O trabalho teve como objetivo o estudo ao estímulo à embriogênese somática em linhagens de calos de laranja 'Seleta Vermelha', laranja 'Valência', laranja 'Caipira', limão ‘Cravo’ e tangerina 'Cleópatra' linhagens 1 e 2, pela utilização de diferentes fontes de carboidratos. Nas linhagens de calos, com baixo potencial embriogênico também estudou-se o efeito do inibidor de auxina 7 - azaindole (AZI), e densidade de plaqueamento de calos. O meio de cultura utilizado no estímulo à embriogênese somática, foi descrito por Murashige & Tucker (1969), substituindo-se a fonte de carboidrato por maltose, lactose, galactose, sacarose, glicose, nas concentrações de 18; 37; 75; 110 e 150 mM, ou glicerol, nas concentrações de 6; 12; 24; 36; 50 mM. Os resultados obtidos, demonstraram que a maior eficiência para o estímulo à embriogênese somática ocorreu em meio de cultura suplementado com maltose, galactose ou lactose, para as linhagens de calo de laranjas 'Valência' e 'Caipira', e tangerina 'Cleópatra' linhagem 1. Para as linhagens de calos de limão 'Cravo' e tangerina 'Cleópatra' linhagem 2, foram testados o inibidor de auxina, AZI, e a densidade de plaqueamento de calo, os quais demonstraram estar na dependência do açúcar para induzir a formação dos embriões somáticos. Pela análise histológica, pode-se verificar que embriões somáticos de limão 'Cravo' e das tangerinas 'Cleópatra' linhagem 1 e 2, apresentaram ausência de meristemas caulinar e/ou radicular, má formação da protoderme e do procâmbio. A histodiferenciação dos embriões somáticos, e a conversão em plantas foram obtidos para as laranjas 'Valência' e 'Seleta Vermelha', sendo observado um maior número de plantas nos embriões somáticos que permaneceram em meio de cultura de pré-germinação com 44 mM de sacarose. Com relação a concentração de ácido giberélico no meio de cultura para a germinação, obteve-se para a laranjas 'Valênca' e 'Seleta Vermelha', 23% e 51,4% de plantas germinadas em meio de cultura com concentração de 1,4 µM ácido giberélico, 17% e 60% de plantas germinadas e meio de cultura com concentração de 2,8 µM ácido giberélico, e 14% e 51,4% de plantas germinadas e meio de cultura com concentração de 1,4 µM ácido giberélico / This work aimed to study the induction somatic embryogenesis induction in callus lines of 'Seleta Vermelha', 'Valência' and Caipira sweet oranges, Rangpur lime and Cleopatra mandarin, lines 1 and 2, using different carbohydrate sources. In callus lines with low embryogenic potential, the effect of the auxin inhibitor 7 -azaindole (AZI) and callus platting density were studied as well. The culture medium used for induction of somatic embryogenesis was described by Murashige & Tucker (1969), exchanging the carbohydrate source by maltose, lactose, galactose, sucrose or glucose at concentrations of 18; 37; 75; 110 ou 150 mM, or glycerol, at concentrations of 6; 12; 24; 36 ou 50 mM. The results obtained showed that the highest efficiency for somatic embryogenesis stimulation occurred in the culture medium supplemented with maltose, galactose or lactose, for callus lines of 'Valencia' and Caipira sweet orange and Cleopatra mandarin, lines 1. For lines Rangpur lime and Cleopatra mandarin line 2, the auxin inhibitor AZI and the callus platting density were tested, demonstrating that the stimulation of somatic embryogenesis depends on the sugar. Histological analysis verified that somatic embryos of Rangpur lime and Cleopatra mandarin, lines1 and 2 had absence of shoot and/or root deformation of protoderm and procambium. Histodifferentiation of somatic embryos and conversion in plants were obtained for 'Seleta Vermelha' and 'Valencia' sweet oranges, with a higher number of plants from somatic embryos which were maintained in pre-germination culture medium whit 44 mM sucrose. The use of gibberellic acid in the culture medium for germination resulted in 23% and 51.4% of germinated plants for 'Valencia' and 'Seleta Vermelha' sweet oranges in culture medium with 1,4 µM gibberellic acid, and 17% and 60% of plants germinated in culture medium with 2,8 µM gibberellic acid, and 14% and 51,4% of plants germinated in culture medium with 1,4 µM gibberellic acid

Diversos fatores foram investigados a fim de se determinar uma metodologia para regeneração de plantas de soja (Glycine max (L.) Merrill) via embriogênese somática, tendo como base o germoplasma brasileiro de soja. Para isso, cotilédones imaturos foram cultivados in vitro sob diversas condições (regime hormonal, tipo e. concentração de açúcar, etc.). Foram avaliados os parâmetros referentes à embriogênese e a calogênese, assim como observações organográficas e anatômicas. Os resultados obtidos mostraram que altas concentrações (10-25 mg/l) de 2,4-D ou 2,4,5-T (11,5-17,5 mg/l), interrompem a ontogênese do embrióide no estádio globular de desenvolvimento, provavelmente por assegurar o estado meristemático das células. Baixas concentrações destas auxinas promoveram um desenvolvimento precoce dos embrióides. Nessas condições os embrióides eram em sua grande maioria morfologicamente anormais e não puderam ser convertidos em plântulas. A vacuolização precoce das células foi um dos eventos celulares associados a esse processo. Os embrióides tiveram origem multicelular a partir de células da epiderme e sub-epiderme do explante. A sacarose, em concentrações variando de 1,0 a 2,0% foi o açúcar que proporcionou maior eficiência de embriogênese. O processo de indução de embriogênese foi fortemente inibido pela irradiação do explante com raios ϒ. A adição de L-glutamina, L-prolina, caseína hidrolisada, extrato de malte ou extrato de levedura não estimulou a indução de embriogênese. A suplementação com ABA ou BA inibiu a indução de embriogênese e não favoreceu a maturação dos embrióides. As maiores eficiências de embriogênese foram obtidas cultivando-se os explantes