Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2017. / Texto parcialmente liberado pelo autor.Conteúdo liberado: Introdução geral,resumos e referências. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-22T20:41:00Z No. of bitstreams: 1 2017_RaphaelFerreiraAlmeida.pdf: 4925764 bytes, checksum: 3191eb7b6050ba8790cc9ecea687f852 (MD5) / Rejected by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br), reason: Boa tarde, Trata-se de uma publicação parcial. Por favor, seguir as normas da publicação. Atenciosamente, on 2017-06-06T21:17:21Z (GMT) / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-06T17:55:33Z No. of bitstreams: 1 2017_RaphaelFerreiraAlmeida_PARCIAL.pdf: 704720 bytes, checksum: 78fed5d092c3e4b2ba69f0d7e9591c9d (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-05T17:28:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_RaphaelFerreiraAlmeida_PARCIAL.pdf: 704720 bytes, checksum: 78fed5d092c3e4b2ba69f0d7e9591c9d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-05T17:28:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_RaphaelFerreiraAlmeida_PARCIAL.pdf: 704720 bytes, checksum: 78fed5d092c3e4b2ba69f0d7e9591c9d (MD5) Previous issue date: 2017-10-05 / O presente trabalho objetiou avaliar respostas de genitores Pisifera de dendezeiros (Elaeis guineensis Jacq.) quanto à capacidade de regeneração de plantas por embriogênese somática (ES), além de identificar proteínas envolvidas durante o processo de aquisição de competência embriogênica em híbridos Tenera contrastantes para a embriogênese somática. Num primeiro experimento, explantes foliares de quatro genótipos adultos de dendezeiro da variedade Pisifera (A251424, A251427, A251512 e A251513) foram submetidos à indução de ES utilizando-se o meio de indução (MI), composto pelos sais e vitaminas de Murashige e Skoog (MS), suplementado com 30 g.L-1 de sacarose, 0,5 g.L-1 de glutamina, 0,5 g.L-1 de caseína hidrolisada, 2,5 g.L-1 de carvão ativado, 450 µM de Picloram e gelificado com 2,5 g.L-1 de phytagel. O material permaneceu nesta condição por 360 dias, com subcultivos a cada 150 dias. Posteriormente, o material foi transferido para o meio de multiplicação de calos (MM), composto por 40 µM de Picloram, 10 µM de 2-isopenteniladenina (2iP) e 2,5 g.L-1 de phytagel, onde permaneceu por mais 90 dias. Em seguida, os calos foram colocados em meio de diferenciação (MD) formado por 12,3 µM de 2iP, 0,54 µM de ácido naftalenoacético (ANA) e de 2,5 g.L-1 de phytagel. Depois de diferenciados, os embriões somáticos foram transferidos para o meio de regeneração, desprovido de reguladores de crescimento e acrescido de 2,5 g.L-1 de phytagel e carvão ativado. Durante todo o processo, o material foi avaliado morfo e histoquimicamente para melhor caracterizar as etapas. Num segundo experimento, a proteômica diferencial de dois híbridos Tenera var. B351733 (responsivo à ES) e var. B352933 (não-responsivo à ES) foi avaliada durante o processo inicial (14 dias) e tardio (150 dias) da aquisição de competência embriogênica em dendezeiro, etapas caracterizadas pelo início de formação de calo primário e calo embriogênico, respectivamente. As proteínas extraídas foram quantificadas por Bradford e analisadas por eletroforese bidimensional (2-DE). Proteínas consideradas diferenciais pelo programa de análise de imagem Image Master Platinum foram identificadas por espectrometria de massa. A sequência foi obtida no banco NCBI por meio do GI (Gene Identifier) de cada proteína identificada nestes tempos. Com as sequências, adicionalmente foi realizada a anotação funcional destas proteínas nas plataformas AgBase e Revigo, sendo o gene onthology (GO) de cada proteína obtido. A partir dos dados também foram gerados gráficos dos processos biológicos em cada tempo. Verificou-se que o genótipo Pisifera A251424 foi o mais responsivo ao processo de ES quando comparado aos demais, com maior formação de calos ao longo do tempo (45%). Na etapa MM, calos com até 10,6 mg de massa fresca foram os que apresentaram maior incremento de biomassa em relação aos calos de maior peso inicial. Com 90 dias em meio MD, calos embriogênicos se diferenciaram em embriões somáticos e até 130 dias após, clusteres de embriões somáticos surgiram nesta condição. Nas análises morfo-anatômicas e histoquímicas, quatro tipos de calos foram observados na etapa MI, sendo o nodular amarelado, com maior adensamento de amido nesta etapa, o único a progredir até a formação de embriões somáticos. Na análise proteômica das variedades Tenera, 52 proteínas diferencialmente abundantes no tempo 14 dias foram reveladas, incluindo 17 proteínas aumentadas e 14 diminuídas no genótipo responsivo, em relação ao genótipo não-responsivo. Já aos 150 dias de indução, 74 proteínas reguladas foram detectadas, incluindo 19 aumentadas e 13 diminuídas no genótipo responsivo em relação ao não-responsivo. Um total de 40 proteínas exclusivas foram observadas no genótipo responsivo aos 150 dias de indução, enquanto que o genótipo não-responsivo apresentou somente duas. A anotação funcional evidenciou uma menor diversidade dos processos biológicos aos 14 dias para o genótipo responsivo, e aos 150 dias estes processos apresentaram maior diversidade, quando comparados ao não-responsivo. A análise 2-DE e ontologia gênica permitiram a identificação de dez proteínas importantes relacionadas com a aquisição de competência embriogênica, entre elas a isoenzima catalase 2 (spot 254), mono-dehidro-ascorbato-redutase isoforma cloroplástica X2 (spot 150), subunidade beta da pirofosfatofrutose-6-fosfato-1- fosfotransferase (spot 338). De modo geral, os resultados obtidos envolvendo a ES, morfoanatomia, histoquímica e a análise proteômica, aliada à bioinformática (anotação funcional), permitiram compreender melhor a propagação in vitro em dendezeiro, dando novos subsídios para pesquisas futuras rumo a um melhor entendimento sobre os processos de propagação clonal da espécie por embriogênese somática. / The objective of this work was to evaluate the responses of the Pisifera genus of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) regarding the acquisition of embryogenic competence and plant regeneration by somatic embryogenesis (SE) and to identify proteins involved in the process of acquisition of embryogenic competence in Tenera hybrids contrasting as to the embryogenic capacity. In a first experiment, leaf explants of four adult genotypes of oil palm of the Pisifera variety (A251424, A251427, A251512 and A251513) were used for SE induction using the induction medium (IM) composed of salts and vitamins of Murashige e Skoog (MS) and supplemented with 30 gL-1 of sucrose, 0.5 gL-1 of glutamine, 0.5 gL-1 of hydrolyzed casein, 2.5 gL-1 of activated charcoal, 450 μM of Picloram and solidified with 2.5 gL-1 of phytagel. The material remained in this condition for 360 days, being subcultured every 150 days. Subsequently, the material was transferred to calluses multiplication medium (MM) containing 40 μM of Picloram, 10 μM of 2-isopentenyladenine (2iP) and 2.5 gL -1 of phytagel, where it remained for 90 days. Then, calluses were transferred to differentiation medium (DM), composed of 12.3 μM 2iP, 0.54 μM of naphthaleneacetic acid (ANA) and 2.5 gL-1 of phytagel. After differentiation, the somatic embryos were transferred to regeneration medium, without growth regulators and supplemented with 2.5 g.L-1 of