contracción sostenida de los músculos y finalmente la parálisis espástica del nematodo. La piperazina, actuando como agonista de los receptores de GABA, genera relajación muscular y parálisis flácida. Otros receptores Cys-loop presentes en el nematodo también son blancos de fármacos antihelmínticos. El receptor de glutamato permeable a cloruro (GluCl) presente en neuronas y células musculares es el blanco molecular de la ivermectina (IVM), uno de los antiparasitarios más utilizados a nivel mundial. En cuanto a los receptores Cys-loop, C. elegans no es más diferente a los nematodos parásitos de lo que cada especie individual de parásito lo es de otra. Esto se evidencia en la amplia diversidad de subunidades que generan receptores Cys-loop con diferente composición y propiedades farmacológicas en los nematodos y cuyas bases moleculares no se comprenden completamente. En esta Tesis se utilizó a C. elegans como modelo de nematodo parásito. Se estudiaron las propiedades antihelmínticas y los blancos de acción de diferentes compuestos químicos a través de ensayos de comportamiento. Para determinar sus mecanismos de acción se realizaron registros electrofisiológicos de corrientes unitarias y macroscópicas sobre receptores presentes en células musculares de C. elegans o expresados heterologamente en células de mamífero. En el Capítulo 1 se estudió el befenio, un antihelmíntico colinérgico cuyo modo de acción no se conocía completamente. Mediante ensayos de comportamiento se determinó que befenio genera parálisis espástica en nematodos salvajes adultos jóvenes. Utilizando cepas mutantes se determinó que el L-AChR es el blanco molecular involucrado en la actividad paralizante de befenio. Estos resultados sugieren que no existiría un receptor específico para befenio en los músculos de C. elegans. Cuando befenio fue combinado con levamisol el efecto paralizante fue aditivo. Esto es de importancia ya que la combinación de drogas es una buena estrategia para reducir la resistencia en nematodos parásitos. A nivel molecular, mediante registros de canal único, se determinó que befenio activa el L-AChR de C. elegans tanto en larvas L1 como L2, y a mayores concentraciones, actúa como un bloqueador de canal abierto de dicho receptor. Los estudios de docking molecular mostraron que befenio se une al sitio de unión ortostérico del agonista y forma las interacciones cation-π requeridas para la activación del receptor. Estos resultados podrían explicar la alta eficacia para activar el L-AChR. La selectividad de befenio por el nAChR muscular de mamífero fue estudiada mediante registros de canal único y de corrientes macroscópicas. Se determinó que befenio activa el nAChR pero actúa como un agonista muy débil y un bloqueador de canal potente. Según estudios de docking molecular, befenio generaría las interacciones necesarias para la activación solamente en uno de los dos sitios ortostéricos del receptor. Esto explicaría su baja eficacia en receptores de mamífero con respecto a los receptores de nematodos. Cepas mutantes de C. elegans que carecen de la subunidad LEV-8 podrían contener LAChRs formados por la subunidad ACR-8 en su reemplazo. Estos L-AChRs imitan un receptor de nematodo parásito, como el receptor de H. contortus, cuya subunidad ACR-8 podría mediar la actividad de befenio. Mediante ensayos de comportamiento con la cepa mutante se determinó que la subunidad ACR-8 no es requerida para el efecto paralizante de befenio en C. elegans. A nivel de canal único, los receptores que carecen de la subunidad LEV-8 también fueron activados por befenio y dicha droga, al igual que ACh, indujo una rápida desensibilización del receptor. En el Capítulo 2 se estudiaron tres terpenoides, carvacrol, timol y eugenol, presentes en plantas. Mediante ensayos de comportamiento utilizando nematodos salvajes, se determinó que los terpenoides paralizan rápidamente a C. elegans. El orden de potencia de parálisis fue: carvacrol>timol>eugenol. Las larvas fueron más sensibles que los nematodos adultos jóvenes. Además, los compuestos inhibieron irreversiblemente la eclosión de los huevos con el mismo orden de potencia. Estos hallazgos indican que los terpenoides producen efectos antihelmínticos a corto y largo plazo. Se evaluaron tres combinaciones de drogas: timol/levamisol, timol/piperazina y timol/ivermectina. El efecto paralizante de la combinación timol/levamisol fue sinérgico y dicha combinación también fue efectiva en la inhibición de la eclosión de huevos. Mediante ensayos de comportamiento con nematodos mutantes se determinó que los L-AChRs y los receptores de GABA son los blancos moleculares de los terpenoides. Los registros de corrientes macroscópicas revelaron que los compuestos no son capaces de activar los receptores, pero inhiben las corrientes evocadas por los agonistas. En registros de canal único, los terpenoides disminuyeron la actividad de L-AChRs generada por ACh y levamisol, redujeron la frecuencia de aperturas del L-AChR e indujeron un componente de estado cerrado más prolongado. Sin embargo, no afectaron las propiedades del canal como la conductancia y la duración de apertura. El análisis global indicó que los terpenoides ejercen su efecto antihelmíntico actuando como antagonistas no competitivos del L-AChR. En el Capítulo 3 se estudió la doxepinona, considerada una estructura química privilegiada. Mediante ensayos de comportamiento se demostró que la doxepinona ejerce su acción paralizante sobre nematodos salvajes adultos jóvenes actuando a través el GluCl, el blanco molecular de la IVM. Este compuesto sintético generó parálisis estacionaria en nematodos salvajes. La IVM actúa sobre GluCls presentes en la faringe del nematodo e inhibe el bombeo faríngeo. Doxepinona también redujo la velocidad de bombeo faríngeo en nematodos salvajes y el efecto fue mediado por los GluCls. Mediante registros de corrientes macroscópicas se caracterizaron las corrientes del receptor heteromérico GluCl α 1/GluClß de C. elegans evocadas por el agonista glutamato. Se determinó que la doxepinona no es un agonista de dicho receptor ya que no es capaz de activarlo. Mediante diferentes protocolos de aplicación de drogas, se determinó que la doxepinona actúa como un inhibidor alostérico de los GluCls. Se propuso a la inhibición del GluCl como un nuevo mecanismo antihelmíntico. En resumen, en esta Tesis Doctoral, utilizando a C. elegans como modelo de nematodo parásito, se identificaron los sitios y se descifraron los mecanismos de acción molecular de diferentes compuestos químicos, con actividad antihelmíntica. / Caenorhabditis elegans is a free-living nematode used as a model organism in different science disciplines. Its reduced size, anatomically simple body plan, short life cycle and broad repertoire of behaviours have turned it in a useful organism for research. It also emerges as an interesting model in the pharmaceutical industry for fast and cheap in vivo assays and for the detection of compounds with