na posição abaxial. Tanto a indução de embriogênese quanto a maturação dos embrióides foram fortemente afetadas pelo genótipo da planta doadora do explante. Não foi evidenciada a existência de interação entre genótipo e o meio de cultura (tipo e concentração de auxina). A luz favoreceu a indução de embriogênese, sob altas concentrações de auxina, mas inibiu completamente a maturação dos embrióides. Os embrióides induzidos pelo 2,4,5-T apresentaram uma maior frequência de maturação. Com base nesses resultados foi proposto um protocolo reproduzível para regeneração de plântulas assim como um modelo de origem dos embrióides. A aplicação dessa metodologia na obtenção de somaclones e de plantas de soja transgênicas foi discutida. / Several factors were studied in order to stabilish a methodology for soybean Glycine max (L.) Merrill) plant regeneration through somatic embryogenesis, im Brazilian soybean germplasm. Immature cotyledons were cultured in vitro, under several conditions (type and concentrations of plant regulators, sugars, etc.). Parameters of embryogenesis, callus formation, morphological and anatomical observations were assessed qualitative and quantitatively. The results threin analysed showed that high concentrations (10-25 mg/l) of 2,4-D or 2,4,5-T (11,5-17,5 mg/l) 2,4,5-T suspended embryoid ontogenesis at the globular stage, probably by maintaining the meristematic state of the cell. Low auxin concentrations promoted premature embryo development. In this condition, mostly embryoids were morphological abnormal and could not be converted into plantlets. Early vacuolation of the cells was an event associated with this process. Somatic embryos had multicellular origin from epidermal and su-epidermal explant cells. Concentrations of sucrose ranging from 1.0 to 2.0% presented the highest embryogenesis efficiency. The process of embryogenesis induction was strongly inhibited by explant gamma rays irradiation. Addition of L-glutamine, L-proline, casein hydrolysate, malt extract, or yeast extract to culture medium, did not enhance embryonic induction. Medium supplementation with ABA or BA inhibited embryogenesis induction and did not favour embryoid maturation. The highest embryogenesis efficiency was obtained culturing the explants with the abaxial surface in contact with the medium Either embryogenesis induction and embryoid maturation was strongly influenced by the genotype of the explant donor plant. It was not found any interaction between genotype and culture medium. The presence of light favoured embryogenesis induction, under high auxin concentration, but completely supressed embryoid maturation. Embryoids formed by the addition of 2,4,5-T showed a high maturation frequency. Regarding these results, a reproducible procedure for plantlet regeneration was proposed, as well as a model for embryoid origin. The potential application of this metodolog in the obtention of somaclones and transgenic soybean plants is discussed.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-12-21T17:01:45Z No. of bitstreams: 1 2016_HugoTeixeiraGomes_Parcial.pdf: 2383705 bytes, checksum: 1bf5dc855939eb6127752ec5933d765d (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-26T20:06:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_HugoTeixeiraGomes_Parcial.pdf: 2383705 bytes, checksum: 1bf5dc855939eb6127752ec5933d765d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-26T20:06:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_HugoTeixeiraGomes_Parcial.pdf: 2383705 bytes, checksum: 1bf5dc855939eb6127752ec5933d765d (MD5) / O objetivo do trabalho foi avaliar a utilização de sistemas de imersão temporária na embriogênese somática de dendezeiros (Elaeis guineensis Jacq.), a partir de folhas imaturas de plantas adultas, caracterizar morfoanatômica e bioquimicamente os estádios embriogênicos obtidos no processo, além analisar os clones regenerados por marcadores ISSR e AFLP (MSAP). Num primeiro experimento, calos primários da variedade C2328 foram multiplicados por cinco subcultivos de 30 dias, em quatro diferentes sistemas de cultivo: semi-sólido, líquido sob agitação, além dos biorreatores de imersão temporária R.I.T.A.® e tipo frascos gêmeos (BIT). Em seguida, o biorreator mais eficiente foi avaliado isoladamente na multiplicação de calos de outras três variedades: B35-2932, B35-4323 e B35-1729. Posteriormente, a diferenciação dos embriões somáticos foi realizada em meio de MS suplementado com 12,3 μM de 2-iP e 0,54 μM de ANA. Após esse processo, calos contendo embriões somáticos em estádio torpedo foram cultivados por cinco subcultivos de 30 dias em sistema semi-sólido, R.I.T.A.® e BIT, para a regeneração de plantas. Ao final do cultivo, a fidelidade genética e epigenética dos regenerantes foi avaliada por ISSR e AFLP (MSAP). Num segundo experimento, calos primários, embriogênicos e pró-embriogênicos, calos com embriões diferenciados, embriões somáticos globulares e torpedos, além de embriões zigóticos maduros (controle), foram analisados e caracterizados morfoanatomicamente. Por fim, foram quantificados os níveis de açúcares, amido, ácidos graxos, aminoácidos e proteínas contidos em calos primários e embriogênicos, calos embriogênicos com embriões somáticos diferenciados, embriões somáticos torpedo e em regeneração, e plantas regeneradas. Observou-se que na multiplicação o uso de meio líquido e sistema R.I.T.A.® proporcionou aos cultivos as maiores taxas de propagação, propiciando índices de acúmulo de biomassa fresca de até 293,3%. Já na regeneração, observou-se que os melhores resultados foram obtidos quando o R.I.T.A.