phytagel and activated charcoal. Throughout the process, the material was evaluated morphologically and histochemically to better characterize the steps. In a second experiment, differential proteomics of two hybrids of the Tenera variety, B351733 (responsive to SE) and B352933 (non-responsive to SE) were evaluated during the initial (14 days) and late (150 days) process of the acquisition of embryogenic competence in oil palm, steps characterized by the beginning of formation of primary and embryogenic callus, respectively. Proteins extracted were quantified by Bradford assay and analyzed by two-dimensional electrophoresis (2-DE). Differential proteins detected by the Image Master Platinum software were identified by mass spectrometry. The sequence was obtained from NCBI bank by means of the GI (Gene Identifier) of each protein identified at these times. With the sequences, it was performed the functional annotation of these proteins on the AgBase and Revigo platforms, and the gene onthology (GO) of each protein was obtained. The graphics for biological process ES were generated for both genotypes at each time. It was verified that the Pisifera genotype A251424 was the most responsive to the SE process when compared to the others, because it presented greater calluses formation over time (45%). In stage MM, calluses with lower initial weight (up to 10.6 mg) presented a greater increase of fresh biomass in relation to the calluses of greater initial weight. After 90 days on MD medium, embryogenic calluses differentiated into somatic embryos and after 130 days, clusters of somatic embryos appeared on this condition. In the morpho-anatomical and histochemical analyzes, four types of calluses were observed in stage MI, being nodular yellowish with greater starch deposition in this step and proceeded in the stages until formation of somatic embryos. At the proteomic analysis of the Tenera varieties, 52 differentially abundant proteins on time 14 days were revealed, including 17 proteins increased and 14 decreased in the responsive genotype with respect to the non-responsive genotype. Already at 150 days of induction, 74 regulated proteins were detected, including 19 increased and 13 decreased also in the responsive genotype with respect to non-responsive genotype. A total of 40 unique proteins were observed in the responsive genotype at 150 days of induction, while the non-responsive genotype showed only two. The 2-DE analysis and gene ontology allowed the identification of ten important proteins related to the acquisition of embryogenic competence, among them Catalase isozyme 2 (spot 254), Monodehydro ascorbate reductase chloroplastic isoform X2 (spot 150), Pyrophosphatefructose-6-phosphate-1-phosphotransferase subunit beta like (spot 338). In general, the results obtained involving SE, morphology, histochemistry and proteomic analysis, together with bioinformatics (functional annotation), allowed a better understanding of the in vitro propagation of oil palm, giving new subsidies for future research towards a better understanding about the processes of clonal propagation of the species by somatic embryogenesis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-08T20:46:08Z No. of bitstreams: 1 2015_FilipeSathlerMeira_Parcial.pdf: 525021 bytes, checksum: 2bc1cd17f89bb1f5d9a043e3565a1e0a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-08T20:47:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_FilipeSathlerMeira_Parcial.pdf: 525021 bytes, checksum: 2bc1cd17f89bb1f5d9a043e3565a1e0a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-08T20:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_FilipeSathlerMeira_Parcial.pdf: 525021 bytes, checksum: 2bc1cd17f89bb1f5d9a043e3565a1e0a (MD5) / Este trabalho teve como objetivo induzir a embriogênese somática em macaúba a partir de tecidos foliares de plantas adultas, além de elucidar morfoanatomicamente as diferentes etapas envolvidas no processo. Foram utilizadas folhas jovens e não expandidas (palmito) de Acrocomia aculeata, provenientes de plantas adultas. Os explantes foram inoculados em meio de indução de calos, formado pelos sais e vitaminas do meio Y3, adicionado das auxinas 2,4-D e picloram na concentração de 450 µM, além da presença ou ausência de 20 µM de 2iP. Durante a indução, foi avaliada a influência da região do palmito utilizada na formação de calos. Assim, uma vez coletado e desinfestado, os palmitos (30 cm de comprimento) foram subdividido em regiões basal, mediana e apical, todas de igual tamanho (10 cm direção ápice meristemático para o ápice foliar), de onde foram excisados explantes de 1,0 cm2 que foram inoculados em meio de indução. As avaliações sobre a formação, assim como a coleta dos calos formados foram realizadas aos 6, 9 e 12 meses de cultivo. Após cada período de coleta, os calos foram multiplicados por até quatro subcultivos de 30 dias cada em meio de cultura Y3, com 450 µM de picloram, sendo avaliados quanto à taxa de multiplicação e incremento de massa fresca. Para a etapa de diferenciação dos calos embriogênicos em embriões somáticos, três ensaios foram realizados: o primeiro, em meio de cultura Y3 semissólido com de 2,4-D e picloram (0, 10, 20, 40, 80 e 120 µM). No segundo, utilizou-se meio de cultura Y3 líquido sob agitação com 2,4–D (0 ou 5 µM). Por fim, no terceiro avaliou-se a influência do tempo de permanência dos calos em meio líquido. Os embriões somáticos diferenciados foram germinados em meio de cultura Y3, desprovido de reguladores de crescimento. Em todas as etapas do processo embriogênico, a caracterização morfoanatômica das diferentes etapas envolvidas no processo foram realizadas. Verificou-se resultados significativamente superiores quanto à percentagem de formação de calos utilizando a auxina picloram com relação ao 2,4-D em todos as condições testadas. A adição de 2iP ao meio de indução não proporcionou melhoria na formação de calos. Independentemente da região do palmito, os melhores resultados para indução de calos foram observados aos 9 meses em cultivo, com 59,9% dos explantes formando calo. Quando somente a região do palmito foi avaliada, independentemente do tempo da coleta, a mais distal ao meristema foi a que proporcionou maior formação de calos (52,9%). De maneira geral, os tratamentos utilizados para a diferenciação de embriões somáticos dos calos embriogênicos não diferiram nas respostas obtidas, podendo ser considerado um processo lento e irregular, fato também observado durante a etapa de germinação dos embriões somáticos. Durante a avaliação da ontogenia dos calos, foi observado o desenvolvimento de células hipertrofiadas no explante aos 30 dias de cultivo dos explantes foliares em meio de indução. Aos 60 dias de cultivo foram verificados os primeiros sinais visíveis de divisão celular ativa e presença de células indiferenciadas no mesofilo foliar, progredindo até a formação de calos na região do feixe vascular aos 90 dias de cultivo. Os calos primários apresentaram constituição celular meristemática, com células de tamanho reduzido e com razão núcleo:citoplasma elevada. Na fase de multiplicação, observou-se a formação de calos com aspecto nodular amarelo, nodular esbranquiçado ou granular. A linhagem de calos nodulares amarelos apresentou as características anatômicas semelhantes à dos nodulares esbranquiçados, sendo constituído predominantemente por células meristemáticas. Ainda nessa fase, observou-se a formação de embriões somáticos, visualizados em estádio globular. Durante as análises histoquímicas, observou-se que o acúmulo de amido concentrou-se próximo aos centros de intensa divisão celular. No entanto, não foi observada a presença de amido nas linhagens de calos e embriões somáticos. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This work aimed to induce somatic embryogenesis in macaw palm from leaf tissues of adult plants, besides elucidating morpho-anatomically the different stages involved in the process. Young and not expanded (heart of palm) leaves from adult plants of Acrocomia aculeata were used. The explants were cultured on callus induction medium, consisting of salts and vitamins of Y3 medium with 2,4-D and picloram at 450 µM, alone or in combination with 20 µM 2iP. During induction the influence of the heart of palm region used in the calluses formation was also evaluated. Thus, once collected and disinfected, the heart of palm (30 cm length) was divided in basal, middle and apical regions (explant position), all of equal size (10 cm toward apex meristem to the leaf apex), from where explants were excised in 1.0 cm2 and inoculated on callus induction medium. In order to evaluate calluses formation, the isolation and collection of calluses were performed after 6, 9 and 12 months of culture. After each collection period, the calluses were multiplied on Y3 medium supplemented with 450 µM picloram for up to four subcultures of 30 days each. At the end of each period, the multiplication rate and the callus fresh weight were determined. For somatic embryos differentiation, embryogenic calluses were cultured under three condition: Y3 semisolid culture medium with 2,4-D and Picloram (0, 10, 20, 40, 80 and 120 µM); Y3 liquid culture medium with 2,4-D (0 or 5 µM) under agitation; and finally, Y3 liquid medium were the influence of the calluses cultivation time was evaluated. Somatic embryos were regenerated on an Y3 culture medium devoid of growth regulators. During all embryogenic process, the morpho-anatomical characterization of different stages involved in the process was carried out. It was verified significant differences in calluses induction when picloram was used as auxin. The addition of 2iP not provided effects on callus formation. Independently of explant position (basal, middle or apical), the best results for callus induction was observed when explants were maintained for 9 months on culture medium, where 59.9% of explants presented callus formation. When only the explant position was evaluated, the most distal region of the meristem (apical region) proportioned higher callus formation (52.9%). In general, the treatments used for somatic embryos differentiation do not presented differences, suggesting that it is a slow and irregular process, a fact also observed during somatic embryos germination. Detailed morpho-anatomical analysis revealed the development of hypertrophied cells after 30 days of explants culture on callus induction medium. At 60 days the first visible signs of active cell division and the presence of undifferentiated cells were observed in leaf mesophyll, progressing to callus formation in the region of the vascular bundle at 90 days. The primary calluses showed meristematic cell constitution, characterized by small size and a high nucleoplasmic ratio. In the multiplication phase, it was observed the formation of calluses with aspect yellow nodular, whitish granular or nodular. In general, the lineages of yellow nodular calluses showed anatomical features similar to whitish nodular, consisting predominantly of meristematic cells. Still in this phase, it was observed the formation of somatic embryos in the globular stage. Histological analysis revealed starch accumulation near the centers of intense cell division, but not in the lineages of calluses and somatic embryos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 341649.pdf: 2107714 bytes, checksum: 8efc6ba473992f1f1d3712b5e73d4d83 (MD5) Previous issue date: 2016 / A araucária, ou pinheiro-brasileiro (Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze, Araucariaceae) é uma conífera nativa de grande valor econômico e ecológico. Ferramentas biotecnológicas baseadas na embriogênese somática vêm sendo empregadas visando à conservação e o melhoramento da araucária. Culturas embriogênicas desta espécie são normalmente mantidas em suspensões celulares e o tempo ótimo de subcultivo celular necessita ser precisamente determinado. No presente trabalho estudaram-se aspectos do crescimento, da bioquímica, da histoquímica e da proteômica das células de A. angustifolia em sistema de suspensão celular. Culturas embriogênicas foram cultivadas em meio líquido BM modificado, em agitação orbital (aparato Steward). A dinâmica de crescimento celular foi avaliada por meio do volume celular sedimentado, massa fresco, índice mitótico, condutividade e pH do meio. Ainda foram avaliadas o número de PEMs, a histoquímica, viabilidade e morte celular e o proteoma. O maior valor de incremento celular em massa fresca ocorreu na fase exponencial aos 14 dias de cultivo. Ao longo do tempo há redução da viabilidade celular e do pH do meio de cultura. A condutividade e o pH apresentam os menores valores na fase linear de crescimento celular. Sinais de morte celular iniciam após 15 dias de cultivo. Nas culturas embriogênicas foi predominante a presença de PEM III e diferenças histoquímicas foram observadas entre as células embriogênicas e não-embriogênicas. Foram detectadas a expressão de proteínas relacionadas às auxinas, ao citoesqueleto, ao metabolismo geral e às reservas. Finalmente, por apresentar menor estresse associado ao maior incremento de massa fresca, este período foi considerado o mais apropriado para o intervalo de subcultivo das suspensões celulares.<br> / Abstract : Araucaria or Brazilian-pine tree (Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze, Araucariaceae) is a native conifer with great economic and ecological value. Aiming conservation through use, massive propagation protocols based on cell suspension system under somatic embryogenesis route were developed. Nevertheless, the optimal time for subculturing is not yet determined, and cell biology knowledge of A. angustifolia under the cell suspension system is scanty. The present work is a characterization of growth, biochemistry, histochemistry and proteomics of the A. angustifolia cells under cell suspension system. Cell cultures were cultivated in liquid BM modified medium, in orbital agitator (Steward?s apparatus). Cell growth dynamics was evaluated with: cell volume after sedimentation, fresh weight, mitotic index, conductivity, pH, number of PEMs, histochemical tests, viability and cell death, as well as proteomics. Among expressed proteins were auxin related proteins, cytoskeleton, metabolism and storage. Cell viability is lost and the pH becomes acidic with the passage of time. Conductivity and pH have the lowest values at linear phase. Signs of cell death are observed after the 15th day of culturing. Among the cell types the PEMIII is predominant and embryogenic and non-embryogenic cells types differ histochemically. Finally, the highest value of fresh weight increment (139%) was observed at the exponential phase (14 days), thus optimal time for subculturing.