biological activity. C. elegans shares pharmacological and physiological characteristics with parasitic nematodes and is sensitive to most antiparasitic drugs used in humans and animals. Given that parasitic nematodes are difficult to work with in the laboratory, C. elegans has emerged as an excellent parasitic model and has contributed to the understanding of mechanisms of action of anthelmintic drugs. C. elegans has the largest Cys-loop receptor family. In its muscle, it has three main Cysloop receptors: two nicotinic receptors (nAChRs), L-AChR and N-AChR, and the UNC-49 GABA receptor. nAChRs mediate body wall muscle contraction while GABA receptors mediate muscle relaxation, thus allowing the typical sinusoidal movement of the nematode. These receptors are the molecular targets of anthelmintic drugs. Levamisole, acting as an L-AChR agonist, generates sustained muscle contraction which ends in spastic paralysis of the nematode. Piperazine, by acting as an agonist of GABA receptors, generates muscle relaxation and flaccid paralysis. Other Cys-loop receptors in the nematode are also targets of anthelmintic drugs. The glutamate-activated chloride channel (GluCl) present in neurons and muscle cells is the molecular target of ivermectin (IVM), which is one of the most used antiparasitic drug worldwide. Considering Cys-loop receptors, C. elegans is no more dissimilar to parasitic nematodes than each individual species of parasite is to another. This results from the wide subunit diversity that generates Cys-loop receptors with different compositions and pharmacological properties among nematodes; the molecular basis of this diversity remains not fully understood. In this Thesis, C. elegans was used as parasitic nematode model. The anthelmintic properties and molecular targets of different chemical compounds were studied through behavioural assays. To determine their mechanisms of action, electrophysiological recordings, single-channel and macroscopic current recordings, were carried out in C. elegans muscle cells or in mammalian cells heterologously expressing the receptor under study. In Chapter 1 bephenium was studied. It is a cholinergic anthelmintic drug whose mechanism of action was not fully understood. Through behavioural assays it was determined that bephenium generates spastic paralysis in young adult wild-type worms. By using different mutant strains, it was determined that L-AChR is the molecular target involved in the paralyzing activity of bephenium. The results suggested that there may not be a specific receptor for bephenium in C. elegans muscle. When bephenium was combined with levamisole, the paralyzing effects were additive; which is of significance since drug combination is a good strategy to reduce resistance in parasitic nematodes. At the molecular level, through single channel recordings, it was determined that bephenium activates L-AChR in larvae L1 and L2 C. elegans. At higher concentrations, it acted as an L-AChR open channel blocker. Molecular docking studies showed that bephenium binds to the orthostetic agonist binding site and forms the cation-π interactions required for receptor activation. This result may explain the high efficacy for L-AChR activation. Bephenium selectivity for the mammalian muscle nAChR was studied through singlechannel and macroscopic current recordings. Bephenium activated nAChRs, but it acted as a very weak agonist and a potent channel blocker. According to the molecular docking studies, bephenium would generate the necessary interactions for activation only in one of the two orthosteric sites of the receptor. This may explain the low efficacy in the mammalian receptor with respect to nematode receptors. C. elegans mutant strains that lack LEV-8 subunit may have L-AChRs containing the spare ACR-8 subunit in its replacement. These L-AChRs may mimic those in certain nematode parasites, like the H. contortus receptor, for which it was suggested that its ACR-8 subunit may mediate bephenium activity. Through behavioural assays in the mutant strain, it was determined that the ACR-8 subunit is not required for the paralyzing effects of bephenium on C. elegans. At the single channel level, the receptors that lack LEV-8 subunit were similarly activated by bephenium. Bephenium, like ACh, induced fast receptor desensitization. In the Chapter 2 terpenoids present in plants (carvacrol, thymol and eugenol) were studied. Through behavioural assays in wild-type nematodes, it was determined that terpenoids produced fast paralysis of the worms. The paralyzing potency order was: carvacrol > thymol > eugenol. The larvae were more sensitive than young adults. Also, the compounds irreversibly inhibited egg hatching with the same potency order. These findings indicate that terpenoids generate short- and long-term anthelmintic effects. Three drug combinations were evaluated: thymol/levamisole, thymol/piperazine and thymol/ivermectin. The paralyzing effect of thymol/levamisole combination was synergic, and this combination was effective in the inhibition of egg hatching too. Through behavioural assays in mutant nematodes, it was determined that L-AChRs and GABA receptors are the molecular targets of the terpenoids. The macroscopic current recordings revealed that the compounds could not activate the receptors but inhibited the currents evoked by the agonists. In single channel recordings, terpenoids reduced L-AChR activity generated by ACh and levamisole, reduced the frequency of L-AChR openings and induced a longer closed state component. However, terpenoids did not affect channel properties, such as conductance and open duration. The global analysis indicated that, terpenoids exert their anthelmintic effect, acting as L-AChR non-competitive antagonists. In the Chapter 3, doxepinone was studied. Doxepinone is considered a privileged chemical structure. Through behavioural assays, it was demonstrated that doxepinone exert the paralyzing action in wild-type young adult worms acting through GluCls, which are the molecular targets of IVM. The synthetic compound generated stationary paralysis on wild-type worms. IVM acts on nematode pharyngeal GluCls and inhibits pharyngeal pumping. Doxepinone also reduced the pharyngeal pumping rate in wild-type worms and the effect was mediated by GluCls. Through macroscopic current recordings, the responses of GluCl α1/GluClß receptors of C. elegans evoked by the agonist glutamate were characterized. It was determined that doxepinone is not a GluCl agonist because it is not capable of activating the receptor. Through different drug application protocols, it was determined that doxepinone acts as an allosteric inhibitor of GluCls. The inhibition of GluCls was proposed as a new anthelmintic mechanism. In summary, in this Doctoral Thesis, using C. elegans as a model of parasitic nematode, the target sites and mechanisms of action of different chemical compounds with anthelmintic activity were deciphered.