® foi utilizado, promovendo em média a regenerarão de 14,1 plantas por grama de material inoculado. Com o uso desse sistema, além de não terem sido constatadas variações na sequência do DNA dos propágulos produzidos, observou-se ainda a redução dos índices de alteração do padrão de metilação do epigenoma dos indivíduos regenerados e a diminuição das taxas de ocorrência de hipometilação do DNA das culturas propagadas. Em relação às análises morfoanatômicas, verificou-se que calos primários são constituídos por células meristemáticas apenas em sua região mais interna, enquanto que calos embriogênicos são compostos inteiramente por este padrão celular. A partir do desenvolvimento destes cultivos foi verificada a formação de embriões somáticos sem conexão com os tecidos de origem, constituídos inicialmente pela protoderme e pelo meristema fundamental. Com a maturação destes propágulos, observou-se também a presença de regiões procambiais dispersas pelo meristema fundamental, característica também constatada nos embriões zigóticos maduros. Quanto às análises bioquímicas, verificou-se que no início da multiplicação os calos primários foram os propágulos que apresentaram as maiores concentrações de açúcares solúveis e amido, e os calos embriogênicos os maiores índices de ácidos graxos, aminoácidos livres e proteínas. Após o fim dessa etapa, verificou-se que os teores de ácidos graxos, aminoácidos livres e proteínas não apresentaram variações expressivas. Por outro lado, constatou-se na diferenciação que os níveis de açúcares solúveis aumentaram consideravelmente ao mesmo tempo em que um significativo processo de mobilização do amido foi observado. Já na maturação, os açúcares solúveis e as proteínas foram os compostos que não apresentaram grandes alterações. Nessa etapa, verificou-se uma queda considerável nos valores dos ácidos graxos e aminoácidos livres concomitantemente a elevação dos níveis de amido. Por fim, na regeneração observou-se que os teores de açúcares solúveis, ácidos graxos e proteínas decaíram enquanto que as taxas de amido e aminoácidos livres aumentaram de forma significativa. / The aim of this study was to evaluate the use of temporary immersion systems in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) somatic embryogenesis from immature leaves of adult plants, to characterize morphoanatomical and biochemically the embryogenic stages, and assessing regenerated clones through Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) and Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) (MSAP) markers. In a first experiment, primary calli from C2328 variety of oil palm were multiplied by up to five 30-days subcultures in four different culture systems: semi-solid, liquid under agitation, R.I.T.A.® (Recipient for Automated Temporary Immersion) bioreactors, and Twin Flask - TIS (Temporary Immersion System) bioreactors. Then, the most efficient system was evaluate individually for calli multiplication of another three oil palm varieties: B35-2932, B35-4323 e B35-1729. After multiplication, the calli were transferred to a MS medium with 12.3 μM 2-iP and 0.54 μM NAA in order to differentiate somatic embryos. Under these condition, the material was cultivated until most of the somatic embryos reached the torpedo stage, when they were transferred to R.I.T.A.® and TIS systems for additional five 30-days subcultures for plant growth. At the end, ISSR and AFLP (MSAP) were used to evaluate the genetic and epigenetic fidelity among the regenerate plants. In a second experiment, primary calli, embryogenic calli, calli with pro-embryos, calli with differentiated somatic embryos, and globular and torpedo-shaped embryos, as well as mature zygotic embryos (control), were characterized morphoanatomically. Finally, the sugars, starch, fatty acids, amino acids and proteins were extracted, identified and quantified at various stages of embryogenesis: primary and embryogenic calli, embryogenic calli with differentiated somatic embryos, torpedo somatic embryos, including those under regeneration, as well as regenerated plants. It was observed that the calli multiplication using liquid medium and R.I.T.A.® bioreactors provided the highest rates of propagation, providing fresh biomass accumulation rates of up to 293.3%. In the regeneration, the best results were also obtained in the R.I.T.A.® bioreactors, with an average of 14.1 plants per gram of inoculated material. Using this system, variations in the DNA sequence of propagules produced were not found. There was also a reduction of the epigenome methylation and decrease in DNA hypomethylation levels from evaluated regenerants. Regarding morphoanatomical analysis, it was found that primary calli are composed of meristematic cells only in its most inner region, whereas embryogenic calli are entirely composed by this cellular pattern. From these cultures was observed the formation of somatic embryos, without connections with the parental tissue, initially constituted by protoderm and fundamental meristem. With the maturation, the somatic embryos presented procambial regions, a characteristic also observed in mature zygotic embryos. Biochemical analyzes showed that at the onset of multiplication, the primary calli were the propagules with the highest concentrations of soluble sugars and starch, and the embryogenic calli the ones with the highest levels of fatty acids, free amino acids and proteins. At the end of this stage, the levels of fatty acids, free amino acids and proteins showed no significant changes. During the differentiation phase, the soluble sugar levels increased considerably, at the same time as a significant starch mobilization process was observed. In the maturation, soluble sugars and proteins were compounds that did not show significant changes. At this stage, a considerable decrease in the amounts of fatty acids and free amino acids was observed, concomitantly with the increase in starch levels. In the regeneration, the levels of soluble sugars, fatty acids and proteins declined, while the starch and free amino acids increased significantly.