Araucaria angustifolia é a única conífera nativa com importância econômica no Brasil. A espécie está incluída na lista oficial de espécies de plantas ameaçadas de extinção. A embriogênese somática é considerada como uma das ferramentas biotecnológicas mais promissoras na área de biotecnologia de plantas. A identificação de marcadores, que possam ser utilizados, para a seleção de genótipos aptos ao desenvolvimento do embrião somático é altamente desejável, uma vez que o desenvolvimento apropriado do embrião somático é extremamente dependente do genótipo. O presente trabalho teve como objetivo estudar e identificar marcadores bioquímicos e moleculares associados à competência para embriogênese somática em A. angustifolia. Culturas embriogênicas de genótipos com diferentes potenciais embriogênicos apresentaram diferenças nos parâmetros bioquímicos e moleculares avaliados (Poliaminas, expressão dos genes AaSERK1 e AaPP2C, proteoma). O presente trabalho propõe a utilização destes parâmetros como possíveis marcadores do potencial embriogênico no sistema A. angustifolia. / The Araucaria angustifolia is the only native conifer species with economical importance in Brazil. Recently, the species was included in the official list of endangered plant species. Somatic embryogenesis, i.e., in vitro asexual production of embryos is considered one of the most promising biotechnological tools in the area of plant biotechnology. Since the development of somatic embryos is dependent of the genotype, the identification of markers that could be used in the selection of genotypes which can develop somatic embryos is highly desirable. The main objective of the present work is to study and identify biochemical and molecular markers associated with competence for somatic embryogenesis in A. angustifolia. The evaluation of biochemical and molecular aspects (Polyamines, AaSERK1 and AaPP2C gene expression and proteome) indicated differences between embryogenic cultures of genotypes with different embryogenic potential. This work proposes the utilization of these parameters as possible markers of embryogenic potential in the system A. angustifolia.

A cultura do cacaueiro (Theobroma cacao L.) na região sul da Bahia foi dizimada com a introdução do fungo Moniliophthora perniciosa. Novas fontes de resistência têm sido buscadas e alternativas são necessárias para assegurar a produção de cultivares considerando a variabilidade genética do patógeno. A descoberta de genes de resistência e de defesa presumíveis a partir de abordagens genômicas impõe a necessidade de estabelecimento de uma plataforma de análise funcional para comprovar a função dos genes identificados e/ou esclarecimento dos mecanismos envolvidos; isto requer o desenvolvimento de métodos de manipulação e/ou inserção de genes, permitindo a superexpressão ou silenciamento de genes de interesse. Os primeiros cacaueiros transgênicos só foram desenvolvidos a poucos anos, e a eficiência do processo ainda é limitada. Há grande influência genotípica na capacidade embriogênica, que reduz a eficiência de obtenção de transgênicos. Micro-Tom tem sido considerado um modelo para pesquisas em tomateiro, sendo uma cultivar miniatura, ciclo de vida curto, porte reduzido e de fácil transformação. MT pode ser usada no estudo da interação com o fungo M. perniciosa, visto a disponibilidade de isolados do biótipo-S que infectam o tomateiro, assim disponibilizando informações dos mecanismos de defesa do T. cacao a M. perniciosa em um menor tempo, suprindo alguns obstáculos encontrados nas características biológicas do cacaueiro. Considerando que durante a patogênese do cacaueiro, M. perniciosa é capaz de desencadear a morte celular programada no tecido infectado, foi analisada a hipótese de que a expressão de genes anti-apoptóticos diminuiria ou minimizaria os efeitos da infecção, permitindo uma menor susceptibilidade. Para tal, foi clonado o gene da proteína Bax-inhibitor-1, que atua como atenuador basal para a progressão da morte celular, e desenvolvida uma construção. Esse gene havia sido detectado numa biblioteca da interação M. perniciosa x T. cacao e identificado com sequência completa, e foi re-introduzido em tomateiro e cacaueiro sob controle de promotor constitutivo. Para o modelo genético MT, plantas transgênicas contendo Bax-inhibitor-1, SKP1 e Cafeína sintase foram obtidas. Plantas transgênicas de tomateiro contendo o gene Bax-inhibitor-1 foram inoculadas com M. perniciosa e demonstraram redução no número de plantas sintomáticas (40%), quando comparadas as plantas de MT inoculadas com o mesmo patógeno (83%). Esses dados corroboram com resultados das inoculações com os fungos necrotróficos B. cinerea, S. sclerotium e S. rolfsii, sendo que as plantas transgênicas inoculadas também apresentaram contenção dos sintomas dessas doenças, uma redução de 40% da área de infecção em comparação as plantas de MT infectadas. Desse modo, pode-se concluir que o gene Bax-inhibitor-1 em MT agiu de forma basal na atenuação da progressão da morte celular, reduzindo os sintomas da vassoura-de-bruxa, da mesma forma que esse transgene contribuiu na redução dos sintomas do mofo cinza, mofo branco e murcha-de-esclerócio, por conter o crescimento e desenvolvimento dos fungos inoculados em tomateiro. Foi possível otimizar o protocolo de embriogênese somática e de transformação genética de cacaueiro, o que levou a obtenção de plantas transgênicas contendo a construção Bax-inhibitor-1, confirmadas por RTqPCR. Indicando que a abordagem de transformação de cacaueiro está implementada no laboratório, porém a baixa eficiência do processo e o tempo necessário ainda impedem seu uso em larga escala para análise funcional / The cultivation of cocoa (Theobroma cacao L.) in south Bahia was decimated by the introduction of the fungus Moniliophthora perniciosa. New sources of resistance have been sought and alternatives are needed to ensure the production of cultivars considering the genetic variability of the pathogen. The discovery of genes for resistance and defense presumed from genomic approaches makes it necessary the establishment of a platform to verify the function of identified genes and/or the elucidation of the mechanisms involved; this requires the development of methods for manipulating and/or insertion of genes, allowing overexpressing or silencing of genes of interest. The first transgenic cocoa were only developed a few years ago, and the efficiency of the process is still limited. There is an expressive influence of the embryogenic capacity, which reduces the efficiency of obtaining transgenic plants. The cultivar Micro-Tom (MT) is considered a model for research on tomato, since it has a miniature size, short life cycle, and facile genetic