A gastrosquise passou, nos últimos 50 anos, da condição de uma patologia fatal para índices de sobrevida ao redor de 90%, graças aos avanços na neonatologia e cirurgia neonatal modernas. Porém uma significativa morbidade permanece, relacionada principalmente com o atraso no início do funcionamento intestinal normal. Este tema é objeto de estudo em vários centros visando determinar a origem do problema e promover soluções. Os modelos experimentais em animais são parte importante desses estudos. O objetivo deste trabalho foi o de reproduzir o modelo experimental da gastrosquise em embriões de galinha e comprovar que as alterações histopatólogicas apresentadas são comparáveis às da gastrosquise em humanos. Foram utilizados 278 ovos galinha da raça Leghorn (Gallus domesticus).Os embriões foram divididos em três grupos: grupo gastrosquise, no qual, através de um orifício na casca do ovo, o cordão umbilical foi aberto e as alças intestinais expostas a uma mistura de líquidos amniótico e alantóide; grupo mistura, no qual se promovia apenas a mistura de líquidos amniótico e alantóide, sem a manipulação do coto umbilical e sem a exposição de alças intestinais; e o grupo controle, que consistia de embriões normais e nos quais nenhum procedimento foi realizado. Os procedimentos foram feitos no 13o dia do desenvolvimento embrionário, e o estudo encerrado no 19o, quando as alças intestinais dos embriões foram removidas e encaminhadas para análise histológica convencional e análise morfométrica digital. Ao final do experimento, foram obtidos 23 embriões vivos do grupo gastrosquise (11,1% de sobrevida), 18 dos quais apresentavam alças intestinais expostas (8,7% de sucesso). No grupo mistura, 12 (70,5%) de 17 embriões sobreviveram ao procedimento. Como controle foram utilizados 10 embriões normais. Os embriões do grupo gastrosquise apresentaram um peso menor que os dos outros grupos. Este grupo também desenvolveu alterações intestinais consistindo em infiltrado inflamatório da serosa e mucosa, alterações isquêmicas da parede intestinal e formação de uma camada de fibrina sobre as alças. Tais achados são característicos da gastrosquise humana e não foram observados nos demais grupos. Os embriões do grupo gastrosquise mostraram também espessamento da parede intestinal, principalmente da serosa, quando em comparação com os outros grupos. Desta forma, o modelo experimental em embriões de galinha mostrou ser capaz de reproduzir as alterações intestinais da gastrosquise humana. / In the last 50 years gastroschisis has gone from a fatal condition to a disease with survival rates of around 90%. This is due to advances achieved in modern neonatology and neonatal surgery. However, there is still significant morbidity, related mainly to the delay in beginning normal intestinal function observed in these patients. This topic has been studied at several centers with a view to determining the source of this problem and achieving solutions. Experimental animal models are a major part of these studies. The purpose of this study was to reproduce the experimental model of gastroschisis in chicken embryos and to prove that the histopathological changes that occur in this model can be compared to those in human gastroschisis. A total of 278 Leghorn hen (Gallus domesticus) eggs were used. The embryos were divided into three groups: the gastroschisis group, in which the umbilical cord was opened through an orifice made in the eggshell, and the intestinal loops were exposed to a mixture of amniotic liquid and allantoid; the mixture group, in which the amniotic liquid and allantoid were simply mixed without manipulating the umbilical stump and without exposing intestinal loops; and the control group which consisted of normal embryos in which no procedure was performed. The procedures were performed on the 13th day of embryo development and the study was ended on the 19th day, when the intestinal loops of the embryos were removed and sent for conventional histological study and digital morphometric analysis. At the end of the experiment, 23 live embryos were obtained in the gastroschisis group (11.1% survival), and 18 of these presented exposed intestinal loops (8.7% success). In the mixture group, 12 (70.5%) of 17 embryos survived the procedure. And 10 normal embryos were used as control. The embryos of the gastroschisis group weighed less than those of the other two groups. The gastroschisis group also developed intestinal changes consisting of an inflammatory infiltrate of the serosa and mucosa, ischaemic changes in the intestinal wall and formation of a fibrin layer over the loops. These findings are characteristic of human gastroschisis and were not observed in the two other groups studied. The embryos of the gastroschisis group also presented a thickening of the intestinal wall, particularly the serosa, as compared with the other groups. Thus, the experimental model in chicken embryos proved able reproduce the intestinal changes of human gastroschisis.