Diversos fatores foram investigados a fim de se determinar uma metodologia para regeneração de plantas de soja (Glycine max (L.) Merrill) via embriogênese somática, tendo como base o germoplasma brasileiro de soja. Para isso, cotilédones imaturos foram cultivados in vitro sob diversas condições (regime hormonal, tipo e. concentração de açúcar, etc.). Foram avaliados os parâmetros referentes à embriogênese e a calogênese, assim como observações organográficas e anatômicas. Os resultados obtidos mostraram que altas concentrações (10-25 mg/l) de 2,4-D ou 2,4,5-T (11,5-17,5 mg/l), interrompem a ontogênese do embrióide no estádio globular de desenvolvimento, provavelmente por assegurar o estado meristemático das células. Baixas concentrações destas auxinas promoveram um desenvolvimento precoce dos embrióides. Nessas condições os embrióides eram em sua grande maioria morfologicamente anormais e não puderam ser convertidos em plântulas. A vacuolização precoce das células foi um dos eventos celulares associados a esse processo. Os embrióides tiveram origem multicelular a partir de células da epiderme e sub-epiderme do explante. A sacarose, em concentrações variando de 1,0 a 2,0% foi o açúcar que proporcionou maior eficiência de embriogênese. O processo de indução de embriogênese foi fortemente inibido pela irradiação do explante com raios ϒ. A adição de L-glutamina, L-prolina, caseína hidrolisada, extrato de malte ou extrato de levedura não estimulou a indução de embriogênese. A suplementação com ABA ou BA inibiu a indução de embriogênese e não favoreceu a maturação dos embrióides. As maiores eficiências de embriogênese foram obtidas cultivando-se os explantes na posição abaxial. Tanto a indução de embriogênese quanto a maturação dos embrióides foram fortemente afetadas pelo genótipo da planta doadora do explante. Não foi evidenciada a existência de interação entre genótipo e o meio de cultura (tipo e concentração de auxina). A luz favoreceu a indução de embriogênese, sob altas concentrações de auxina, mas inibiu completamente a maturação dos embrióides. Os embrióides induzidos pelo 2,4,5-T apresentaram uma maior frequência de maturação. Com base nesses resultados foi proposto um protocolo reproduzível para regeneração de plântulas assim como um modelo de origem dos embrióides. A aplicação dessa metodologia na obtenção de somaclones e de plantas de soja transgênicas foi discutida. / Several factors were studied in order to stabilish a methodology for soybean Glycine max (L.) Merrill) plant regeneration through somatic embryogenesis, im Brazilian soybean germplasm. Immature cotyledons were cultured in vitro, under several conditions (type and concentrations of plant regulators, sugars, etc.). Parameters of embryogenesis, callus formation, morphological and anatomical observations were assessed qualitative and quantitatively. The results threin analysed showed that high concentrations (10-25 mg/l) of 2,4-D or 2,4,5-T (11,5-17,5 mg/l) 2,4,5-T suspended embryoid ontogenesis at the globular stage, probably by maintaining the meristematic state of the cell. Low auxin concentrations promoted premature embryo development. In this condition, mostly embryoids were morphological abnormal and could not be converted into plantlets. Early vacuolation of the cells was an event associated with this process. Somatic embryos had multicellular origin from epidermal and su-epidermal explant cells. Concentrations of sucrose ranging from 1.0 to 2.0% presented the highest embryogenesis efficiency. The process of embryogenesis induction was strongly inhibited by explant gamma rays irradiation. Addition of L-glutamine, L-proline, casein hydrolysate, malt extract, or yeast extract to culture medium, did not enhance embryonic induction. Medium supplementation with ABA or BA inhibited embryogenesis induction and did not favour embryoid maturation. The highest embryogenesis efficiency was obtained culturing the explants with the abaxial surface in contact with the medium Either embryogenesis induction and embryoid maturation was strongly influenced by the genotype of the explant donor plant. It was not found any interaction between genotype and culture medium. The presence of light favoured embryogenesis induction, under high auxin concentration, but completely supressed embryoid maturation. Embryoids formed by the addition of 2,4,5-T showed a high maturation frequency. Regarding these results, a reproducible procedure for plantlet regeneration was proposed, as well as a model for embryoid origin. The potential application of this metodolog in the obtention of somaclones and transgenic soybean plants is discussed.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-06T14:59:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4172098 bytes, checksum: ffcb79008a3a1b7b4058a6ce3af9ce13 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-06T14:59:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4172098 bytes, checksum: ffcb79008a3a1b7b4058a6ce3af9ce13 (MD5) Previous issue date: 2013-06-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo do presente estudo foi analisar o processo de embriogênese somática a partir de embriões zigóticos imaturos de Bixa orellana L. (Bixaceae) sob aspectos morfoanatômicos e histoquímicos, além de análises moleculares da expressão de genes SERK. Embriões zigóticos imaturos foram colocados em meio MS suplementado com 2,26 μM de 2,4-D, 4,52 μM de cinetina e 0,1 % de carvão ativado. O início da embriogênese somática foi observado após 10 dias no meio de indução, com divisões celulares alterando o eixo embrionário e os cotilédones. Após 20 dias, foram notados embriões somáticos em estádio globulares iniciais, originados da protoderme dos embriões zigóticos, limitados por cordões de compostos fenólicos na camada abaixo da protoderme. Aos 52 dias do início da indução embriogênica, embriões somáticos em estádios iniciais, tardios e secundários foram observados. Análises histoquímicas demonstraram