transformation. MT can be used to study the interaction with the fungus M. perniciosa, since isolates of biotype-S are able to infect tomato, thus provinding inferences about defense mechanisms of T. cacao to M. perniciosa in a short time, providing some obstacles encountered in biological characteristics of cocoa. Since during the pathogenesis of cocoa, M. perniciosa is able to trigger programmed cell death in infected tissue, it was analyzed the hypothesis that the expression of anti-apoptotic genes diminish or minimize the effects of infection, allowing less susceptibility. To this end, was cloned the protein Bax-inhibitor-1, which acts as a basal attenuator for the progression of cell death, was cloned engineered in a vector for genetic transformation. This gene was detected in a library of interaction M. perniciosa x T. cacao and identified with the complete sequence, and was re-introduced into tomato and cocoa under the control of a constitutive promoter. For the genetic model MT, transgenic plants containing Bax-inhibitor-1, SKP1 and Caffeine synthase were obtained. Transgenic tomato plants containing the gene Bax-inhibitor-1 were inoculated with M. perniciosa and demonstrated a reduction in the number of symptomatic plants (40%) compared MT plants inoculated with the same pathogen (83%). These data corroborate results of inoculations with the necrotroph fungi B. cinerea, S. sclerotium e S. rolfsii. Thus, when transgenic plants were inoculated, it was observed a reduction of 40% in the area of infection, compared to infected MT plants. Taken together, the results indicate that the gene Bax-inhibitor-1 acted in the basal attenuation of progression of cell death in MT, reducing the symptoms of the witches\' broom disease, as well as the symptoms of gray mold, white mold and wilt esclerotia. Moreover it was possible to optimize the protocol for somatic embryogenesis and genetic transformation of cocoa, which led to the production of transgenic plants containing the construct Baxinhibitor- 1, confirmed by RT-qPCR. Although, a protocol for cocoa transformation was implemented in the laboratory, its the low efficiency and the time required still prevent its widespread use for functional analysis

A teca (Tectona grandis L. f) é uma espécie lenhosa originária da Ásia que possui grande interesse econômico devidos as características nobres de sua madeira. Muito usada para construção de embarcações e móveis de luxo para exposição em ambientes abertos, seu consumo tem aumentado a cada ano, principalmente nos países produtores. Com a pressão das políticas ambientais sobre o uso da madeira de espécies nativas, a teca se mostra uma ótima alternativa para o mercado de madeira serrada. Contudo, a produção comercial desta espécie encontra algumas barreiras, sendo a principal delas, a propagação de matrizes adultas cujas características se adequam ao manejo silvicultural. Para possibilitar a reprodução fiel das árvores selecionadas e, para se realizar o rejuvenescimento do material adulto procedente dessas matrizes, faz-se uso de algumas técnicas, sendo uma delas, o uso da cultura de tecidos. Uma maneira bastante considerada no processo de rejuvenescimento e obtenção de mudas de espécies agrícolas e florestais é a formulação de protocolos de embriogênese somática. A embriogênese somática pode ser descrita como o processo pelo qual células somáticas desenvolvem estruturas semelhantes a embriões zigóticos, por meio de uma sequência ordenada de estágios embriogênicos característicos, sem ocorrência de fusão de gametas. Para tanto, o desenvolvimento de um protocolo eficiente de tal técnica exige muitos estudos preliminares. Com isso, o presente trabalho teve como objetivo estudar a calogênese em diferentes explantes de teca, através de uma sequência de indução utilizando difrentes fitorreguladores visando a obtenção de embriões somáticos. Para avaliar a resposta dos calos a cada etapa da indução foram realizadas análises histológica e histoquímica dos tecidos. Como respostas foram encontrados os balanços auxina/citocinina mais adequado para produção de calos, sendo eles 1,5/1,0 e, 1,5/4,0mgL-1 de picloram e BAP respectivamente. Verificou-se que o pulse com TDZ foi responsivo na obtenção de massas próembriogênicas, e que o uso da zeatina e da glutamina, não favorecem a maturação de tais estruturas, além de ocasionarem a morte celular programada das células da massa calosa. Contudo, os resultados mostram-se positivos e auxiliam na formulação de novos tratamentos e técnicas de indução da embriogênese somática para a espécie estudada. / Teak (Tectona grandis L. f) is a native woody species from Asia that has great economic interest due the noble characteristics of its wood. Widely used for building ships and luxury furniture for display outdoors, their consumption has increased every year, especially in producing countries. With the pressure of environmental policies on the use of native species of wood, teak shown a great alternative to the market for lumber. However, commercial production of this species has some barriers, the main one, being the propagation of mature breeders whose characteristics are suited to forestry management. In order to enable the faithful reproduction of the selected trees, and to perform the rejuvenation of these matrices derived of adult material, some techniques can be used, one of them is the use of tissue culture. Considered in a way quite rejuvenating and seedlings of agricultural and forest species process is the formulation of somatic embryogenesis protocols. Somatic embryogenesis can be described as the process by which somatic cells develop structures similar to zygotic embryos, through an ordered sequence of characteristic embryogenic stages without occurrence of the fusion of gametes. Thus, the development of an efficient protocol for this technique requires a lot of preliminary studies. Thus, the present work aimed to study the callus induction in different explants of teak, through a sequence induction using different growth regulators in order to obtain somatic embryos. To assess the response of each stage during callus induction, histological and histochemical tissue analysis were performed. Responses as the most suitable for callus production auxin / cytokinin balance sheets were found, they 1.5 / 1.0 and 1.5 / 4,0mgL-1 picloram/BAP, respectively. It was found that TDZ pulse was responsive to obtain pro-embryogenic masses, and that the use of zeatin and glutamine, are not conducive to maturation of such structures, and enacting the programmed cell death of the cell calli mass. However, the results show up positive and assist in the formulation of new treatments and techniques for induction of somatic embryogenesis of this species.