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-graduação em Ciências Animais, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-01-23T14:45:02Z No. of bitstreams: 1 2016_OscarOliveiraBrasil.pdf: 1386481 bytes, checksum: 21c30909a66af7329e43406c6d853c0f (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2017-03-13T16:41:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_OscarOliveiraBrasil.pdf: 1386481 bytes, checksum: 21c30909a66af7329e43406c6d853c0f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-13T16:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_OscarOliveiraBrasil.pdf: 1386481 bytes, checksum: 21c30909a66af7329e43406c6d853c0f (MD5) / A tecnologia de múltipla ovulação e transferência de embriões (MOTE) é uma ferramenta importante para o melhoramento genético e para a conservação de embriões de animais de raças ameaçadas ou que apresentem características de interesse. Atualmente, ainda existe uma grande variabilidade na resposta superovulatória de ovelhas doadoras de embriões, limitando a difusão dessa biotécnica reprodutiva em condições de campo. Portanto, objetivou-se avaliar diferentes alternativas para aumentar a produção de embriões in vivo e reduzir a variabilidade nos resultados de superovulação. Entre as abordagens utilizadas estão: (1) a superestimulação na emergência da onda folicular; (2) metodologias para selecionar as doadoras mais responsivas ao FSH exógeno; e (3) aumento da dose de FSH em ovelhas com histórico de baixa ovulação. A melhoria da superovulação foi conseguida através seleção das doadoras pelo número de folículos ≥ 2 mm, realizada 4,5 dias após pré-tratamento de sincronização e pelo histórico de um prévio protocolo superovulatório. Contudo, a superestimulação iniciada na emergência da onda folicular, a seleção das doadoras pelas medidas ovarianas e o aumento da dose de FSH em ovelha com histórico de baixa ovulação não melhoram a resposta superovulatória e o rendimento embrionário, tornando inviável essas abordagens em programas MOTE. / Technology of multiple ovulation and embryo transfer (MOET) is an important tool for genetic improvement and embryo conservation of endangered breeds or those exhibit characteristics of interest. Currently, there is a great variability in the super ovulatory response of donor sheep embryos, limiting the spread of this reproductive biotech in field conditions. This study aimed to evaluate different alternatives to increase in vivo embryo production and reduce variability in superovulation results. Among the approaches used are (1) superestimulation in the emergence of the follicular wave; (2) methodologies to select the most responsive donors to exogenous FSH; and (3) increase in the dose of FSH in sheep with low ovulation historic. The improvement of superovulation was achieved by donors’ selection through of the number of follicles ≥ 2 mm and historic of a previous superovulatory protocol. However, the superestimulation initiated in follicular wave emergence, the selection of the donor by ovarian measures and increasing FSH dose in sheep with low ovulation history does not improve superovulatory response and embryonic yield, making it unnecessary these approaches to MOET programs.

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Banca Eunice Oba / Banca: Maria Denise Lopes / Banca: Claudia Barbosa Fernandes / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Resumo: O forskolin eleva as concentrações de adenosina monofosfato cíclica (cAMP) por meio da ativação da adenilato ciclase. Esse experimento possuiu o objetivo de utilizar o forskolin para melhorar a produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. No Experimento I o forskolin foi adicionado no meio de maturação in vitro (MIV) com o objetivo de bloquear a meiose nuclear induzindo sua sincronização com a maturação citoplasmática. O Experimento II possuiu o objetivo de induzir uma lipólise química em embriões do D 6 a partir da utilização do forskolin, diminuindo sua sensibilidade após a vitrificação. No Experimento I, os oócitos permaneceram em meio MIV durante 6 horas na presença de três concentrações de forskolin: 0,025 mM; 0,05 mM; 0,1 mM e em seguida foram cultivados em meio MIV livre de forskolin por 18 horas. Após esse tempo os oócitos foram fertilizados e cultivados in vitro. Foi avaliado o estágio de maturação nuclear, a atividade e distribuição mitocondrial, a ultraestrutura oocitária, contagem do número de células e a apoptose celular. O tratamento com forskolin por 6 horas não resultou em atraso na quebra da vesícula germinativa em relação ao controle. Entretanto, após a retirada do bloqueio e maturação por 18 horas um maior número de oócitos tratados com 0,1 mM de forskolin se encontrou em MI (P<0,05). Não houve diferença com relação a atividade e distribuição mitocondrial nos oócitos, no entanto a maior concentração da droga levou a alterações ultraestruturais nos oócitos, com excesso de metabolização lipídica e desorganização do citoesqueleto. Apesar disso, não