a mobilização de reservas durante o processo. Foram observados carboidratos totais no embrião zigótico durante o início do processo embriogênico, porém, compostos lipídicos não foram notados nessa fase. Corpos proteicos estavam presentes no embrião zigótico após 15 dias de indução. Análises moleculares durante a embriogênese somática levaram à clonagem e identificação de três possíveis membros da família SERK (BoSERK1, BoSERK2 e BoSERK3). Análises filogenéticas das proteínas indicaram que o agrupamento dos diferentes membros SERK ocorre de acordo com a função desempenhada na planta. Experimentos de hibridização in situ comprovaram a expressão de SERK em células do tecido vascular e da epiderme nos embriões zigóticos imaturos. Sinal de intensidade variável foi observado nos embriões somáticos em diferentes fases de desenvolvimento, desde globulares a cotiledonares. Os resultados do presente trabalho esclarecem os processos morfoanatômicos da embriogênese somática em B. orellana e contribuem com o primeiro registro da expressão de genes SERK para a espécie, subsidiando futuros estudos de expressão com mutantes. / This study aimed to analyze the process of somatic embryogenesis from immature zygotic embryos of Bixa orellana L. (Bixaceae) by means of morphoanatomical and histochemical aspects of regeneration, as well as molecular analysis of SERK gene expression. The embryos were placed onto MS-based induction medium supplemented with 2.26 μM 2,4-D, 4.52 μM kinetin and 0.1 % activated charcoal. The initiation of somatic embryogenesis was observed as early as 10 days in the induction medium, with cell divisions altering the embryonic axis and the cotyledons. After 20 days, somatic embryos at early globular stage were visualized, originating from the protodermis of zygotic embryos, bound by a sheath-like of phenolic compounds in the subepidermal layer. After 52 days of onset of embryo induction, somatic embryos at early and late stages, as well as secondary somatic embryos were observed. Histochemical analyses demonstrated the mobilization of reserves during the process. Total carbohydrates were observed in zygotic embryo during early embryogenic process, but lipid compounds were not perceived at that stage. Protein bodies were present in the zygotic embryo after 15 days of induction. Molecular analysis during somatic embryogenesis led to the cloning and identification of three possible SERK family members (BoSERK1, BoSERK2, and BoSERK3). Phylogenetic analysis of the proteins indicated that the different members of the SERK group occur according to the function performed in the plant. In situ hybridization experiments confirmed the expression of SERK in cells of vascular tissues and in the epidermis of immature annatto zygotic embryos. Signals of variable intensity were observed in somatic embryos at different stages of development, from globular to cotyledonary. The results of this work clarify morphoanatomic aspects of somatic embryogenesis in B. orellana and contribute as the first record on the cloning and expression of SERK genes for the species, supporting future expression studies with mutants. / Conforme email do professor Wagner Otoni (wcotoni@gmail.com ou wotoni@ufv.br), do dia 24/04/2015, o mesmo solicitou aguardar o autor da Tese finalizar a publicação dos artigos e só depois liberar ao domínio público. No Locus está embargado até 14/06/2018 (5 anos).

Made available in DSpace on 2018-08-01T23:26:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_7373_36 - Dissertação - Kristhiano.pdf: 1010717 bytes, checksum: 66b6e71bb2fe1af856bc0bebf2792482 (MD5) Previous issue date: 2014-02-20 / Objetivou-se avaliar a maturação e germinação de embriões somáticos do mamoeiro Golden THB. Para a obtenção dos embriões somáticos, folhas cotiledonares de plântulas de mamoeiro obtidas da germinação in vitro, em meio MS basal, foram inoculadas em meio de indução contendo sais de MS; myo-inositol (0,55 mM), sacarose (87,5 mM), ágar-ágar Vetec® (8 g L-1) e suplementado com 4-CPA (ácido p-clorofenoxiacético) (25 M). Após 50 dias, os calos embriogênicos foram transferidos para os meios de maturação: Experimento 1 (MM1) constituído de meio MS, ABA (0,5 M, CA (15 g L-1) e os tratamentos suplementados com diferentes concentrações de PEG 6000 (0; 40; 50; 60 e 70 g L-1) durante 45 dias; Experimento 2 (MM2) constituído de meio MS, ABA (0,5 M), CA (15 g L-1) e os tratamentos suplementados com diferentes concentrações de extrato de malte (0,0; 0,1; 0,2; 0,3 e 0,4 g L-1) durante 45 dias. Os tratamentos foram compostos com quatro repetições de três placas de Petri de 100 mm × 20 mm, contendo quatro calos embriogênicos. Os embriões cotiledonares normais gerados no MM2 suplementado com ABA (0,5 M), CA (15 g L-1) e extrato de malte (0,2 g L-1) foram transferidos para os meios de germinação (MG) formado pelo meio MS concentração total de sais, sacarose (87,5 mM), myo-inositol (0,0; 0,275; 0,550 e 0,825 mM) e ágar-ágar Vetec® (8 g L-1). Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias estudadas por análise de regressão. Os tratamentos com PEG foram inferiores e prejudicaram o processo de formação dos embriões e sua utilização na concentração de 70 g L-1 reduz em 31,85% a produção de embriões somáticos total e normais do mamoeiro Golden THB. Portanto, para a embriogênese somática do mamoeiro Goden THB não se recomenda a maturação em meio contendo PEG 6000. A adição de extrato de malte (0,17 g L-1), no meio de maturação potencializou o desenvolvimento embrionário de mamoeiro Golden THB, 45,40 ES calo-1. Identificou-se a ocorrência de embriogênese somática secundária e a formação de embriões somáticos anormais. A suplementação de myo-inositol (0,45 mM) no meio MS proporcionou ganhos significativos na porcentagem de germinação de embriões somáticos e posterior conversão em plântulas de mamoeiro Golden THB