An increase in antimicrobial resistance bacteria has endangered our ability to treat infectious diseases. Lack of good in-vivo model has made it difficult to study antimicrobial resistance. In this study, we have used an inexpensive and short life span in-vivo model namely, Caenorhabditis elegans (C. elegans) to study antimicrobial treatment using pathogenic Escherichia coli O157:H7, a multidrug resistance bacterium that causes life threatening infection in humans. We have investigated the influence of live vs. heat killed non-pathogenic E. coli OP50 (OP50) as a food source on the growth and survival of infected C. elegans mutant AU37 with E. coli O157:H7 in the presence and absence of antibiotics. This is analyzed using a liquid-based C. elegans-E. coli O157:H7 infection assay. C. elegans was synchronized and grown on a lawn of live OP50 till they reached L4-young adult stage. L4-young adults were transferred to liquid medium where the C. elegans was infected with live E. coli O157:H7 or live non-pathogenic OP50 for 24 hours. After infection, C. elegans were fed live or heat killed OP50 depending on the experiment, and the life span and levels of E. coli O157:H7 were monitored, with and without ampicillin treatment in a 96 well transwell plate. Our results indicate that live OP50 is an ideal food source for C. elegans growth and survival to study antimicrobial treatment. C. elegans growth rate and survival decreased in presence of heat killed OP50, which makes heat killed OP50 as a non-ideal food source for antimicrobial assay. Moreover, using live OP50 we have discovered that the ampicillin dose 8mg/ml, 16mg/ml, and 32mg/ml are effective in increasing the survival of C. elegans infected with E. coli O157:H7. However, treatment on C. elegans infected with acid stressed E. coli O157:H7 is controversial.

Yes / The application of omics to study Caenorhabditis elegans (C. elegans) in the context of spaceflight is increasing, illuminating the wide-ranging biological impacts of spaceflight on physiology. In this review, we highlight the application of omics, including transcriptomics, genomics, proteomics, multi-omics, and integrated omics in the study of spaceflown C. elegans, and discuss the impact, use, and future direction of this branch of research. We highlight the variety of molecular alterations that occur in response to spaceflight, most notably changes in metabolic and neuromuscular gene regulation. These transcriptional features are reproducible and evident across many spaceflown species (e.g., mice and astronauts), supporting the use of C. elegans as a model organism to study spaceflight physiology with translational capital. Integrating tissue-specific, spatial, and multi-omics approaches, which quantitatively link molecular responses to phenotypic adaptations, will facilitate the identification of candidate regulatory molecules for therapeutic intervention and thus represents the next frontiers in C. elegans space omics research.

NOTICE EN COURS DE TRAITEMENT / Les microARN (miARN) sont des courts ARN non codants qui régulent l'expression des gènes, au niveau post-transcriptionnel. Ces molécules d'environ 22 nucléotides de long s'associent aux protéines Argonautes (AGO) pour former un complexe appelé microRNA induced silencing complex (miRISC). Ensuite, les miARN recrutent le miRISC à des séquences partiellement complémentaires, dans les régions 3' non traduites d'ARN messagers (ARNm). Le miRISC peut ainsi réprimer la traduction d'ARNm spécifiques et souvent induire leur dégradation. Ce mécanisme est notamment important pour le développement animal et des défauts dans cette voie moléculaire sont liés à diverses pathologies chez l'humain. Des évidences récentes montrent que les interacteurs du miRISC et son mode d'action sur les ARNm peuvent diverger à différents moments du développement du nématode Caenorhabditis elegans. Nous avons donc posé l'hypothèse que des modifications post-traductionnelles pourraient expliquer certaines de ces différences moléculaires et fonctionnelles. Les objectifs de ce projet de recherche étaient donc d'identifier les événements de phosphorylation sur la protéine Argonaute ALG-1 de C. elegans et de déterminer leur fonction biologique au cours du développement animal. À cette fin, nous avons purifié la protéine Argonaute ALG-1 chez C. elegans avec un anticorps spécifique, ainsi que ses orthologues humains AGO 1-4, à partir de cellules humaines en culture. Nous avons déterminé par spectrométrie de masse les modifications post-traductionnelles sur ces protéines. En utilisant des méthodes de mutagenèse par édition du génome chez C. elegans, nous avons criblé l'importance de nombreux sites de phosphorylation en s'attardant aux phénotypes associés à la perte de fonction des miARN. Ceci nous a permis de mettre en évidence l'importance d'une région phosphorylable conservée de cinq résidus sérines/thréonine sur le domaine PIWI des Argonautes. La perte de phosphorylation de ALG-1, lorsque ces acides aminés sont mutés en alanines, produit des phénotypes développementaux beaucoup plus sévères que chez des animaux déplétés du gène alg-1. Au niveau moléculaire, nous avons montré, à partir de cellules humaines en culture, que l'hyperphosphorylation de ces acides aminés réduit l'association aux ARNm. De plus, nous avons montré que des mutants AGO2 qui ne sont pas en mesure de lier les miARN, ne sont pas hyperphosphorylés sur ces résidus dans les cellules humaines en culture. Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la voie de miARN, dans lequel l'hyperphosphorylation du domaine PIWI de l'Argonaute permet la dissociation du miRISC de sa cible. Nous proposons donc que la phosphorylation de cette région permettrait au miRISC d'être recyclé et de réprimer l'expression d'autres ARNm après sa déphosphorylation. En second lieu, notre crible a permis d'identifier une sérine phosphorylable sur le domaine MID de ALG-1 qui régule l'association de la protéine aux miARN, lors du développement du nématode. Nous avons montré que lorsque cette sérine est mutée en glutamate (phospho-mimétique) ALG-1 perd son association aux miARN. Par ailleurs, les animaux qui portent cette mutation présentent des niveaux de miARN moins élevés que chez les animaux sauvages, ainsi qu'une accumulation de brins passagers qui sont issus des duplex de miARN et normalement dissociés par AGO. Nous avons ensuite identifié l'enzyme qui produit la phosphorylation de cette sérine. Avec des expériences de phosphorylation in vitro, nous avons montré que cette phosphorylation pourrait être induite par la protéine kinase A (PKA). De surcroît, nos expériences soutiennent que alg-1 et PKA interagissent génétiquement. Précisément, le mutant non phosphorylable alg-1(S642A) supprime des phénotypes développementaux observés lors de la perte de fonction de la sous-unité régulatrice de PKA, kin-2. En somme, ce projet de recherche a permis de mettre en évidence un mécanisme conservé au cours de l'évolution qui régule l'association du miRISC aux ARNm par la phosphorylation des Argonautes, ainsi qu'un mécanisme qui régule l'association de ALG-1 aux miARN chez C. elegans. Notre étude indique d'ailleurs que le miRISC serait possiblement inhibé à des moments précis lors du développement animal, par exemple lors de la phosphorylation par PKA. Les études futures des voies signalétiques qui activent PKA chez le nématode nous permettra de mieux comprendre la fonction biologique et le contexte cellulaire qui requerrait l'inactivation du miRISC. / MicroRNAs (miRNAs) are a class of short non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotes. These molecules are ~22 nucleotides in length and associate with Argonaute proteins (AGO) to guide them to mRNAs that contain sequences with partial complementarity, commonly found in the 3' untranslated region (UTR). The interaction between the miRISC (miRNA induced silencing complex) and the mRNA inhibits protein synthesis and often leads to degradation of the transcripts. While the function and importance of this gene regulation pathway has been studied in plant and animal models, mechanisms that modulate the miRISC gene silencing efficiency in different biological settings are still poorly understood. The hypothesis of my research project conveys the idea that post-translational modifications of Argonaute proteins modulate gene silencing during animal development. To test this hypothesis, we aimed to identify phosphorylation events on the Argonaute ALG-1 in the nematode C. elegans and uncover how these modifications affect its function during animal development. We purified ALG-1 protein from C. elegans extracts with a specific antibody and human Argonautes AGO1-4 from human cell cultures. We identified phosphorylated Argonaute peptides using mass spectrometry analysis and then we screened which modification affected ALG-1 function using gene editing. This led to the discovery of a highly conserved serine/threonine phosphorylation cluster on the PIWI domain of the Argonaute that when mutated into non-phosphorylatable amino-acids (alanine) caused phenotypes that were more severe than the loss of alg-1 in C. elegans. Molecular analysis of these phosphorylation sites showed that they modulate association to miRNA targets. Specifically, when using phospho-mimicking mutations on human AGO2, we showed that the hyperphosphorylation of this cluster causes the Argonaute to lose interaction with mRNAs. Furthermore, we showed that AGO mutants that are deficient for miRNA binding do not undergo hyperphosporylation. These results revealed a new mechanism that regulate miRNA-mediated gene silencing by which unphosphorylated AGO binds miRNA targets and following hyperphosporylation the miRISC is released from mRNAs. We proposed that this mechanism could be used by cells to recycle the complex and permit multiple rounds of silencing by the miRISC after dephosphorylation. Our forward genetic screen of ALG-1 phosphorylation sites identified a serine on the MID domain that modulates association to miRNAs. We showed that phospho-mimicking mutation of ALG-1 at this position impaired the ability of ALG-1 to bind most miRNAs. Furthermore, we found that this mutation led to accumulation of passenger strands miRNAs in the total RNA. Since the passenger strands are not bound by the phospho-mimicking mutant, we suggested that they accumulate as duplexes which would render them refractory to degradation by single stranded nucleases. Last we showed that the protein kinase A (PKA) phosphorylates this residue in vitro and interacts genetically with alg-1. Altogether, this research project uncovered new mechanisms that regulate the miRNA pathway through the phosphorylation of the Argonaute proteins. Our study also suggests that ALG-1 is inhibited at specific timing by PKA during C. elegans development, and further study of the biological settings that require this inactivation will be crucial to understand its function.