se observou diferença na taxa de produção de blastocistos avaliados no D 7, bem como no número total de células íntegras dos embriões. Entretanto, observou-se uma maior taxa de apoptose no grupo de blastocistos produzidos a partir de oócitos bloqueados com a maior concentração ... / Abstract: The forskolin raises concentrations of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) through the activation of adenylate cyclase. This experiment aimed the use of forskolin to enhance in vitro production (IVP) of bovine embryos. In Experiment I, forskolin was added in the medium of in vitro maturation (IVM) with the objective of blocking nuclear meiosis inducing your synchronization with cytoplasmic maturation. Experiment II aimed to induce lipolysis chemical in D 6 embryos from the use of forskolin, decreasing its sensitivity after vitrification. In the first experiment, the oocytes remained in IVM medium for 6 hours in the presence of three concentrations of forskolin: 0.025 mM, 0.05 mM, 0.1 mM and then were cultured in medium free forskolin for 18 hours. After this time the oocytes were in vitro fertilized and cultured. We assessed the stage of nuclear maturation, activity and distribution mitochondrial, ultrastructure oocyte, total number of cells and apoptosis. The treatment with forskolin for 6 hours did not resulted in delay in VCBD in relation to control group. However, after the removal of the drug and maturation for 18 hours a higher number of oocytes treated with 0.1 mM of forskolin were still in MI (P<0.05). No differences in relation to mitochondrial activity and distribution were observed between groups. However the higher concentration of the drug induced ultrastructural damage to oocytes, with excess of lipid metabolization and cytoskeleton disorganization. Nevertheless, no statistical differences were observed on blastocyst production and on the number of total cells. Despite of that, a higher rate of ... / Doutor

Orientador: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Banca: Anthony César de Souza Castilho / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Resumo: A maturação in vitro (MIV) é considerada uma das etapas mais desafiadoras da produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. O meio de MIV deve fornecer condições necessárias para que a maturação citoplasmática e nuclear ocorra de modo próximo ao fisiológico. As gonadotrofinas hipofisárias são essenciais para que o oócito adquira (in vivo) a competência para ser fertilizado; entretanto, se as gonadotrofinas (hipofisárias ou coriônicas) são essenciais, na MIV, as concentrações a serem utilizadas ainda são controversas. Os objetivos, com este estudo, foram estabelecer concentrações otimizadas de gonadotrofinas coriônicas (eCG e hCG) para a substituição daquelas comumente utilizadas de FSH e LH; comparar o efeito de baixas concentrações de eCG e/ou de hCG, isoladamente ou em conjunto com gonadotrofinas hipofisárias; e analisar a necessidade da utilização do FSH e do LH, individualmente, na PIV de embriões livre de suplementação proteica. Complexos cumulus-oócito (CCOs) obtidos de ovários de vacas provenientes de abatedouro, foram selecionados e utilizados em três experimentos: 1) CCOs maturados em meio MIV com seis concentrações distintas de eCG (0; 0,015; 0,15; 1,3; 1,5 e 4 UI mL-1 ) dando origem aos grupos experimentais (C+; E1; E2; E3; E4 e E5, respectivamente), e seis concentrações distintas de hCG (0; 0,05; 0,5; 0,67; 2 e 5 UI mL-1), originando também seis grupos experimentais (C+; H1; H2; H3; H4 e H5, respectivamente); 2) Meio MIV com concentrações mínimas funcionais de eCG e hCG obtidas no experimento anterior, resultando em sete grupos experimentais: sem quaisquer gonadotrofinas; apenas eCG (0,015 UI mL-1); apenas hCG (0,05 UI mL-1); eCG mais hCG; eCG mais LH; hCG mais FSH; e SFB com FSH (0,5 μg mL-1) e LH (5 μg mL-1); e 3) MIV na presença de FSH (0,5 μg mL-1) ou LH (5 μg mL-1) sem nenhuma suplementação proteica. Os CCOs maturados foram fertilizados e ... / Abstract: The in vitro maturation (IVM) is considered one of the most challenging steps of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The IVM medium must provide the conditions required for nuclear and cytoplasmic maturation to occur similarly to physiological. The pituitary gonadotropins are essential components that enable oocytes for fertilization (in vivo), but as the gonadotropins (pituitary or chorionic) are essential for IVM, their employed concentrations are still indefinite. We aimed to establish optimal concentrations of chorionic gonadotropin (eCG and hCG) to replace those of FSH and LH commonly used; to compare the effect of low concentrations of eCG and/or hCG alone or in combination with pituitary gonadotropins; and to analyze how necessary is the use of FSH and LH, individually, on the IVP of embryos free from any protein source. Cumulus-oocyte complexes (COCs), obtained from ovaries of slaughterhouse were selected and used in three experiments: 