Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-11-24 / O ultrassom (US) vem sendo amplamente utilizado para melhorar a eficiência de transfecção de vetores não-virais. No entanto, o mecanismo pelo qual o US promove a entrega de DNA nas células ainda é pouco entendido. Este fenômeno é normalmente atribuído a sonoporação. Porém, com base em experimentos anteriores realizados em nosso laboratório, suspeitamos que outro mecanismo esteja envolvido no processo de captação de DNA. Para estudar o mecanismo de entrega, um vetor plasmideal expressando EGFP (pEGFP-N3, 4,7 kb) foi utilizado para transfectar células NIH3T3 com um aparelho de US terapêutico sem a adição de microbolhas. Em condições de insonação de 2 W/cm2, duty cycle de 20% por 30s o US promoveu cerca de 40% de eficiência de transfecção, mas com 1 W/cm2 resultou em níveis muito baixos de transfecção. Fixados esses parâmetros, também foi avaliada a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o aumento da concentração intracelular de cálcio ([Ca2+]i) e as alterações no potencial de membrana através de microscopia confocal. A produção de ROS foi aumentada durante a insonação, sendo interrompida logo que o US foi desligado. A [Ca2+]i também foi aumentada durante a exposição ao US, mas seus níveis não retornaram ao basal durante os 3 minutos de observação. Porém, 1 W/cm2 não foi suficiente para mobilizar o cálcio durante a insonação, e o influxo de cálcio teve início apenas 12 segundos após o término do US. Quando expostas ao US, as células também apresentaram mudanças no potencial de membrana atingindo um estado de hiperpolarização, retornando ao estado normal logo que o US foi desligado. A alteração desses três parâmetros pelo US sugere que a entrega de DNA plasmideal deva ocorrer por endocitose. Por fim, utilizando DNA plasmideal fluorescente, mostramos que esta molécula entra na célula via endocitose mediada por clatrina. / Ultrasound (US) has been widely used to improve the efficiency of non-viral vector transfection. However, the mechanism that enables the uptake of plasmid DNA in cells by US insonation is poorly understood, but it is typically attributed to sonoporation. Based on our previous results, we hypothesized that other mechanisms, such as endocytosis, are involved in this process. To explore the mechanism of plasmid DNA uptake, a plasmid vector expressing EGFP (pEGFP-N3: 4.7 kb) was used to transfect NIH3T3 cells using a therapeutic US without microbubbles and was monitored in real-time using a confocal microscope. We achieved about 40% transfection efficiency when we applied 2 W/cm2 with 20% of duty-cycle for 30 s, but 1 W/cm2 resulted in a very low level of transfection. In these experiments, the production of reactive oxygen species was augmented during the insonation but was stopped soon after turning off the US. Calcium influx was also augmented during the insonation, but its level did not return to basal levels following the 3-min observation period. However, 1 W/cm2 was not sufficient to mobilize calcium influx during the insonation, and calcium influx began 12 s after turning off the US. US insonation also changed the cell membrane potential to promote a hyperpolarization state, which returned to the normal state soon after turning off the US. The alteration of these parameters by US indicates the uptake of plasmid DNA by endocytosis. Finally, using a fluorescently labeled plasmid, we showed that this molecule enters into cells via clathrin-mediated endocytosis, not via caveolin-1. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Asbestos é um termo geral usado comercialmente para descrever minerais fibrosos de silicato. A fibra mais utilizada até hoje é denominada crisotila, com uso considerado seguro. Embora, fragmentos menores podem permanecer por longo tempo em tecidos pulmonares. As fibras de crisotila, assim como as demais fibras de asbestos, possuem sílica na sua composição e podem ser fagocitadas com a participação de receptores scavenger. Este trabalho teve como objetivo o estudo de mecanismos de interação e de internalização das pequenas fibras de crisotila em duas linhagens celulares. Uma análise por microscopia confocal de varredura a laser e microscopia eletrônica de transmissão foi realizada e observou-se que ambas as linhagens são capazes de internalizar fibras, que apresentavam livres ou envoltas pela membrana plasmática. A presença de elementos do citoesqueleto próximos às fibras de crisotila foi verificada, assim como alterações no nível de expressão de alguns desses elementos. Dentro deste contexto, a participação de receptores no processo de internalização de fibras de crisotila também foi estudada e verificamos que esses receptores podem estar envolvidos de alguma forma com o processo de internalização de fibras de crisotila. / Asbestos is a term used commercially to describe silicate minerals. Chrysotile is the most used fiber until today and it is considered safe. However, smaller fragments can be found in lung tissues for a long period of time. Chrysotile fibers, as other asbestos fibers, are composed by silica and may be phagocyted with the participation of scavenger receptors. This studys goal was to study the interaction an internalization mechanisms of small chrysotile fibers in two cell lineages. Confocal laser scan microscopy analysis and electronic microscopy transmission analysis were conducted in both lineages, that showed capable of internalize fibers, that were involved or not by cell membrane. Cytoeskeleton elements presence near the fibers was verified and there were also changes in expression levels these elements. In this context, the participation of scavenger receptors in the internalization process of chrysotile fibers was also studied, and we verified that these receptors may be associated to the internalization process of chrysotile fibers.

As doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade no mundo. A aterosclerose é a base fisiopatológica dessas doenças, sendo definida como um processo crônico-inflamatório multifatorial, resultando da interação de diferentes células como linfócitos, macrófagos, células endoteliais e células musculares lisas na parede arterial. A lipoproteína de baixa densidade eletronegativa [LDL(-)], uma subfração modificada da LDL nativa, desempenha um papel-chave na aterosclerose, uma vez que as modificações sofridas por esta partícula são capazes de induzir o acúmulo de ésteres de colesterol em macrófagos e a subsequente formação de células espumosas. O sistema imunológico é crucial no processo aterogênico e estratégias terapêuticas direcionadas à imunoregulação deste processo têm sido utilizadas como novas alternativas tanto na prevenção do desenvolvimento quanto da progressão desta doença. Dentre essas estratégias, destaca-se o uso de fragmentos de anticorpos como o scFv (do inglês, single chain fragment variable), que podem ainda estar conjugados a nanopartículas com o intuito de aumentar sua eficiência de ação no organismo. Diante do papel da LDL(-) na aterosclerose, este projeto objetivou avaliar os efeitos in vitro e in vivo de um sistema nanoestruturado contendo fragmentos scFv anti-LDL(-) derivatizados na superfície de nanocápsulas sobre macrófagos murinos e humanos primários e em camundongos knockout para o gene do receptor da LDL (Ldlr-/-) no desenvolvimento e na progressão dessa doença. Demonstrou-se que o tratamento de macrófagos com a formulação scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn diminuiu de forma significativa a captação de LDL(-), assim como a expressão de IL-1β (mRNA e proteína) e MCP-1 (mRNA). Foi demonstrada a internalização da nanoformulação pelos macrófagos via diferentes mecanismos de endocitose, demonstrando seu potencial uso como carreador de fármacos. In vivo, a nanoformulação diminuiu de forma significativa a área da lesão aterosclerótica em camundongos Ldlr-/- submetidos à avaliação pela técnica de tomografia por emissão de pósitrons (do inglês, PET), utilizando o radiotraçador 18F-FDG (18F-desoxiglicose), associada à tomografia computadorizada (CT) com agente de contraste iodado, além da análise morfométrica das lesões no arco aórtico. O conjunto dos resultados obtidos evidenciou a ação ateroprotetora da formulação scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn, reforçando seu potencial como estratégia terapêutica na aterosclerose. / Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. Atherosclerosis is the pathophysiological basis of these diseases, defined as a chronic inflammatory multifactorial process, resulting from the interaction of several cells such as lymphocytes macrophages, endothelial cells and smooth muscle cells within the arterial wall. The electronegative low-density lipoprotein [LDL(-)], a modified subfraction of native LDL, plays a key role in atherosclerosis, since its modifications are capable of inducing the accumulation of cholesteryl esters in macrophages and the subsequent foam cells formation. The immune system is crucial in atherogenic process and therapeutic strategies directed to the immunoregulation of this process have been used as a new alternative in the prevention of the development as well as the progression of this disease. Among these strategies, it is the use of antibody fragments such as scFv (single chain fragment variable), which may be also conjugated to nanoparticles in order to increase their efficiency in the body. Given the role of LDL(-) in atherosclerosis, the aim of this project was to evaluate the in vitro and in vivo effects of a nanostructured system containing scFv anti-LDL(-) fragments derivatized on the surface of nanocapsules on murine and human primary macrophages and in the development and progression of the disease in LDL receptor knockout mice (Ldlr-/-). It was demonstrated that the treatment of macrophages with scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn formulation significantly decreases the uptake of LDL(-) and the expression IL-1β (mRNA and protein) and MCP-1 (mRNA). Moreover, the internalization of the nanoformulation by macrophages through different endocytosis mechanisms was shown, demonstrating its potential use as a nanocarrier. In vivo, the nanoformulation decreased the area of atherosclerotic lesions in Ldlr-/- mice evaluated by positron emission tomography with 18F-FDG associated with computed tomography with iodinated contrast agent (PET/CT), besides the lesion morphometric analysis at the aortic arch Thus, these data provide evidence of the atheroprotection action of the ateroprotection action of the scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn formulation, suggesting its promising use as a therapeutic strategy for atherosclerosis.