La voie des microARNs est un mécanisme post-transcriptionnel de régulation génique qui contrôle divers aspects développementaux et physiologiques chez de nombreux eucaryotes supérieurs. Afin de mieux comprendre les rôles et modes d’actions des microARNs, nous avons entrepris l'exploration des interactions génétiques de cette voie chez le nématode \textit{Caenorhabditis elegans}. Nous nous sommes ainsi concentrés sur les gènes codant pour les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2, qui sont les principaux constituants effecteurs de cette voie. Premièrement, nous avons caractérisé la relation entre ces deux paralogues, en étudiant respectivement leur expression spatio-temporelle, leur association avec des microARNs, ainsi que les phénotypes associés à leur perte de fonction. Nous avons ainsi pu définir des caractéristiques communes et spécifiques pour chacune de ces deux protéines Argonautes et décrire de manière précise leurs rôles essentiels lors du développement embryonnaire. En effet, nous avons démontré que l'absence d'expression zygotique des protéines ALG-1/2 provoque un arrêt du processus morphogénétique lors de l'allongement des embryons et un défaut dans les structures de fixation épidermique-musculaires. Deuxièmement, nous avons realisé un criblage génétique dans le but d'identifier des nouveaux partenaires des protéines Argonautes ALG-1/2. Nous avons découvert le gène codant pour la protéine VPS-52, qui est un composant du complexe GARP (\textit{Golgi Associated Retrograde Protein}). La caractérisation de ce gène nous a permis de démontrer que VPS-52 interagit génétiquement avec le gène \textit{alg-1} et se comporte comme un modulateur positif de l'activité de certains miARNs impliqués dans le développement larvaire. Les mutants de \textit{vps-52} aggravent les défauts des cellules souches épidermales observés dans les mutants de \textit{alg-1} et du microRNA \textit{mir-48}. Ils augment également la létalité du mutant \textit{let-7(n2853)} et ce dépendement de sa cible. Ces augmentations phénotypiques sont liées à une baisse des niveaux des microARNs miR-48, miR-241 et des protéines GW182. Cette étude nous amène donc à proposer que l'activité des microARNs peut être contrôlée en partie par un mécanisme de transport rétrograde dépendant du complexe GARP. / The microRNA pathway is a post-transcriptional gene regulatory system that controls multiple developmental and physiological processes in many eukaryotes. We have undertaken the exploration of the genetic interactions of this pathway in the nematode \textit{Caenorhabditis elegans}, with the goal of unveiling processes controlled by microRNAs and the mechanisms of microRNA action. We focused on the genetic interactions of the \textit{alg-1} and \textit{alg-2} genes, that encode the microRNA-specific Argonaute proteins, key effector constituents of this pathway. In the first place, we characterized the relationship between these two argonaute paralogs, with respect to their spatio-temporal expression, association to microRNAs, and loss-of-function phenotypes. Thus, we defined shared and gene-specific features of these Argonautes and defined in detail their essential role during embryonic development. The absence of zygotic \textit{alg-1} and \textit{alg-2} expression causes arrest during the morphogenetic process of elongation with defects in the epidermal-muscle attachment structures. Addressing another aspect, we sought to elucidate novel genetic interactors of these argonautes using a forward genetics approach. We identified \textit{vps-52}, a component of the GARP (Golgi Associated Retrograde Protein) complex, as a genetic interactor of the \textit{alg-1} gene and established that, through its GARP complex function, it effects a positive modulatory role on miRNA activity. Mutants of \textit{vps-52} exacerbate the seam cell defects in the loss-of-function alleles of \textit{alg-1} and the \textit{let-7} miRNA family member \textit{mir-48} and enhance the lethality of the \textit{let-7(n2853)} hypomorph in a target dependent manner. These phenotypic enhancements related to decreased levels of the \textit{let-7} family microRNAs (miR-48 and miR-241) and the worm GW182 protein. Furthermore, the positive effect of \textit{vps-52} on microRNA activity seems to be conserved in mammalian cells, where VPS52 co-fractionates with miRISC components. Our analyses allow us to propose that VPS-52 as part of the GARP complex participates in membrane-related processes of the miRNA pathway, which facilitate miRNA activity and operate at the effector miRISC level.

Les voies de régulation dépendant des courts ARN non-codants contrôlent plusieurs processus biologiques. Ces courts ARNs sont important dans le développement des cellules germinales de plusieurs espèces ainsi que dans la régulation génique et la résistance virale. Néanmoins, la contribution de la voie de régulation dépendant des microARNs dans la biogénèse des cellules germinales demeure peu comprise. Étant donné que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 sont exclusivement impliquées et indispensables à la voie des microARNs, nous avons décidé de manipuler génétiquement ces gènes afin de déterminer si la voie des microARNs est importante dans la prolifération et différentiation des cellules germinales des animaux en utilisant le nématode Caenorhabditis elegans comme modèle d’étude. La perte de fonction des gènes alg-1 et alg-2 rend les animaux stériles, ce qui est similaire aux phénotypes observés chez les nématodes mutant pour Drosha et Dicer (deux enzymes essentielles à la production des microARNs). Ainsi, ceci supporte que la voie de régulation des microARNs joue un rôle essentiel pour le maintien des cellules germinales. Pour définir le rôle précis de ALG-1 et ALG-2 dans les processus complexes de régulation des cellules germinales, nous avons tout d’abord établi la descendance des souches mutantes alg-1(gk214) et alg-2(ok304). Ces deux souches de nématodes ont un faible nombre de descendant qui peut s’expliquer par un problème dans la prolifération des cellules germinales, de méiose ou dans la formation de gamètes. Une analyse précise des gonades de ces animaux indique une plus petite région mitotique avec un nombre de cellules germinales en prolifération inférieur à celui retrouvé chez les animaux de type sauvage. Nous avons aussi observé que les cellules entrent en méiose de manière plus précoce dans les animaux alg-1 et alg-2 mutants, que ces mutants ont des défaut dans la formation de gamètes et qu’ils ont un nombre plus élevé de cellules germinales apoptotiques. En utilisant l’immunofluorescence et des rapporteurs d’expression, nous avons confirmé que ALG-1 et ALG-2 sont exprimées dans la DTC, une cellule spécialisée situé à l’extrémité distale des gonades de C. elegans qui est au cœur de la régulation de la transition mitose-méiose des cellules germinales. En utilisant une lignée transgénique qui exprime ALG-1 exclusivement dans la DTC, nous pouvons partiellement rétablir le nombre de descendants ainsi que rétablir totalement le nombre de cellules retrouvé dans la région mitotique. De façon intéressante, nous observons que la perte de cinq microARNs exprimés dans la DTC mène à des phénotypes similaires