1) COCs matured on the IVM medium with six different concentrations of eCG (0, 0.015, 0.15, 1.3; 1.5 and 4 IU ml-1) yielding the experimental groups (C +, E1, E2, E3, E4 and E5, respectively) and six different concentrations of hCG (0, 0.05, 0.5, 0, 67, 2 and 5 IU ml-1), also yielding six experimental groups (C +, H1, H2, H3, H4 and H5, respectively); 2) IVM medium with minimal concentrations functional of eCG and hCG obtained in the previous experiment, resulting in seven groups: without any gonadotropin; only eCG (0.015 IU mL-1); only hCG (0.05 IU mL-1); eCG plus hCG, eCG plus LH; hCG plus FSH; FCS with FSH (0.5 mg ml-1) and LH (5 mg ml-1); and 3) IVM in the presence of FSH (0.5 mg mL-1) or LH (5 mg ml-1), without protein supplementation. The matured COCs were fertilized and cultured in incubator (38.3 °C, 5% CO2 and maximum humidity). Embryo development was evaluated in terms of cleavage, blastocyst and hatching rates (at 72, 168 and 240 hours post-insemination, ... / Mestre

Orientador: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Coorientador: Jeferson Ferreira da Fonseca / Coorientador: Sony Dimas Bicudo / Banca: Guilherme de Paula Nogueira / Banca: Claudio Alvarenga de Oliveira / Banca: Eunice Oba / Banca: César Roberto Esper / Resumo: Foram realizados dois experimentos, no primeiro, 70 ovelhas foram submetidas a um dos dois protocolos de sincronização do estro, em três períodos estacionais (Fatorial 2x3; Anestro: G-1CIDR, n=12 e G-2CIDR, n=11; Transição: G-1CIDR, n=12 e G-2CIDR, n=12; Ciclicidade: G-1CIDR, n=11 e G-2CIDR, n=12). O estro foi sincronizado com um dispositivo intravaginal de progesterona (P4; CIDR) por 14 dias. No G-2CIDR, o CIDR foi trocado por um novo no D7 (D0 = início do protocolo). No D0 e 14, 2,5 mg de um análogo da PGF2 (dinoprost) foram administradas, i.m., em todas as ovelhas. Exames ultrassonográficos dos ovários, por via transretal, foram realizados diariamente durante os protocolos (14 dias). Os dados foram analisados por regressão logística utilizando o Proc GLIMMIX do SAS (P<0,05). As ovelhas apresentaram de duas a cinco emergências de ondas foliculares durante os tratamentos [2 ondas: 4,29% (3/70); 3 ondas: 34,29% (24/70); 4 ondas: 52,86% (37/70); e 5 ondas: 8,57% (6/70) das ovelhas]. Não houve efeito do tratamento sobre os dias de emergência das ondas (Onda 1: 2,05±0,42 vs. 2,02±0,37; Onda 2: 5,69±0,42 vs. 5,65±0,37; Onda 3: 9,77±0,42 vs. 10,09±0,37; Onda 4: 11,85±0,39 vs. 12,12±0,35 e; Onda 5: 12,5±0,40 vs. 12,16±0,78 dias para G-1CIDR e G-2CIDR respectivamente; P>0,05). Similarmente, os períodos estacionais não interferiram sobre os dias de emergência para as ondas 1, 2, 3, 4 e 5, respectivamente (Anestro: 2,01±0,46, 5,11±0,47, 9,33±0,45, 12,27±0,40 e 13,50±0,40; Transição: 2,12±0,51, 5,95±0,52, 10,32±0,51, 11,16±0,78 e 11,61±0,50; e Ciclicidade: 1,99±0,42, 5,95±0,42, 10,14±0,42 e 12,08±0,43; P>0,05). Na estação de ciclicidade, nenhuma ovelha apresentou cinco ondas. No segundo experimento, foram utilizadas 60 novas fêmeas, sendo 20 para cada período... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two experiments were conducted, in the first, 70 ewes were submitted to one of two synchronization protocols in three seasons (Factorial 2x3; Non-breeding: G-1CIDR, n=12 and G-2CIDR, n=11; Transition: G-1CIDR, n=12 and G-2CIDR, n=12; Breeding: G-1CIDR, n=11 and G-2CIDR, n=12). On D0 (randomized day of estrus cycle), the estrus were synchronized with a P4 device (CIDR) for 14 days. However, in G-2CIDR, the CIDR was replaced by a new one on D7. On D0 and D14, 2.5mg of a PGF2 analogue (dinoprost), i.m., were administered, and on D14, all ewes received 300 IU of eCG (Novormon™, Syntex- Argentina). Ultrasonographic exam was performed daily between D0 and D14 and, every 8 hours until D19. Data were analyzed by GLIMMIX using the SAS (P<0.05). Ewes presented two to five follicular waves emergencies during treatments [2 waves: 4.29% (3/70); 3 waves: 34.29% (24/70); 4 waves: 52.86% (37/70) and; 5 waves: 8.57% (6/70) of ewes]. There were no effect of treatment on emergency waves days (Wave 1: 2.05±0.42 vs. 2.02±0.37; Wave 2: 5.69±0.42 vs. 5.65±0.37; Wave 3: 9.77±0.42 vs. 10.09±0.37; Wave 4: 11.85±0.39 vs. 12.12±0.35 and; Wave 5: 12.5±0.40 vs. 12.16±0.78 days for G-1CIDR and G-2CIDR respectively; P>0.05). Similarly, there were no effect of seasons on these variables (Nonbreeding: 2.01±0.46, 5.11±0.47, 9.33±0.45, 12.27±0.40 and 13.50±0.40; Transition: 2.12±0.51, 5.95±0.52, 10.32±0.51, 11.61±0.50 and 11.16±0.78 and; Breeding: 1.99±0.42, 5.95±0.42, 10.14±0.42 and 12.08±0.43 days for waves 1, 2, 3, 4 and 5, respectively, P>0.05). In Breeding season no ewes showed five waves. In the second experiment, were used 60 new females, 20 for each season (breeding, transition and non-breeding) and 10 for each group that received one of two superovulatory protocols according to the time that FSH treatment were initiated (G-FirstWave and G-LastWave). Ewes were... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A gastrosquise passou, nos últimos 50 anos, da condição de uma patologia fatal para índices de sobrevida ao redor de 90%, graças aos avanços na neonatologia e cirurgia neonatal modernas. Porém uma significativa morbidade permanece, relacionada principalmente com o atraso no início do funcionamento intestinal normal. Este tema é objeto de estudo em vários centros visando determinar a origem do problema e promover soluções. Os modelos experimentais em animais são parte importante desses estudos. O objetivo deste trabalho foi o de reproduzir o modelo experimental da gastrosquise em embriões de galinha e comprovar que as alterações histopatólogicas apresentadas são comparáveis às da gastrosquise em humanos. Foram utilizados 278 ovos galinha da raça Leghorn (Gallus domesticus).Os embriões foram divididos em três grupos: grupo gastrosquise, no qual, através de um orifício na casca do ovo, o cordão umbilical foi aberto e as alças intestinais expostas a uma mistura de líquidos amniótico e alantóide; grupo mistura, no qual se promovia apenas a mistura de líquidos amniótico e alantóide, sem a manipulação do coto umbilical e sem a exposição de alças intestinais; e o grupo controle, que consistia de embriões normais e nos quais nenhum procedimento foi realizado. Os procedimentos foram feitos no 13o dia do desenvolvimento embrionário, e o estudo encerrado no 19o, quando as alças intestinais dos embriões foram removidas e encaminhadas para análise histológica convencional e análise morfométrica digital. Ao final do experimento, foram obtidos 23 embriões vivos do grupo gastrosquise (11,1% de sobrevida), 18 dos quais apresentavam alças intestinais expostas (8,7% de sucesso). No grupo mistura, 12 (70,5%) de 17 embriões sobreviveram ao procedimento. Como controle foram utilizados 10 embriões normais. Os embriões do grupo gastrosquise apresentaram um peso menor que os dos outros grupos. Este grupo também desenvolveu alterações intestinais consistindo em infiltrado inflamatório da serosa e mucosa, alterações isquêmicas da parede intestinal e formação de uma camada de fibrina sobre as alças. Tais achados são característicos da gastrosquise humana e não foram observados nos demais grupos. Os embriões do grupo gastrosquise mostraram também espessamento da parede intestinal, principalmente da serosa, quando em comparação com os outros grupos. Desta forma, o modelo experimental em embriões de galinha mostrou ser capaz de reproduzir as alterações intestinais da gastrosquise humana. / In the last 50 years gastroschisis has gone from a fatal condition to a disease with survival rates of around 90%. This is due to advances achieved in modern neonatology and neonatal surgery. However, there is still significant morbidity, related mainly to the delay in beginning normal intestinal function observed in these patients. This topic has been studied at several centers with a view to determining the source of this problem and achieving solutions. Experimental animal models are a major part of these studies. The purpose of this study was to reproduce the experimental model of gastroschisis in chicken embryos and to prove that the histopathological changes that occur in this model can be compared to those in human gastroschisis. A total of 278 Leghorn hen (Gallus domesticus) eggs were used. The embryos were divided into three groups: the gastroschisis group, in which the umbilical cord was opened through an orifice made in the eggshell, and the intestinal loops were exposed to a mixture of amniotic liquid and allantoid; the mixture group, in which the amniotic liquid and allantoid were simply mixed without manipulating the umbilical stump and without exposing intestinal loops; and the control group which consisted of normal embryos in which no procedure was performed. The procedures were performed on the 13th day of embryo development and the study was ended on the 19th day, when the intestinal loops of the embryos were removed and sent for conventional histological study and digital morphometric analysis. At the end of the experiment, 23 live embryos were obtained in the gastroschisis group (11.1% survival), and 18 of these presented exposed intestinal loops (8.7% success). In the mixture group, 12 (70.5%) of 17 embryos survived the procedure. And 10 normal embryos were used as control. The embryos of the gastroschisis group weighed less than those of the other two groups. The gastroschisis group also developed intestinal changes consisting of an inflammatory infiltrate of the serosa and mucosa, ischaemic changes in the intestinal wall and formation of a fibrin layer over the loops. These findings are characteristic of human gastroschisis and were not observed in the two other groups studied. The embryos of the gastroschisis group also presented a thickening of the intestinal wall, particularly the serosa, as compared with the other groups. Thus, the experimental model in chicken embryos proved able reproduce the intestinal changes of human gastroschisis.