A regeneração de plantas, por organogênese ou embriogênese somática, a partir do cultivo de células e tecidos vegetais in vitro é a base para a utilização da biotecnologia no melhoramento. Realizaram-se estudos com cinco cultivares de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), Pêra, Natal, Lima Verde, Hamlin e Westin. Este trabalho objetivou a avaliação da eficiência de isolamento de protoplastos das cultivares de laranja doce; o estudo da eficiência de plaqueamento em função de cinco densidades de protoplastos e diferentes meios de cultura e avaliação da embriogênese somática em função da composição dos meios de cultura e concentração da fonte de carboidrato. As soluções enzimáticas testadas para o isolamento de protoplastos foram: 1. Grosser e Chandler (1987), composta de 1% de celulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R- 10 (Yakult Honsha) e 0,2% de pectoliase Y-23 (Seishin); 2. Grosser e Chandler (1987) modificado, composta de 1% de celulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R-10 (Yakult Honsha); 3. Solução enzimática composta de 4% de celulase Onozuka R-10 (Yakult), 1% macerase R-10. O plaqueamento dos protoplastos foi realizado em cinco densidades, 2 x 104, 5 x 104; 105; 2x 105 e 3 x 105 protoplastos . mL-1,nos meios de cultura EME 0,7M, BH3 0,7M e BH3 + EME 0,7M em ausência de luz, a 25 ± 1 ºC. A solução enzimática 2 proporcionou um maior rendimento no isolamento de protoplastos das cultivares Hamlin, Natal e Pera e solução enzimática 1 foi melhor para a cultivar Westin. A eficiência final de plaqueamento avaliada aos 90 dias foi superior nas densidades de de 3 x 105 e 2 x 105 protoplastos. mL-1 para as cultivares Hamlin, Natal e Lima Verde, e na densidade de 2 x 105 e 105 protoplastos. mL-1 para a cultivar Westin. A indução da embriogênese somática ocorreu em meio de cultura MT modificado com 500 mg.L-1 de extrato de malte, acrescido de sacarose, galactose, glicose, sorbitol, lactose e maltose, nas concentrações de 18, 37, 75, 110 e 150 mM à temperatura de 27 °C. A formação de embriões somáticos variou com o genótipo, sendo a cultivar Lima Verde e Westin apresentaram menor número de embriões somáticos. As melhores fontes de carboidratos foram a maltose, seguida pela lactose nas concentrações de 37 e 75 mM para a cultivar Pêra, 37 mM para a cultivar Natal e 37, 75 e 110 mM para a cultivar Hamlin. / Plant regeneration, by organogenesis or somatic embryogenesis from cell cultures and in vitro plant tissue culture is the basis for the use of biotechnology in plant breeding. Studies were conducted with five cultivars of sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck), Pêra, Natal, Lima Verde, Hamlin and Westin. This work aimed to evaluate the isolation efficiency of protoplasts, to evaluate platting efficiency of protoplasts based on five densities of cells and different culture media and to evaluate somatic embryogenesis based on culture medium composition and concentration. The enzymatic solutions tested were: 1. Grosser and Chandler (1987): 1% de cellulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R-10 (Yakult Honsha) and 0,2% de pectoliase Y-23 (Seishin); 2. Grosser and Chandler (1987) modified: 1% de cellulase Onozuka RS (Yakult) and 1% macerase R-10 (Yakult Honsha); 3. Enzimatic solution containing 4% cellulase Onozuka R-10 (Yakult) and 1% macerase R-10. Protoplasts were cultured at densities of 2 x 104; 5 x 104; 105; 2 x 105 e 3 x 105 protoplasts.mL-1 in EME 0,7M, BH3 0,7M and BH3 + EME 0,7M, in the dark, at 25 ± 1 ºC. The enzymatic solution 2 provided higher yield for the cultivars Hamlin, Natal and Pêra, and enzymatic solution 1 resulted in better protoplast isolation for cultivar Westin. Final platting efficiency, evaluated 90 days after culture, was higher at the densities of 3 x 105 e 2 x 105 protoplasts.mL-1 for Hamlin, Natal and Lima Verde, and at the density of 2 x 105 e 105 protoplasts.mL-1 for Westin. Somatic embryogenesis stimulation occurred in cultured medium MT (MURASHIGE AND TUCKER, 1969) modified with 500 mg. L-1 of malt extract, supplemented with sucrose, galactose, glucose, maltose, lactose and sorbitol at concentrations of 18, 37, 75, 110 and 150 mM, at 27 ± 1 ºC. Somatic embryos produced varied with the genotype, the smaller number of somatic embryos was observed in cultivars Lima Verde and Westin. The best source of carbohydrate were maltose, followed by lactose at concentrations of 37 and 75 mM for cultivar Pêra, 37 mM for cultivar Natal, and 37, 75 and 110 mM for cultivar Hamlin.

A embriogênese somática é uma técnica alternativa com potencial aplicação na propagação clonal de plantas, além de ser uma excelente ferramenta para estudos básicos e análise dos eventos moleculares e bioquímicos que ocorrem durante a embriogênese vegetal. Contudo, apesar de várias pesquisas relativas a embriogênese somática, a falta de conhecimento sobre os fatores que controlam o fenômeno, comprova que existem ainda muitos pontos a serem entendidos sobre o processo. Deste modo, o presente estudo foi concebido com o intuito de estudar a embriogênese somática de duas espécies de citros, as quais apresentam diferentes graus de eficiência na produção de embriões somáticos. Inicialmente, buscou-se avaliar comparativamente o processo de embriogênese somática de duas espécies de citros, observando-se as diferenças estruturais através de análises histológicas e histoquímicas, e as diferenças na expressão do gene AtSERK1 nos calos, através de hibridização in situ. Para instalação dos experimentos, foram utilizados calos provenientes de nucelos de duas espécies, Citrus sinensis L. Osbeck, variedade Valência, e Citrus limonia Osbeck, variedade limão ‘Cravo’. Amostras de calos em meio de multiplicação, em meio de obtenção de embriões, e embriões somáticos nas diferentes fases de desenvolvimento foram coletados para observações anatômicas e histoquímicas através de microscopia óptica e realização de estudo da expressão gênica através de hibridização in situ. Com relação à morfologia, os principais resultados obtidos demonstraram que existem diferenças anatômicas e histoquímicas entre calos de limão ‘Cravo’ e ‘Valência’. Em relação à expressão gênica, os resultados evidenciaram a expressão do gene AtSERK1 em calos das duas espécies de citros, tanto em meio de multiplicação, com sacarose, como em meio de indução, com maltose, indicando que o potencial embriogênico já está instalado no calo em meio de multiplicação. Pode-se concluir também que este gene é conservado entre Arabidopsis e Citrus. Desenvolveram-se, também, experimentos para estudar os efeitos de alguns tratamentos (frio, dessecação, agrupamentos celulares) na otimização da indução e sincronização da embriogênese somática de C. sinensis, var. Valência. Neste sentido, calos nucelares de laranja ‘Valência’, procedentes do meio de multiplicação foram mantidos no mesmo meio líquido em agitador orbital a 200 rpm durante 24h e posteriormente peneirados de acordo com os tratamentos. As peneiras utilizadas apresentaram malhas de 150 µm (P1), 300 µm (P2) e 600 µm (P3). Além do efeito das peneiras também foram observados os efeitos de exposição ao frio (4 o C por quatro semanas, ausência de luz) e dessecação (27 o C, em placas de Petri na ausência de meio de cultura, seis dias, ausência de luz), sendo posteriormente mantidos em B.O.D., a 26 ± 1 o C e intensidade luminosa de 300 lux. Os resultados obtidos permitiram concluir que em relação ao desenvolvimento e