à ceux observés dans les mutants alg-1 et alg-2. Finalement, l’analyse de l’expression génique par micropuces des gonades de vers alg-1 mutant indique que la voie des microARNs contribue à la régulation de différentes voies moléculaires importantes pour la prolifération et la différentiation des cellules germinales. L’ensemble de ces études supporte l’implication de la voie des microARNs dans le contrôle de la biogénèse des cellules germinales chez C. elegans. / Small non-coding RNA pathways assume pleiotropic roles in the regulation of multitude of biological processes. These non-coding RNAs have been shown to be involved in germline development in diverse species, in addition to their well-known participation in gene regulation and viral resistance pathways. However, the contribution of the miRNA, one of the small non-coding RNA pathways in germline biogenesis has remained elusive. Since ALG-1 and ALG-2 are exclusively involved in the miRNA pathway and indispensible for miRNA mediated gene silencing, we decided to genetically manipulate these genes to address whether miRNA pathway plays an important role in germline proliferation and differentiation using C. elegans as animal model. As double knockout of alg-1 and alg-2 leads to sterility, which mirrors the phenotypes of Drosha and Dicer mutants, we reasoned that the miRNA pathway proteins are crucial in germline maintenance. To delineate the role of ALG-1 and ALG-2 in the complex processes of germline regulation, we first investigated the brood size of alg-1(gk214) and alg-2(ok304) animals. Both mutants had significantly decreased brood size, which could result from defects in germline proliferation, meiosis or gamete formation. An extensive analysis of the germline of these mutants revealed a smaller mitotic region with less number of proliferating germ cells compared to the wild type. We also observed early entry into meiosis in alg-1(gk214) and alg-2(ok304). Using immunofluorescence and transgenic reporters, we confirmed ALG-1 and ALG-2 expression in DTC, a specialized cell located at the tip of both C. elegans gonadal arms that regulates mitosis-meiosis transition. Using transgenic line with alg-1 expressed exclusively in the DTC, we were able to partially rescue the brood size defect and completely restored the number of cells in the mitotic region. These mutants also presented defects in gamete formation and an increase in germ cell apoptosis. Interestingly, we observed that the disruption of five miRNAs expressed in the DTC display similar phenotypes as observed in alg-1 and alg-2 mutants. Finally, gene expression analysis by microarray of alg-1 mutant gonads indicates that the miRNA pathway is involved in the regulation of different pathways important for germline proliferation and differentiation. Together, our data supports the role of miRNA pathway in controlling germline biogenesis in C. elegans.

Les cellules souches portent de grandes promesses envers la médecine régénératrice, tandis que leur perturbation peut mener au cancer. Ainsi, il est fondamental de définir les interactions qui prennent place au sein d'un organisme entre les cellules souches et leur micro- et macro-environnement. Chez le nématode Caenorhabditis elegans, les niveaux de prolifération des cellules souches germinales (CSG) sont régis par l'abondance de leur progéniture différenciée à travers une interaction entre la voie de signalisation ERK/MAPK et la kinase activée par l'AMP (AMPK). Cependant, l'intersection moléculaire entre AMPK et la voie MAPK demeure toujours inconnue. En regard aux déterminants embryonnaires précoces et PAR-4/LKB1, principale kinase activant AMPK, nos travaux ont démontré l'expression ubiquitaire de par-4 et l'enrichissement cytoplasmique et cortical de PAR-4 dans la lignée germinale et les embryons précoces, en plus d'une décroissance transitoire de l'enrichissement cortical de PAR-4 dans la zone pachytène. De plus, nos travaux suggèrent que par-4b est suffisant pour établir la polarité embryonnaire et maintenir la fonction essentielle de par-4. Par ailleurs, quant aux déterminants régissant la prolifération des CSG, nous avons constaté que chez les adultes porteurs d'ovocytes, LIN-3/EGF et LET-23/EGFR sont nécessaires pour promouvoir la prolifération des CSG. De surcroit, nous avons démontré que DAF-18/PTEN prévient l'ovulation d'ovocytes non-fécondés et contribue au mécanisme de rétroaction de la prolifération des CSG. Nos résultats indiquent aussi que l'état de prolifération des CSG est corrélé, de manière inversement proportionnelle, à la quantité d'ovocytes anovulés, et ne forme donc pas une régulation binaire, mais plutôt progressive. Finalement, nous avons démontré que DAF-18/PTEN prévient la prolifération des CSG en l'absence de sperme de façon strictement zygotique, potentiellement à travers son rôle dans la gonade somatique, car sa perte de fonction altère légèrement les contractions des cellules de la gaine. Ainsi, ces travaux approfondissent globalement les principales voies de signalisation physiologiquement impliquées dans la régulation homéostatique de la prolifération des cellules souches germinales chez le nématode C. elegans, et pourraient avoir des retombées envers la médecine humaine. / Stem cells hold great promises for regenerative medicine, whilst their disruption may lead to cancer. Therefore, it is fundamental to define the interactions between stem cells and their micro- and macro-environment. In the nematode Caenorhabditis elegans, retroactive control of germline stem cells (GSC) proliferation levels is governed by the abundance of their differentiated progeny through an interaction between ERK/MAPK signaling pathway and AMP-activated kinase (AMPK). However, the molecular intersection between AMPK and the MAPK pathway still remains unknown. With regard to early embryonic determinants and PAR-4/LKB1, the main kinase activating AMPK, our work has demonstrated the ubiquitous expression of par-4 and the cytoplasmic and cortical enrichment of PAR-4 in the germline and early embryos, in addition to a transient decrease in cortical PAR-4 enrichment in the pachytene zone. Furthermore, our work suggests that par-4b is sufficient to establish embryonic polarity and maintain essential par-4 function. Moreover, regarding the determinants governing GSC proliferation, we found that in oocyte-bearing adults, LIN-3/EGF and LET-23/EGFR are required to promote GSC proliferation. Additionally, we demonstrated that DAF-18/PTEN is involved in ovulation of fertilized oocytes and contributes to germline stem cell proliferation feedback mechanism. Our results also indicate that GSC proliferation status correlates, in a inversely proportional manner, to the amount of anovulated oocytes, and consequently does not form a binary regulation, but rather a progressive one. Finally, we demonstrated that the strictly zygotic effect of DAF-18/PTEN promotes GSC proliferation, potentially through its role in the somatic germline, since its loss of function slightly alters sheath cells contractions. Thus, this work broadly deepens the main signaling pathways physiologically involved in the homeostatic regulation of stem cell in the nematode C. elegans, but could have implications for human medicine.