Orientador: Edir Nepomuceno da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-20T03:20:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_VeraLuciaNobregada_M.pdf: 4366240 bytes, checksum: 7ae22a2a3b6005fac0c55950cf6ffdf5 (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Esta pesquisa teve por objetivo estudar a patogenicidade de cepas de L. monocytogenes cultivadas a 4, 22 e 37°C em células Vero, macrófagos e embriões de galinha. Foram utilizados dois grupos de cepas: um isolado de listeriose humana e outro isolado de alimentos, tendo sido incluído uma cepa padrão patogênica "Scott A" e uma cepa de L. innocua, avirulenta. Primeiramente, determinamos algumas características morfológicas, bioquímicas e sorológicas das cepas. Todas apresentaram as características próprias da espécie, sendo que as amostras isoladas de casos clínicos humanos eram pertencentes ao sorotipo 4b. As que foram isoladas de alimentos eram pertencentes ao sorotipo 1/2a e 1/2b. Em outra fase estudamos a cinética de invasão e multiplicação de L. monocytogenes em cultivo de células Vero e macrófagos e o efeito da temperatura de cultivo da bactéria neste processo. Em macrófagos, a invasão e multiplicação foi mais efetiva do que em células Vero, e dependente do tempo após a inoculação e temperatura de cultivo das cepas. As cepas clínicas apresentaram maior capacidade de multiplicação a 4 e 37°C do que as isoladas de alimentos. A cepa 132 procedente de alimento foi mais invasiva em macrófagos do que as outras duas da mesma origem. A inoculação de L monocytogenes em células Vero não serviu para diferenciar as cepas clínicas das alimentares, nem mostrou diferença entre cepas cultivadas em diferentes temperaturas. Na última etapa da pesquisa, determinamos a dose letal 50% (DL50) para embriões de galinha. Embriões de galinha serviram como bom modelo para o estudo da patogenicidade de cepas cultivadas e mantidas em diferentes temperaturas. Cepas cultivadas e mantidas a 4°C se mostraram mais patogênicas do que cepas cultivadas e mantidas em temperaturas mais elevadas / Abstract: We studied pathogenicity of L. monocytogenes strains grown at 4, 22 and 37°C on Vero cells, macrophages and chicken embryos. Two groups of strains were used: one isolated from human listeriosis and another isolated from food, including one standard pathogenic "Scott A" strain and one avirulent L. innocua For all strains, it was established morphologically, some biochemical characteristics and serogrouping. All have shown its own species characteristics. Samples isolated from human listeriosis belonged to serovar 4b and the ones isolated from food belonged to serovar 1/2a and 1/2b. The kinetics of invasion and multiplication at L. monocytogenes on Vero and macrophage cell cultures and the effect of the growth temperature on the bacteria in this process was studied. With macrophages, the invasion and multiplication were more effective than with Vero cells, and was dependant on inoculation time and cultivation temperature of the strains. The clinical strains showed a better ability for multiplication at 4 and 37°C than the ones isolated from food. One strain from food was more invasive for macrophages than the other two ones from the same origin. The inoculation of L. monocytogenes on Vero cells was not useful to differentiate the clinical from the food strains. One did not even show any difference between strains growth at different temperatures. The lethal dose 50% (LD50)for chicken embryos was established for all strains and its appear a good model to the study pathogenicity of cultured strains kept at different temperatures. Strains cultured and kept at 4°C showed more pathogenicity than the ones cultured and kept at higher temperatures / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Flavia Lombardi Lopes / Coorientador: Daniel Robert Arnold / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Luiz Sérgio de Almeida Camargo / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Naiara Zoccal Saraiva / Resumo: Modificações pós-translacionais de histonas são importantes componentes do código epigenético, e contribuem para o controle da transcrição gênica de cada célula. O presente trabalho descreve a participação de duas modificações de histonas no desenvolvimento embrionário pré-implantacional: a acetilação de lisinas e a citrulinização de argininas. No capítulo 1, avaliamos a presença de duas modificações de histona H3, K9ac (permissiva) e K27me3 (repressiva) em embriões bovinos no ciclo de ativação do genoma embrionário (AGE), por imunofluorescência. Ambas as marcas estão presentes e apresentam alto coeficiente de correlação, e dois perfis de embriões (com alta e baixa variação dos níveis das modificações entre blastômeros) foram descritos. A acetilação de histonas está relacionada à ativação da expressão gênica, portanto no capítulo 2 hipotetizamos que a manipulação de seus níveis em embriões bovinos poderia influenciar a ativação do genoma embrionário, o desenvolvimento de blastocistos e a inativação do cromossomo X em fêmeas. Foram testadas concentrações do inibidor das histona desacetilases tricostatina A variando de 5 a 50nM, aplicadas por 12 a 144h, iniciando 70h após a FIV. Três protocolos foram selecionados: 5nM 48h, 5nM 144h e 15nM 48h. Após, foi utilizado sêmen sexado para estudar os efeitos da TSA sobre embriões fêmeas e machos