O receptor para Angiotensina II tipo 1 (AT1R) é expresso tanto em membrana apical quanto basolateral dos túbulos proximais renais. Embora haja evidências de diferenças funcionais entre receptores apicais e basolaterais, como, por exemplo, a dependência do processo de internalização de receptores apicais, mas não de basolaterais, para a efetivação dos efeitos fisiológicos da Angiotensina II, os mecanismos envolvidos na determinação dessas diferenças não são conhecidos. Alguns trabalhos já evidenciaram a importância da porção c-terminal do receptor AT1 na sua internalização. Desta forma, com o intuito de identificar proteínas de membrana que possam interagir com tal região, foi feita a clonagem do fragmento de DNA correspondente a esta no vetor pGEX-6P-2. O produto da transcrição e tradução do gene foi uma proteína de fusão (GST-AT1aR) que possui em torno de 35kDa, a qual foi imobilizada em resina de glutationa sefarose e incubada com proteínas de membranas totais de córtex renal de ratos (GST pull-down assay). As amostras foram submetidas à Eletroforese Bidimensional, onde identificamos seis spots correspondentes a proteínas que interagem especificamente com a proteína de fusão, mas não com GST. Estes spots foram recortados e analisados por espectrometria de massa. Cinco diferentes proteínas foram identificadas como provavelmente associadas ao receptor AT1aR: ATP sintase subunidade beta, ATP sintase subunidade alfa mitocondrial, GRP78 (heat shock protein de 78kDa regulada por glicose), HSC70 (heat shock protein de 71kDa) e dipeptidil peptidase 4 (DPPIV). Experimentos subsequentes de GST pull-down e western blotting para as proteínas encontradas, confirmaram interação da cauda C-terminal do receptor com as proteínas ATP sintase subunidade beta, HSC70 (heat shock protein de 71kDa) e GRP78 (heat shock protein de 78kDa regulada por glicose). No entanto, nos estudos de co-imunoprecipitação foi possível confirmar apenas a interação com HSC70, um membro da família HPS70, uma heat shock protein. HSP são também chamadas de chaperonas por estarem envolvidas no dobramento correto de proteínas recém sintetizadas, no redobramento de proteína desnaturadas ou dobradas incorretamente e na degradação de proteínas com danos irreparáveis. No entanto, trabalhos recentes descrevem novos papéis para esta proteína, como a participação em processos de tráfego protéico entre compartimentos intracelulares, reciclagem de proteínas para a membrana plasmática e endocitose mediada por clatrina. Novos estudos serão necessários para se determinar a função fisiológica da interação de HSC70 com a cauda citoplasmática do receptor AT1 e ainda, se essa associação estaria envolvida nas diferenças funcionais observadas quando esse receptor é expresso em membrana apical ou basolateral / The angiotensin II receptor type 1 (AT1R) is expressed in both apical and basolateral membranes in the renal proximal tubules. Although there are evidences that they have functional differences, such as the dependence on internalization for apical, but not basolateral, receptors to trigger physiological effects of angiotensin II, the mechanisms of this peculiar behavior are not clear. The carboxy-terminal tail of the AT1 receptor was shown to be involved in its internalization. Thus, in order to identify possible AT1R c-terminal interacting proteins, we have inserted the cDNA coding the last 53 amino acids of the C-terminus into pGEX-6P-2 vector. The gene translation product was a fusion protein (GST-AT1aR) weighting approximately 35 kDa which was immobilized on Glutathione Sepharose resin and incubated with rat renal cortex total membrane proteins (GST pull-down assay). The samples were then subjected to two dimensional gel electrophoresis. We identified six protein spots that specifically interacted with GST-AT1aR. These spots were cut and analyzed by mass spectrometry. Five different proteins were identified as probably associated with AT1aR, ATP synthase beta subunit, ATP synthase alpha subunit, GRP78 (glucose regulated protein of 78kDa), HSC70 (Heat shock cognate 71kDa protein) and dipeptidyl peptidase 4 (DPPIV). The interaction with ATP synthase beta subunit, HSC70 and GRP78 was confirmed by GST pull-down and western blotting. However, immunoprecipitation of total protein of renal cortex followed by immunobloting only confirmed the interaction with HSC70. This protein is a member of the Heat Shock Proteins family HSP70 also called chaperones, because their involvement in correct folding of newly synthesized proteins, refolding of partially denatured or misfolded proteins, and in protein degradation of irreparably damaged proteins. Recent studies have described new roles for HSC70, such as the participation in protein trafficking between intracellular compartments, recycling of proteins to the plasma membrane and endocytosis mediated by clathrin. Further studies are necessary to determine the physiological role of this interaction and whether this association is involved in the functional differences observed regarding the activation of the receptor in apical or basolateral membranes