L'interférence à l'ARN ou RNAi est un mécanisme d'extinction de l'expression des gènes nécessitant des molécules d'ARN double-brin. Dans le cytoplasme, une machinerie enzymatique les prend en charge afin de produire de courts ARNs simple-brin de 21 nucleotides (siARN) qui vont s'associer avec une protéine Argonaute pour former le complexe effecteur appelé le complexe RISC. Ce complexe cible un ARNm par complémentarité de bases et induit sa dégradation de façon séquence spécifique. Malgré son utilisation fréquente dans les laboratoires de recherche et son fort potentiel comme agent thérapeutique, le mécanisme moléculaire par lequel le RNAi s'opère reste encore peu compris. En utilisant le nematode Caenorhabditis elegans comme modèle animal, mon projet de recherche avait pour but de mieux comprendre le fonctionnement du RNAi en déterminant : 1) la cinétique de dégradation d'un ARNm ciblé par la voie du RNAi et; 2) les caractéristiques moléculaires de l'ARN double-brin qui sont nécessaires à l'induction et au maintien du RNAi chez l'animal. Les résultats que j'ai obtenus indiquent que le clivage spécifique de l'ARNm dans la région complémentaire au siARN mène à la stabilisation d'une partie de l'ARNm ciblé suggérant que cette stabilisation serait importante pour obtenir une réponse RNAi efficace chez le nematode. De plus, mes études ont démontré que le nombre siARN, généré par la molécule d'ARN double-brin, affecte la dégradation de l'ARNm, le maintien et la transmission du RNAi chez l'animal. En résumé, mes études ont permis de mieux caractériser l'atténuation génique médiée par le RNAi chez l'animal et la mise en évidence des paramètres moléculaires importants dans la voie du RNAi. Ces observations permettront la création d'une nouvelle génération d'approches thérapeutiques utilisant le plein potentiel du RNAi comme régulateur d'expression génique.

Les courts ARN non codants tels que les microARN, les piARN et les siARN sont de petites molécules d’ARN de 20 à 30 nucléotides de long qui sont très bien conservées au cours de l’évolution. Elles s’associent à des protéines Argonautes afin de former un complexe effecteur appelé RISC (RNA induced silencing complex). Ces courtes séquences, ne codant pour aucune protéine, agissent comme de puissants régulateurs de l’expression des gènes. De nombreuses évidences supportent qu’une dérégulation du niveau d’expression de ces courts ARN non codants contribue au développement et au maintien de nombreuses pathologies telles que le cancer. De ce fait, il est essentiel pour la cellule de contrôler la stabilité des courts ARN non codants. Le contrôle de la maturation et de la stabilité de ces courts ARN non codants sont des mécanismes peu connus. L’objectif principal de mon doctorat a donc été de mieux comprendre comment le niveau des courts ARN non codants est contrôlé. Afin d’étudier plus en détail comment le niveau des microARN est régulé, nous avons identifié la phosphatase PPM-2 (PP2Cα chez l’humain) et l’E3 ubiquitine ligase HECD-1 (HectD1 chez l’humain) comme étant de nouveaux interacteurs du complexe de dégradation des microARN. Nous avons utilisé des approches de génétique et de biologie moléculaire chez le nématode C. elegans, pour étudier le rôle de la perte de fonction de ppm-2 et d’hecd1 dans la voie des courts ARN non codants. Nos travaux ont montré que la perte de fonction de ppm-2 induit des défauts développementaux qui sont associés à des défauts de la voie des microARN. De plus, l’absence de ppm-2 exacerbe les phénotypes développementaux observés dans des animaux où la voie des microARN est altérée. De manière intéressante, chez le mutant ppm-2, nous avons constaté que d’autres voies de courts ARN non codants, telles que la voie des piARN et celle de l’endosiARN nucléaire, sont affectées. Du point de vue moléculaire, nous avons observé une déstabilisation du niveau d’expression de plusieurs protéines Argonautes dans le mutant ppm-2. En effet, ces dernières sont envoyées à la dégradation par la voie du protéasome seulement chez des animaux mutés pour ppm-2. Concernant l’étude de HECD1, nous avons remarqué que la perte de fonction de cette ubiquitine ligase entrainait une diminution de la progéniture et une létalité embryonnaire attribuable à des défauts dans la gamétogénèse. De plus, nous avons observé une accumulation de miARN fonctionnels chez des animaux mutés pour hecd-1. L’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la transcription ou la dégradation des miARN. En conclusion, nos résultats suggèrent que PPM-2 permet de contrôler la stabilité des protéines Argonautes en les dirigeant dans une voie alternative de dégradation et que l’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la régulation des miARN en modulant leur transcription ou leur dégradation. Mes travaux de doctorat nous ont permis de mettre en lumière un nouveau modulateur des courts ARN non codants, PPM-2, qui agit via le contrôle de la régulation des Argonautes. Les avancées de la recherche dans le domaine des courts ARN non codants pourra permettre le développement de nouvelles thérapies. / Small non-coding RNAs, like microRNAs, piRNAs or siRNAs, are small RNA molecules, 20 to 30 nucleotides long that are conserved during evolution. They form an induced silencing complex (RISC) in association with Argonaute proteins to regulate gene expression. Small non-coding RNAs are involved in the regulation of genes implicated in cell proliferation, differentiation and development. Many evidences support that deregulation of the expression level of those small non-coding RNAs contribute to the development of pathologies such as cancer. It is therefore essential for cells to control small non-coding RNA stability. The control of maturation and stability of those small