separadamente. Por imunofluorescência para H3K9ac, foi observado aumento na acetilação de histonas em ambas as concentrações (5 e 15nM), sendo 5nM mais eficaz em fêmeas do que machos. O tratamento com 15nM 48h reduziu a produção de blastocistos em machos e fêmeas, e 5nM 144h em machos. A taxa de apoptose, avaliada pelo ensaio TUNEL, foi elevada em embriões fêmeas (grupos 5nM144h e 15nM48h), e em machos (grupo 15nM48h), mas tal aumento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Histone post translational modifications are important components of the epigenetic code, and contribute to the control of gene transcription in each cell. This work describes the participation of two histone modifications in embryonic preimplantation development: acetylation of lysines and citrullination of arginines. In chapter 1, we evaluated the presence of two modifications of histone H3, K9ac (permissive) and K27me3 (repressive) in bovine embryos in the cycle of embryonic genome activation (EGA), by immunofluorescence. Both marks are present and show a high correlation coefficient, and two profiles of embryos were described, displaying high and low variation of modifications level between blastomeres. The acetylation of histones is related to gene expression activation, so in Chapter 2 we hypothesized that the manipulation of acetylation levels in bovine embryos could influence embryonic genome activation, blastocyst development and X chromosome inactivation in females. Five concentrations of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA), ranging from 5 to 50nM beginning 70 hours after FIV were applied per 12 to 144h. Three protocols were selected: 5nM 48h, 5nM 144h and 15nm 48h. After, sexed semen was used to study the effects of TSA on male and female embryos separately. Immunofluorescence of H3K9ac showed increased histone acetylation at both concentrations (5 and 15nM). 5nM TSA was more effective in females than in males. Treatment with 15nM 48h reduced male and female blastocyst yield, and 5nM 144h reduced male blastocyst yield. Apoptosis rate was measured by the TUNEL assay. Female 5nM144h and 15nM48h groups, and male 15nM48h group displayed higher apoptosis levels, but this increase was not observed in low quality embryos. In female embryos, TSA did not affect... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Roberto Sartori Filho / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Margot Alves Nunes Dode / Resumo: Objetivou-se com o presente estudo avaliar a criotorerância de mórulas e blastocistos produzidos in vivo de doadoras da raça Sindi e Nelore (Bos indicus) e Holandês Preto e Branco (HPB - Bos taurus). No Experimento 1, 24 fêmeas lactantes e não lactantes da raça Sindi foram superovuladas com 100 mg de FSH suíno com protocolos em que as duas últimas aplicações de FSH foram substituídas ou não por 300 UI de eCG. Sete dias após a indução da ovulação, os embriões foram colhidos e avaliados quanto ao estágio de desenvolvimento embrionário e grau de qualidade. Dois terços dos embriões foram destinados à criopreservação, dos quais metade foi congelada pelo método convencional, com curva de resfriamento de -0,5ºC/min e a outra metade foi vitrificada pela técnica de Cryotop. Em seguida, foram descongelados e transferidos para receptoras sincronizadas, de maneira contemporânea aos embriões frescos. No Experimento 2, 31 fêmeas da raça Nelore foram superovuladas com 133 mg de FSH suíno e os dois terços dos embriões colhidos foram criopreservados e transferidos semelhantemente ao Experimento 1. No Experimento 3, 67 vacas lactantes e novilhas da raça HPB foram superovuladas com 500 e 300 UI de FSH suíno, respectivamente, e após a colheita dos embriões foram adotados os mesmos procedimentos realizados nos Experimentos 1 e 2. Os resultados foram analisados por modelos lineares generalizados e estão apresentados na forma de média dos quadrados mínimos ± erro padrão. Nos Experimentos 1 e 2, os embriões transferidos a fresco apresentaram maior taxa de concepção aos 30 dias do que os vitrificados e congelados (54,8±7,4a, 17,7±7,3b e 19,5±6,6%b; respectivamente; P 0,0013) na raça Sindi (n=231 embriões) e (46,0±6,1a; 31,2±5,4b e 28,1±5,3%b; respectivamente, P 0,04) na raça Nelore (n=297 embriões). O estágio de desenvolvimento embrionário parece não... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the cryotolerance of morulae and blastocysts produced in vivo in Sindhi and Nelore (Bos indicus) and Holstein (Bos taurus) donnors. In Experiment 1, 24 lactating and non-lactating Sindhi donnors were superovulated with 100 mg porcine FSH with protocols in which the last two FSH treatments were replaced or not by 300 IU eCG. Embryos were collected 7 days after ovulation induction and embryo development and quality degree were accessed. Two thirds of the embryos were cryopreserved, by the conventional freezing or Cryotop method. After that, embryos were thawed and transferred to synchronized recipients, simultaneously to fresh embryos. In Experiment 2, 31 Nelore cows were superovulated with 133 mg porcine FSH and two thirds of the embryos were cryopreserved and transferred similarly to Experiment 1. In Experiment 3, 67 Holstein lactating dairy cows and heifers were superovulated with 500 and 300 IU pFSH, respectively, and the same procedures were performed as in Experiments 1 and 2. Results were analyzed using generalized linear models and are presented as least squares means ± standard error. In Experiments 1 and 2, fresh embryos had a higher conception rate at Day 30 than those vitrified and frozen (54.8±7.4a, 17.7±7.3b and 19.5±6.6%b; respectively; P 0.0013) in Sindhi donnors (n=231 embryos) and (46.0±6.1a; 31.2±5.4b and 28.1±5.3%b; respectively; P 0.04) in Nelore donors (n = 297 embryos). Embryo developmental stage seems to have not influenced conception rates of Zebu embryos, especially cryopreserved ones. Finnaly, in Experiment 3, conception rates of fresh and cryopreserved embryos were similar (37.4±12.3, 24.5±11.3 and 21.0±9.5%; respectively, P>0.15) and also no difference was detected for the cryotolerance of morulae versus blastocysts (P>0.10) / Mestre