produção de embriões somáticos o fator peneira foi superior ao fator estresse na freqüência embriogênica. O desenvolvimento de embriões somáticos em Citrus sinensis ocorre mais eficientemente a partir de agrupamentos celulares de tamanhos específicos. / Somatic embryogenesis is an alternative technique with potential application for clonal propagation of plants, and an excellent tool for basic studies and analysis of the molecular and biochemical events that occur during embryogenesis. However, although many studies have been done, the factors that control somatic embryogenesis are not completely understood. Thus, the present study proposes to evaluate aspects of somatic embryogenesis of two citrus species, which differ in efficiency for the production of somatic embryos. Initially, a comparison of the embryogenic process was done in terms of structural and histochemical analysis and evaluation of the expression of the gene AtSERK1 in callus cultures through in situ hybridization. For the experiments, callus cultures obtained from nucelli of two species, Citrus sinensis L. Osbeck, cv. Valencia, and Citrus limonia Osbeck, cv. Rangpur lime were used for anatomical and histochemical observations, callus samples from cultures in multiplication medium, in embryo induction medium, and somatic embryos in different stages of development were collected. Callus and embryo samples were also collected for analysis of gene expression through in situ hybridization. The anatomical and histochemical analysis showed differences between Rangpur lime and Valencia callus cultures. The in situ hybridization results evidenced the expression of the gene AtSERK1 in cultures of both citrus species, and also in both culture conditions: multiplication medium, with sucrose, and embryo induction medium, with maltose, indicating that the embriogenic potential is already installed in the callus cultures in multiplication medium. The results also lead to the conclusion that the gene is conserved between Arabidopsis thaliana and Citrus. Experiments aiming to synchronize the somatic embryogenesis formation in C. sinensis, cv. Valencia, were installed testing the effect of cold, desiccation and cell cluster size on somatic embryo formation. For that, callus cultures of ‘Valência’ sweet orange were cultivated in liquid medium in an orbital shaker, at 200 rpm, for 24h, and sieved through the following screens: 150 µm (P1), 300 µm (P2) and 600 µm (P3). The cell aggregates were then exposed to cold (4 o C, for four weeks, in the dark) and desiccation (27 o C, in Petri plates without culture medium, six days, in the dark) treatments, and cultured in incubators at 26 ± 1 o C and 300 lux of light intensity. The results lead to the conclusion that the separation of cultures in clusters of different sizes and the stress treatments were effective for synchronization and embryogenesis frequency. The size of cell clusters was the most important factor.

A regeneração de plantas, por organogênese ou embriogênese somática, a partir do cultivo de células e tecidos vegetais in vitro é a base para a utilização da biotecnologia no melhoramento. Realizaram-se estudos com cinco cultivares de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), Pêra, Natal, Lima Verde, Hamlin e Westin. Este trabalho objetivou a avaliação da eficiência de isolamento de protoplastos das cultivares de laranja doce; o estudo da eficiência de plaqueamento em função de cinco densidades de protoplastos e diferentes meios de cultura e avaliação da embriogênese somática em função da composição dos meios de cultura e concentração da fonte de carboidrato. As soluções enzimáticas testadas para o isolamento de protoplastos foram: 1. Grosser e Chandler (1987), composta de 1% de celulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R- 10 (Yakult Honsha) e 0,2% de pectoliase Y-23 (Seishin); 2. Grosser e Chandler (1987) modificado, composta de 1% de celulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R-10 (Yakult Honsha); 3. Solução enzimática composta de 4% de celulase Onozuka R-10 (Yakult), 1% macerase R-10. O plaqueamento dos protoplastos foi realizado em cinco densidades, 2 x 104, 5 x 104; 105; 2x 105 e 3 x 105 protoplastos . mL-1,nos meios de cultura EME 0,7M, BH3 0,7M e BH3 + EME 0,7M em ausência de luz, a 25 ± 1 ºC. A solução enzimática 2 proporcionou um maior rendimento no isolamento de protoplastos das cultivares Hamlin, Natal e Pera e solução enzimática 1 foi melhor para a cultivar Westin. A eficiência final de plaqueamento avaliada aos 90 dias foi superior nas densidades de de 3 x 105 e 2 x 105 protoplastos. mL-1 para as cultivares Hamlin, Natal e Lima Verde, e na densidade de 2 x 105 e 105 protoplastos. mL-1 para a cultivar Westin. A indução da embriogênese somática ocorreu em meio de cultura MT modificado com 500 mg.L-1 de extrato de malte, acrescido de sacarose, galactose, glicose, sorbitol, lactose e maltose, nas concentrações de 18, 37, 75, 110 e 150 mM à temperatura de 27 °C. A formação de embriões somáticos variou com o genótipo, sendo a cultivar Lima Verde e Westin apresentaram menor número de embriões somáticos. As melhores fontes de carboidratos foram a maltose, seguida pela lactose nas concentrações de 37 e 75 mM para a cultivar Pêra, 37 mM para a cultivar Natal e 37, 75 e 110 mM para a cultivar Hamlin. / Plant regeneration, by organogenesis or somatic embryogenesis from cell cultures and in vitro plant tissue culture is the basis for the use of biotechnology in plant breeding. Studies were conducted with five cultivars of sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck), Pêra, Natal, Lima Verde, Hamlin and Westin. This work aimed to evaluate the isolation efficiency of protoplasts, to evaluate platting efficiency of protoplasts based on five densities of cells and different culture media and to evaluate somatic embryogenesis based on culture medium composition and concentration. The enzymatic solutions tested were: 1. Grosser and Chandler (1987): 1% de cellulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R-10 (Yakult Honsha) and 0,2% de pectoliase Y-23 (Seishin); 2. Grosser and Chandler (1987) modified: 1% de cellulase Onozuka RS (Yakult) and 1% macerase R-10 (Yakult Honsha); 3. Enzimatic solution containing 4% cellulase Onozuka R-10 (Yakult) and 1% macerase R-10. Protoplasts were cultured at densities of 2 x 104; 5 x 104; 105; 2 x 105 e 3 x 105 protoplasts.mL-1 in EME 0,7M, BH3 0,7M and BH3 + EME 0,7M, in the dark, at 25 ± 1 ºC. The enzymatic solution 2 provided higher yield for the cultivars Hamlin, Natal and Pêra, and enzymatic solution 1 resulted in better protoplast isolation for cultivar Westin. Final platting efficiency, evaluated 90 days after culture, was higher at the densities of 3 x 105 e 2 x 105 protoplasts.mL-1 for Hamlin, Natal and Lima Verde, and at the density of 2 x 105 e 105 protoplasts.mL-1 for Westin. Somatic embryogenesis stimulation occurred in cultured medium MT (MURASHIGE AND TUCKER, 1969) modified with 500 mg. L-1 of malt extract, supplemented with sucrose, galactose, glucose, maltose, lactose and sorbitol at concentrations of 18, 37, 75, 110 and 150 mM, at 27 ± 1 ºC. Somatic embryos produced varied with the genotype, the smaller number of somatic embryos was observed in cultivars Lima Verde and Westin. The best source of carbohydrate were maltose, followed by lactose at concentrations of 37 and 75 mM for cultivar Pêra, 37 mM for cultivar Natal, and 37, 75 and 110 mM for cultivar Hamlin.