molecules are poorly understood. The main objective of my doctorate was to better understand how the stability of small non-coding RNAs is controlled. In order to study in more detail how miRNAs are regulated, we identified two factors involved in miRNA turnover in C. elegans. We found that the phosphatase PPM-2 (PP2Cα in human) and the E3 ubiquitin ligase HECD-1 (HectD1 in human) are new components of the miRNA degradation complex. Using the power of the nematode C. elegans and molecular biology, we characterized the role of the loss of function of PPM-2 and HECD-1 in small non-coding RNA pathways. Loss of this phosphatase induces developmental defects which are associated with a defect in the miRNA pathway. Genetically, the phosphatase mutant exacerbates the phenotypes that are observed in animals where the miRNA pathway is affected. Interestingly, we further observed that the loss of the phosphatase affects other small non-coding RNA pathways like the piRNA and the siRNA pathways. At the molecular level, we observed a decrease in the expression level of many Argonaute proteins in phosphatase mutant animals. Upon blocking proteasomal degradation with MG132, we noticed that Argonaute proteins are sent to proteasomal degradation in phosphatase mutant animals. Concerning HECD-1, we noticed that the loss of function of the E3 ubiquitin ligase leads to the decrease of progeny and embryonic lethality due to defects in gametogenesis. Moreover, we observed an accumulation of functional miRNAs. This protein can be implicated in transcription or turnover of miRNAs. VIIn conclusion, our data suggest that PPM-2 controls the stability of Argonaute proteins by sending them through an alternative degradation pathway and that HECD-1 could be implicated in miRNA regulation by modulating their transcription or degradation. My doctoral work helped to highlight a new modulator of small non-coding RNAs, PPM-2, which acts through the regulation of Argonaute protein. A better understanding of the mechanisms controlling the stability and the function of these strong regulators will be useful to develop new therapies.

Nous assistons actuellement à un vieillissement global de la population. Dans la majorité des pays, le groupe d’âge des 60 ans et plus est celui qui croît le plus rapidement. L’OMS estime que d’ici 2050, plus d’une personne sur cinq sera âgée de plus de 60 ans. Le vieillissement se caractérise par une perte graduelle de fonction de nombreux processus physiologiques. Ce processus biologique touche chaque espèce et chaque individu de manière spécifique. De nombreux facteurs, autant individuels (comportement, génétique, maladie), qu’environnementaux (situation géographique, socio-économique, pollution) vont influencer le vieillissement. Le vieillissement est d’ailleurs un facteur de risque important pour le développement de nombreuses maladies telles que le diabète de type 2, l’athérosclérose et les maladies cardiovasculaires. Il a déjà été démontré dans la littérature que la modulation d’un seul gène peut influencer, autant positivement que négativement, le vieillissement d’un individu. Les gènes ayant des effets sur ce processus sont habituellement des gènes jouant un rôle important dans une voie de signalisation et donc, sont souvent conservés à travers l’évolution. Les travaux décrits dans cette thèse montrent l’implication du gène R148.3 dans le processus de vieillissement du nématode C. elegans. Ce gène semble être impliqué dans différentes voies métaboliques pouvant avoir un impact sur la santé à long terme des nématodes. R148.3 semble réguler le métabolisme lipidique et les dépôts lipidiques dans les vers ainsi que la résistance au stress. L’inactivation de ce gène provoque des effets néfastes qui mènent à la dégradation rapide de plusieurs fonctions métaboliques et à la mort prématurée des vers. Les résultats obtenus dans cette étude confirment le lien entre R148.3 et le contrôle du vieillissement en santé chez C. elegans. Les prochaines étapes de cette recherche seraient de démontrer ces mêmes fonctions chez les mammifères. / We are currently witnessing the global aging of the population. In almost every country, the age group of 60 and over is growing faster than any other group. The WHO estimates that by 2050, more than 1 in 5 people will be 60 years or older. Aging is characterized by a gradual loss of function of many physiological processes. This biological process affects each species and each individual independently. Many factors, both individual (behavior, genetics, disease) and environmental (geographical location, socio-economic, pollution) will influence aging. Aging is also an important risk factor for the development of many diseases such as type 2 diabetes, atherosclerosis and cardiovascular diseases. It has already been reported in the literature that modulation of a single gene can influence, both positively and negatively, the aging process of an individual. Genes with effects on this process are usually genes that play an important role in a signalling pathway, and therefore are often conserved across evolution. The work described in this thesis shows the involvement of the R148.3 gene in the aging process of the nematode C. elegans. This gene appears to be involved in various metabolic pathways that may impact on long-term health of nematodes. R148.3 appears to regulate lipid metabolism and fat depots, as well as the resistance to stress. Inactivation of this gene causes adverse effects that lead to rapid degradation of several metabolic functions and the premature death of worms. The results obtained in this study confirm the link between R148.3 and healthy aging control in C. elegans. The next steps in this research would be to demonstrate these functions in mammals.