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:36:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_7163_Liana Hilda Golin Mengarda.pdf: 4908977 bytes, checksum: f4e5e0acd3b9b2c71f714d3064158c60 (MD5) Previous issue date: 2014-12-05 / Objetivou-se, com este estudo, elucidar alguns aspectos fisiológicos e biotecnológicos da propagação do mamoeiro. Ao investigar as fases da absorção de água durante a germinação, evidenciou-se que a fase I compreendeu o período entre zero e cinco horas; a fase II, entre cinco e 120 horas; e a fase III iniciou-se após 144 horas. Com o objetivo de avaliar a influência da alternância de temperatura e do envelhecimento acelerado na mobilização de reservas durante a germinação de sementes de mamão, observou-se maior germinação sob alternância de temperatura, sendo que houve redução dos carboidratos, lipídios e proteínas na fase I, flutuações nos teores de lipídios e aumento nos teores de proteínas durante as fases II e III. Verificou-se que a mobilização dos lipídios em sementes de mamão não sofreu influência do envelhecimento acelerado, mas as sementes submetidas ao envelhecimento apresentaram menor teor de proteínas na fase III. Em seguida, objetivou-se identificar o genótipo de mamoeiro de maior desempenho inicial por meio de análises de diversidade e parâmetros genéticos relacionados às características físico-químicas e fisiológicas das sementes. Entre os genótipos avaliados, o híbrido UENF/Caliman 01 apresentou maior desempenho inicial. Posteriormente, ao avaliar os estresses induzidos por salinidade, restrição hídrica e elevada irradiância durante a germinação de sementes de mamão, observou-se que a salinidade e a restrição hídrica em potenciais osmóticos inferiores a -0,4 MPa, e a irradiância de 1200 mmol m-2 s-1 (sol pleno) caracterizaram-se como condições de estresse. Ao avaliar o desempenho de quatro genótipos nestes estresses, constatou-se que o híbrido UENF/Caliman 01 apresentou maior desempenho germinativo nas condições de estresse salino e de restrição hídrica, enquanto o híbrido JS12 x Waimanalo apresentou maior desempenho sob elevada irradiância. Após identificar o híbrido UENF/Caliman 01 como genótipo elite, foi comparado o desempenho das gerações F1 e F2 quanto à qualidade de sementes e ao desenvolvimento das plantas, e investigada a associação entre as características avaliadas. Observou-se que as sementes F1 apresentaram maior qualidade, enquanto as plantas F2 apresentaram maiores diâmetro do caule, altura do painel e número de frutos. Observou-se que maior teor de lipídios nas sementes apresentou associação com menor número de frutos, e que menores teores de açúcares e de lipídios das sementes e menor velocidade de germinação apresentaram associação com a menor sobrevivência. Logo, a qualidade das sementes apresentou associação positiva com a sobrevivência das plantas em campo, mas não com o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo das plantas. Por fim, objetivou-se induzir a embriogênese somática de mamoeiro híbrido UENF/Caliman 01, a partir de explantes juvenis e de plantas hermafroditas, utilizando diferentes fontes e concentrações de auxina. Para explantes juvenis, a suplementação do meio com 36 mM de 2,4-D foi eficiente na formação de maior número de embriões somáticos (46,7 embriões calo-1). A adição de 48 mM de 2,4-D no meio foi mais eficiente para a maior frequência de plântulas normais (entre 16 e 30%). Para plantas hermafroditas, os tratamentos de indução com concentração ≥ 36 mM de 2,4-D promoveram menor calogênese e maior oxidação dos explantes. Foram obtidos embriões somáticos (1,62 embriões calo-1) a partir do cultivo in vitro em meio com concentração inicial de 9 mM de 2,4-D.

Este trabalho teve como objetivo a obtenção de embriogênese somática em cultivares brasileiras de bananeira e subsequente conversão dos embriões somáticos em plantas. Estudos desta natureza visam possibilitar trabalhos futuros que envolvam a manipulação genética, para melhoramento desta cultura. O projeto consistiu, primeiramente, na indução de embriogênese somática a partir de ápices vegetativos testando-se: diferentes auxinas (dicamba, picloram, 2,4-D e NAA) em meio MS (Murashige & Skoog, 1962); três meios de cultura com diferentes razões entre nitrogênio nítrico e amoniacal (NO3-: NH4+); e tempo necessário para permanência do explante no meio de indução. Indução foi obtida, porém, embriões somáticos não converteram-se em plantas. Em seguida, estudou-se o efeito do tratamento de maturação, através de cultivo contendo concentração mais elevada de sacarose (60 g/L) ou PEG (polietilenoglicol), na conversão e germinação de embriões somáticos a partir de ápices vegetativos. Alternadamente, foram utilizados explantes de inflorescências masculinas na indução de embriogênese somática. Em todas as etapas foram realizadas análises morfo-anatômicas através de microscopia ótica e eletrônica de varredura. Na indução a partir de ápices vegetativos, as auxinas dicamba e picloram apresentaram formação de estruturas embriogênicas e embriões somáticos, enquanto que as demais apresentaram ausência de resposta embriogênica. Cortes histológicos dos explantes em meio com dicamba, mostraram regiões embriogênicas com formação de pró- embriões e regiões meristemáticas não organizadas, que possivelmente, originaram estruturas monopolares. Os embriões somáticos eram morfologicamente semelhantes aos embriões zigóticos de Musa acuminata, porém, diferenciação de protoderme, ápices meristemáticos e procâmbio, não foram observados. Entre os três diferentes meios de cultura testados na indução (SH, FN-Lite ou 1/2 MS), o meio FN-Lite e 1/2 MS, com razão nitrato:amônio de 4:1 e 2:1, respectivamente, apresentaram melhor qualidade dos embriões somáticos, do que os embriões em meio SH com razão de 9,5:1, e o melhor tempo de indução foi de 4 semanas. Cortes histológicos foram realizados para observação das características dos embriões somáticos formados. O tratamento de maturação dos embriões somáticos favoreceu a conversão dos embriões em plântulas, porém, em baixo