O receptor para Angiotensina II tipo 1 (AT1R) é expresso tanto em membrana apical quanto basolateral dos túbulos proximais renais. Embora haja evidências de diferenças funcionais entre receptores apicais e basolaterais, como, por exemplo, a dependência do processo de internalização de receptores apicais, mas não de basolaterais, para a efetivação dos efeitos fisiológicos da Angiotensina II, os mecanismos envolvidos na determinação dessas diferenças não são conhecidos. Alguns trabalhos já evidenciaram a importância da porção c-terminal do receptor AT1 na sua internalização. Desta forma, com o intuito de identificar proteínas de membrana que possam interagir com tal região, foi feita a clonagem do fragmento de DNA correspondente a esta no vetor pGEX-6P-2. O produto da transcrição e tradução do gene foi uma proteína de fusão (GST-AT1aR) que possui em torno de 35kDa, a qual foi imobilizada em resina de glutationa sefarose e incubada com proteínas de membranas totais de córtex renal de ratos (GST pull-down assay). As amostras foram submetidas à Eletroforese Bidimensional, onde identificamos seis spots correspondentes a proteínas que interagem especificamente com a proteína de fusão, mas não com GST. Estes spots foram recortados e analisados por espectrometria de massa. Cinco diferentes proteínas foram identificadas como provavelmente associadas ao receptor AT1aR: ATP sintase subunidade beta, ATP sintase subunidade alfa mitocondrial, GRP78 (heat shock protein de 78kDa regulada por glicose), HSC70 (heat shock protein de 71kDa) e dipeptidil peptidase 4 (DPPIV). Experimentos subsequentes de GST pull-down e western blotting para as proteínas encontradas, confirmaram interação da cauda C-terminal do receptor com as proteínas ATP sintase subunidade beta, HSC70 (heat shock protein de 71kDa) e GRP78 (heat shock protein de 78kDa regulada por glicose). No entanto, nos estudos de co-imunoprecipitação foi possível confirmar apenas a interação com HSC70, um membro da família HPS70, uma heat shock protein. HSP são também chamadas de chaperonas por estarem envolvidas no dobramento correto de proteínas recém sintetizadas, no redobramento de proteína desnaturadas ou dobradas incorretamente e na degradação de proteínas com danos irreparáveis. No entanto, trabalhos recentes descrevem novos papéis para esta proteína, como a participação em processos de tráfego protéico entre compartimentos intracelulares, reciclagem de proteínas para a membrana plasmática e endocitose mediada por clatrina. Novos estudos serão necessários para se determinar a função fisiológica da interação de HSC70 com a cauda citoplasmática do receptor AT1 e ainda, se essa associação estaria envolvida nas diferenças funcionais observadas quando esse receptor é expresso em membrana apical ou basolateral / The angiotensin II receptor type 1 (AT1R) is expressed in both apical and basolateral membranes in the renal proximal tubules. Although there are evidences that they have functional differences, such as the dependence on internalization for apical, but not basolateral, receptors to trigger physiological effects of angiotensin II, the mechanisms of this peculiar behavior are not clear. The carboxy-terminal tail of the AT1 receptor was shown to be involved in its internalization. Thus, in order to identify possible AT1R c-terminal interacting proteins, we have inserted the cDNA coding the last 53 amino acids of the C-terminus into pGEX-6P-2 vector. The gene translation product was a fusion protein (GST-AT1aR) weighting approximately 35 kDa which was immobilized on Glutathione Sepharose resin and incubated with rat renal cortex total membrane proteins (GST pull-down assay). The samples were then subjected to two dimensional gel electrophoresis. We identified six protein spots that specifically interacted with GST-AT1aR. These spots were cut and analyzed by mass spectrometry. Five different proteins were identified as probably associated with AT1aR, ATP synthase beta subunit, ATP synthase