A utilização de uréia na alimentação de fêmeas bovinas pode prejudicar o desempenho reprodutivo destes animais, provavelmente decorrente do aumento do teor de nitrogênio uréico plasmático (NUP). O objetivo deste estudo foi avaliar se alimentação com uréia por curto prazo oferecida a novilhas, e conseqüente aumento de NUP, exerce influência sobre a quantidade, qualidade e competência dos complexos cumulus-oócito (CCO). O experimento teve duração de 62 dias, dividido em oito semanas e dois períodos. Foram utilizadas 40 novilhas mestiças mantidas a pasto, alocadas a dois tratamentos, utilizando-se delineamento \"cross-over\": dieta sem uréia (SU): 5 kg (matéria original) de silagem de milho e 1 kg de concentrado/animal/dia ou dieta com uréia (U): 5 kg de silagem de milho e 1 kg de concentrado contendo 75 g de uréia/animal/dia. Os animais selecionados a cada semana receberam as dietas por seis dias, uma única vez ao dia. No sexto dia de oferecimento das dietas, foram realizadas aspiração folicular (OPU) e colheita de sangue, em jejum e 3 horas após a alimentação. Imediatamente após a OPU, foi realizada contagem total de CCO recuperados e classificação dos mesmos em viáveis e inviáveis. Apenas os viáveis foram destinados à produção In vitro de embriões. Em relação ao teor de NUP, houve efeito de interação entre tratamento e tempo de colheita (P=0,04) e dentro de cada tempo foi observado aumento significativo (P<0,01) para os animais do tratamento U. Não foi observado efeito de tratamento em relação ao número total de CCO recuperados por animal (média ± EPM: SU=9,15 ± 0,82 vs. U=8,82 ± 0,95), nem sobre a porcentagem de CCO viáveis sobre total de CCO recuperados por animal (SU=73,61% ± 2,47 vs. U=70,26% ± 2,31). A taxa de clivagem obtida no dia 3 após a inseminação In vitro (IIV) e as taxas de blastocisto nos dias 6, 7 e 9 após a IIV, não foram influenciadas pelo tratamento. Porém, no 11º pós IIV, houve diminuição (P=0,04) da taxa de blastocistos eclodidos para o tratamento U (SU=82,50% ± 0,05 vs. U=64,33% ± 0,07). Apesar do aumento do teor de NUP observado nas novilhas do tratamento U, a quantidade, qualidade e competência dos CCO durante as primeiras clivagens até atingirem o estádio de blastocisto In vitro não foram influenciadas pelo oferecimento de 75 g de uréia na dieta, durante seis dias. Porém, foi observada redução da taxa de eclosão dos blastocistos das novilhas do tratamento U. / Urea feeding offered to bovine dams may damage their reproductive performance, probably due to an increase in levels of plasmatic urea nitrogen (PUN). The aim of this study was evaluate if short-term urea feeding of heifers, following high PUN levels, would have an influence on the quantity, quality and competence of cumulus-oocyte complexes (COC). Trial lasted 62 days, divided into eight weeks and two periods. Forty crossbred grazing heifers were allocated to one of two treatments, using a cross-over design: diet without urea (WU): 5 kg (as fed) of corn silage and 1 kg of concentrated/animal/day, or diet with urea (U): 5 kg of corn silage and 1 kg of concentrated with 75 g of urea/animal/day. Heifers selected in each week received these diets once a day, for six days. On the sixth day of diets? offer, ovum pick-up (OPU) and blood sampling at fasting and 3 hours after feeding were carried out. Immediately after OPU, total COC recovered was counted and classified as either viable or unviable. Only viable were destined to In vitro embryo production. In relation to PUN level, there was a significant interaction between treatment and sampling time (P=0.04) and a significant (P<0.01) increase in animals undergoing U treatment for each of the test times. No significant effect was observed relative to either the total number of recovered COC per animal (mean ± SEM: WU=9.15 ± 0.82 vs. U=8.82 ± 0.95), or the viable COC as a percentage of total recovered COC per animal (WU=73.61% ± 2.47 vs. U=70.26% ± 2.31). Cleavage ratio assessed on day 3 post In vitro insemination (IVI) and blastocyst ratio on days 6, 7 and 9 post IVI were not influenced by treatments. However, there was a significant treatment effect (P=0.04) in relation to hatched blastocysts on day 11 after IVI (WU=83% ± 0.05 vs. U=64% ± 0.07). Even though higher PUN levels were observed in animals from treatment U, quantity, quality and competence of the COC during first cleavages until reaching the blastocyst stage In vitro were not influenced by adding 75 g of urea on the diet offered to heifers, during six days. Neverthless, a decline in hatched blastocysts rate was observed in heifers of treatment U.