percentual. Frequentemente foram observadas, tanto em meio de indução, como de maturação, uma alteração de desenvolvimento dos embriões somáticos, com um crescimento preferencial do ápice radicular, e ausência de desenvolvimento do ápice caulinar. Em explantes de inflorescências masculinas, identificaram-se através de análises morfo-anatômicas, dois tipos de embriões somáticos: um tipo semelhante ao embrião zigótico de Musa acuminata e, em menor frequência, desenvolveram-se embriões somáticos semelhantes a embriões zigóticos de outras monocotiledôneas, indicando que em um único protocolo de embriogênese somática, é possível ocorrer a formação de diferentes padrões morfológicos de embriões somáticos. / The present work aimed to obtain somatic embryogenesis in Brazilian cultivars of banana and their subsequent conversion into plants. These studies are important for the development of protocols involving genetic manipulation techniques for crop improvement of this species. Initially, the induction of somatic embryogenesis from shoot apices was tested using MS medium (Murashige & Skoog, 1962) supplemented with different auxins (dicamba, picloram, 2,4-D and NAA); three culture media with different ratios of nitric:amoniacal nitrogen (NO3-: NH4+); and length of time in the induction medium. Induction was obtained but the somatic embryos did not convert into plants. Maturation treatments with higher sucrose levels or PEG (polyethylene glicol) were then tested. In addition, the use of male inflorescences were used as explants for somatic embryo induction. During the experiments, morpho-anatomic analyses were performed through light and scanning electron microscopy. When shoot apices were used as explants, the auxins dicamba and picloram showed the formation of embryogenic structures and somatic embryos, while 2,4-D and NAA were not. Explants in medium containing dicamba presented both embryogenic regions with pro-embryos and non-organized meristematic regions, which may have formed unipolar structures. The somatic embryos were morphologically similar to the zygotic embryos of Musa acuminata, however lacked the differentiation of protoderm, meristematic apices and procambium. These somatic embryos did not convert into plants. Among the three different culture media tested for induction (SH, FN-Lite or 1/2 MS), FN- Lite and 1/2 MS provided better quality embryos and four weeks was considered the best period for induction. These two media have a 4:1 and 2:1 NO3-: NH4+ ratio, while SH has a 9,5:1 ratio. Histological sections were done to evaluate the somatic embryos formed. Somatic embryo maturation treatments favored the conversion of embryos into plants, however at low frequency. Frequently, somatic embryos showed the development of the root pole only. This behavior was observed both during induction and maturation. Male inflorescence explants formed two types of somatic embryos: one morphologically resembling the zygotic embryo of Musa acuminate, and less frequently somatic embryos with morphological characteristics of other monocots. This behavior indicates that in one protocol of somatic embryogenesis it is possible to obtain different morphological patterns of somatic embryos.

O objetivo dessa dissertação foi avaliar os efeitos do cálcio na indução de morfogênese, mais especificamente na embriogênese somática de Eucalyptus urophylla a partir de hipocótilos cultivados “in vitro". Análises bioquímicas e histológicas foram realizadas visando observar o papel do cálcio nos conteúdos de proteínas e açúcares totais, na atividade específica da peroxidase e na morfogênese, a qual foi avaliada mediante técnicas de histologia. As concentrações de cálcio (na forma de CaCl2H20) variaram de O a 12,12 mM e foram adicionadas ao meio de cultura descrito por Simola (1985) sendo que a concentração de cálcio presente nos calos foi determinada diretamente por Espectrometria  de Fluorescência de Raios-X, um método não-destrutivo que permitu que as mesmas amostras quantificadas fossem utilizadas nas análises histológicas. Uma análise estatística multivariada (Análise de Componentes Principais - PCA) permitiu agrupar os tratamentos em 5 blocos e indicou o grupo mais responsivo para uma resposta morfogênicas considerando as interações entre todos os parâmetros avaliados. Em baixas concentrações de cálcio veirificou-se ausência de resposta morfogênica e a histologia revelou tecidos colapsados e dessaranjados. Aumentando a concentração do cátion, os teores de proteínas e açúcares totais e a atividade específica da peroxidase também aumentaram. Ao nível histológico foram verificadas diferenças entre os tratamentos e foi possível verificar que a concentração de cálcio de 6,62 mmoI.L-1 , estimulou a formação de embriões somáticos globulares. / The aim of this work was to evaluate the calcium effects in the morphogenesis induction, speciffically in the somatic embryogenesis of Eucalyptus urophylla hipocotils. Biochemical and histological analysis were performed in order to observe the calcium role in the total protein and sugar contents, in the peroxidase specific activity and in the morphogenesis, wich was evalueted by histology. The calcium (CaCb.2H20) concentrations from 0.0 to 12.12 mM were added to Simola (1985) culture medium and calcium concentration in calli was determined directly by X-Ray Flourescence Spectrometry, a non-destructive technique, allowing for the processing of thesame tissue for histological analysis. A multivariate analysis (PCA-Principal Components Analysis) grouped the treatments into 5 clusters and indicated the more responsive group for a morphogenic response considering the interactions between the evaluated parameters and the calcium concentration. Lack of calcium supply caused a complete absence of a morphogenic process and tissue collapsing. The increase in calcium concentration favored the presence of higher total protein and sugar contents, the increase of peroxidase specific activity and changes in the histological characteristics. It was possible to verify that calcium stimulated globular somatic embryo formation at concentration of .62 mmoI.L-1