A embriogênese somática é uma técnica alternativa com potencial aplicação na propagação clonal de plantas, além de ser uma excelente ferramenta para estudos básicos e análise dos eventos moleculares e bioquímicos que ocorrem durante a embriogênese vegetal. Contudo, apesar de várias pesquisas relativas a embriogênese somática, a falta de conhecimento sobre os fatores que controlam o fenômeno, comprova que existem ainda muitos pontos a serem entendidos sobre o processo. Deste modo, o presente estudo foi concebido com o intuito de estudar a embriogênese somática de duas espécies de citros, as quais apresentam diferentes graus de eficiência na produção de embriões somáticos. Inicialmente, buscou-se avaliar comparativamente o processo de embriogênese somática de duas espécies de citros, observando-se as diferenças estruturais através de análises histológicas e histoquímicas, e as diferenças na expressão do gene AtSERK1 nos calos, através de hibridização in situ. Para instalação dos experimentos, foram utilizados calos provenientes de nucelos de duas espécies, Citrus sinensis L. Osbeck, variedade Valência, e Citrus limonia Osbeck, variedade limão ‘Cravo’. Amostras de calos em meio de multiplicação, em meio de obtenção de embriões, e embriões somáticos nas diferentes fases de desenvolvimento foram coletados para observações anatômicas e histoquímicas através de microscopia óptica e realização de estudo da expressão gênica através de hibridização in situ. Com relação à morfologia, os principais resultados obtidos demonstraram que existem diferenças anatômicas e histoquímicas entre calos de limão ‘Cravo’ e ‘Valência’. Em relação à expressão gênica, os resultados evidenciaram a expressão do gene AtSERK1 em calos das duas espécies de citros, tanto em meio de multiplicação, com sacarose, como em meio de indução, com maltose, indicando que o potencial embriogênico já está instalado no calo em meio de multiplicação. Pode-se concluir também que este gene é conservado entre Arabidopsis e Citrus. Desenvolveram-se, também, experimentos para estudar os efeitos de alguns tratamentos (frio, dessecação, agrupamentos celulares) na otimização da indução e sincronização da embriogênese somática de C. sinensis, var. Valência. Neste sentido, calos nucelares de laranja ‘Valência’, procedentes do meio de multiplicação foram mantidos no mesmo meio líquido em agitador orbital a 200 rpm durante 24h e posteriormente peneirados de acordo com os tratamentos. As peneiras utilizadas apresentaram malhas de 150 µm (P1), 300 µm (P2) e 600 µm (P3). Além do efeito das peneiras também foram observados os efeitos de exposição ao frio (4 o C por quatro semanas, ausência de luz) e dessecação (27 o C, em placas de Petri na ausência de meio de cultura, seis dias, ausência de luz), sendo posteriormente mantidos em B.O.D., a 26 ± 1 o C e intensidade luminosa de 300 lux. Os resultados obtidos permitiram concluir que em relação ao desenvolvimento e produção de embriões somáticos o fator peneira foi superior ao fator estresse na freqüência embriogênica. O desenvolvimento de embriões somáticos em Citrus sinensis ocorre mais eficientemente a partir de agrupamentos celulares de tamanhos específicos. / Somatic embryogenesis is an alternative technique with potential application for clonal propagation of plants, and an excellent tool for basic studies and analysis of the molecular and biochemical events that occur during embryogenesis. However, although many studies have been done, the factors that control somatic embryogenesis are not completely understood. Thus, the present study proposes to evaluate aspects of somatic embryogenesis of two citrus species, which differ in efficiency for the production of somatic embryos. Initially, a comparison of the embryogenic process was done in terms of structural and histochemical analysis and evaluation of the expression of the gene AtSERK1 in callus cultures through in situ hybridization. For the experiments, callus cultures obtained from nucelli of two species, Citrus sinensis L. Osbeck, cv. Valencia, and Citrus limonia Osbeck, cv. Rangpur lime were used for anatomical and histochemical observations, callus samples from cultures in multiplication medium, in embryo induction medium, and somatic embryos in different stages of development were collected. Callus and embryo samples were also collected for analysis of gene expression through in situ hybridization. The anatomical and histochemical analysis showed differences between Rangpur lime and Valencia callus cultures. The in situ hybridization results evidenced the expression of the gene AtSERK1 in cultures of both citrus species, and also in both culture conditions: multiplication medium, with sucrose, and embryo induction medium, with maltose, indicating that the embriogenic potential is already installed in the callus cultures in multiplication medium. The results also lead to the conclusion that the gene is conserved between Arabidopsis thaliana and Citrus. Experiments aiming to synchronize the somatic embryogenesis formation in C. sinensis, cv. Valencia, were installed testing the effect of cold, desiccation and cell cluster size on somatic embryo formation. For that, callus cultures of ‘Valência’ sweet orange were cultivated in liquid medium in an orbital shaker, at 200 rpm, for 24h, and sieved through the following screens: 150 µm (P1), 300 µm (P2) and 600 µm (P3). The cell aggregates were then exposed to cold (4 o C, for four weeks, in the dark) and desiccation (27 o C, in Petri plates without culture medium, six days, in the dark) treatments, and cultured in incubators at 26 ± 1 o C and 300 lux of light intensity. The results lead to the conclusion that the separation of cultures in clusters of different sizes and the stress treatments were effective for synchronization and embryogenesis frequency. The size of cell clusters was the most important factor.