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-03-29T11:36:45Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1817587 bytes, checksum: 926162ce1f44cc0b545b80273c21b20b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-29T11:36:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1817587 bytes, checksum: 926162ce1f44cc0b545b80273c21b20b (MD5) Previous issue date: 2013-03-13 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O objetivo geral do trabalho foi determinar um protocolo de embriogênese somática e de calogênese em raízes de Passiflora morifolia Masters, e realizar análises fitoquímicas em calos e em diferentes órgãos da espécie. Explantes radiculares foram incubados em meio Murashige & Skoog (MS) suplementado com diferentes concentrações de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Avaliaram-se o número de explantes com formação de zonas embriogênicas e de calos, aspectos anatômicos, estruturais e moleculares, assim como, a caracterização fitoquímica de calos, de diferentes órgãos de vitroplantas e de plantas cultivadas em casa de vegetação. O primeiro capítulo teve como objetivos estabelecer um protocolo de indução da embriogênese somática em raízes de P. morifolia, e realizar a caracterização morfoanatômica do processo e de expressão do gene SERK por hibridização in situ. As concentrações de 2,4-D iguais ou superiores a 6,78 μM induziram embriogênese somática. O teste de dupla coloração com carmin acético e azul de Evans confirmou a natureza embriogênica do material. O contínuo desenvolvimento de zonas de proliferação formadas a partir do periciclo e de tecidos vasculares associados promoveu o rompimento do córtex e da epiderme da raiz, culminando na diferenciação de embriões somáticos. Adicionalmente, a hibridização in situ com sonda heteróloga de PcSERK (Passiflora cincinnata SERK), confirmou a embriogênese somática. O segundo capítulo teve como objetivos estabelecer um protocolo de calogênese em explantes radiculares de P. morifolia, e realizar análises fitoquímicas em calos submetidos a tratamentos com luz UV-B, e em diferentes órgãos da espécie cultivada em casa de vegetação e in vitro sob iluminação fornecida por lâmpadas de LED. Por cromatografia em camada delgada foram observadas diferenças fitoquímicas entre plantas e vitroplantas. Flavonoides foram facilmente observados em folhas de plantas em ambas as condições de cultivo, exceto em calos. Por cromatografia líquida de alta eficiência foi identificado isovitexina como o flavonoide presente em maior concentração nas folhas e caules de plantas cultivadas em casa de vegetação. Outros flavonoides foram identificados nos demais órgãos em ambas as condições de cultivo, com exceção dos calos. Diferenças entre a atividade antioxidante de plantas e vitroplantas foram verificadas, ao contrário do observado para os calos submetidos ao tratamento com UV-B, quando comparados com o tratamento controle. O presente estudo demonstrou a versatilidade de raízes de P. morifolia para a calogênese e embriogênese, e a possibilidade de produção de metabólitos secundários em vitroplantas cultivadas sob iluminação de lâmpadas de LED. / The general objective of the study was to establish a protocol for somatic embryogenesis and callogenesis in roots of Passiflora morifolia Masters and carry out phytochemical analysis in root-derived calluses and in different plant organs. Root explants were plated on Murashige and Skoog (MS) supplemented with different concentrations of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). It was evaluated the number of explants forming embryogenic areas and calluses, anatomical, molecular and structural aspects, as well as the phytochemical characterization of calluses from different organs of in vitro plants and plants grown in the greenhouse. Chapter 1 aimed to establish a protocol for induction of somatic embryogenesis in roots of P. morifolia and its morphoanatomical characterization as well as of the SERKgene expression through in situ hybridization. Concentrations of 2,4-D greater than or equal to 6.78 μM induced somatic embryogenesis. The double staining test with carmine acid and Evans blue confirmed the embryogenic nature of the material. The continuous development of proliferation zones from the pericycle and associated vascular tissue caused the epidermis and cortex of the root to break, leading to the differentiation of somatic embryos. Additionally, the in situ hybridization with the heterologous probe PcSERK (Passiflora cincinnata SERK) confirmed the occurrence of somatic embryogenesis. Chapter 2 aimed to establish a protocol for callus formation in root explants of P. morifolia, perform phytochemical analysis in callus undergoing treatment with UV-B light and perform phytochemical analysis in different organs of greenhouse-grown and in vitro-grown plants under LED illumination. Phytochemical differences between greenhouse plants and in vitro plants were detected by thin layer chromatography. Flavonoids were easily observed in leaves of plants in both culture conditions, except calluses. High performance liquid chromatography identified isovitexin as the flavonoid present with greater intensity in leaves and stems of greenhouse-grown plants. Other flavonoids were identified in other organs of plants under both culture conditions, with the exception of calluses. Differences in the antioxidant activity between greenhouse plants and in vitro plants were detected, contrary to that found for calluses treated with UV-B when compared with the control. The present study showed the versatility of P. morifolia roots for callus formation and embryogenesis and the possibility of secondary metabolite production in in vitro plants grown under LED illumination. / Tese enviada pela secretaria do curso por e-mail, em 28-03-17.