alpha subunit, GRP78 (glucose regulated protein of 78kDa), HSC70 (Heat shock cognate 71kDa protein) and dipeptidyl peptidase 4 (DPPIV). The interaction with ATP synthase beta subunit, HSC70 and GRP78 was confirmed by GST pull-down and western blotting. However, immunoprecipitation of total protein of renal cortex followed by immunobloting only confirmed the interaction with HSC70. This protein is a member of the Heat Shock Proteins family HSP70 also called chaperones, because their involvement in correct folding of newly synthesized proteins, refolding of partially denatured or misfolded proteins, and in protein degradation of irreparably damaged proteins. Recent studies have described new roles for HSC70, such as the participation in protein trafficking between intracellular compartments, recycling of proteins to the plasma membrane and endocytosis mediated by clathrin. Further studies are necessary to determine the physiological role of this interaction and whether this association is involved in the functional differences observed regarding the activation of the receptor in apical or basolateral membranes

As doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade no mundo. A aterosclerose é a base fisiopatológica dessas doenças, sendo definida como um processo crônico-inflamatório multifatorial, resultando da interação de diferentes células como linfócitos, macrófagos, células endoteliais e células musculares lisas na parede arterial. A lipoproteína de baixa densidade eletronegativa [LDL(-)], uma subfração modificada da LDL nativa, desempenha um papel-chave na aterosclerose, uma vez que as modificações sofridas por esta partícula são capazes de induzir o acúmulo de ésteres de colesterol em macrófagos e a subsequente formação de células espumosas. O sistema imunológico é crucial no processo aterogênico e estratégias terapêuticas direcionadas à imunoregulação deste processo têm sido utilizadas como novas alternativas tanto na prevenção do desenvolvimento quanto da progressão desta doença. Dentre essas estratégias, destaca-se o uso de fragmentos de anticorpos como o scFv (do inglês, single chain fragment variable), que podem ainda estar conjugados a nanopartículas com o intuito de aumentar sua eficiência de ação no organismo. Diante do papel da LDL(-) na aterosclerose, este projeto objetivou avaliar os efeitos in vitro e in vivo de um sistema nanoestruturado contendo fragmentos scFv anti-LDL(-) derivatizados na superfície de nanocápsulas sobre macrófagos murinos e humanos primários e em camundongos knockout para o gene do receptor da LDL (Ldlr-/-) no desenvolvimento e na progressão dessa doença. Demonstrou-se que o tratamento de macrófagos com a formulação scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn diminuiu de forma significativa a captação de LDL(-), assim como a expressão de IL-1β (mRNA e proteína) e MCP-1 (mRNA). Foi demonstrada a internalização da nanoformulação pelos macrófagos via diferentes mecanismos de endocitose, demonstrando seu potencial uso como carreador de fármacos. In vivo, a nanoformulação diminuiu de forma significativa a área da lesão aterosclerótica em camundongos Ldlr-/- submetidos à avaliação pela técnica de tomografia por emissão de pósitrons (do inglês, PET), utilizando o radiotraçador 18F-FDG (18F-desoxiglicose), associada à tomografia computadorizada (CT) com agente de contraste iodado, além da análise morfométrica das lesões no arco aórtico. O conjunto dos resultados obtidos evidenciou a ação ateroprotetora da formulação scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn, reforçando seu potencial como estratégia terapêutica na aterosclerose. / Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. Atherosclerosis is the pathophysiological basis of these diseases, defined as a chronic inflammatory multifactorial process, resulting from the interaction of several cells such as lymphocytes macrophages, endothelial cells and smooth muscle cells within the arterial wall. The electronegative low-density lipoprotein [LDL(-)], a modified subfraction of native LDL, plays a key role in atherosclerosis, since its modifications are capable of inducing the accumulation of cholesteryl esters in macrophages and the subsequent foam cells formation. The immune system is crucial in atherogenic process and therapeutic strategies directed to the immunoregulation of this process have been used as a new alternative in the prevention of the development as well as the progression of this disease. Among these strategies, it is the use of antibody fragments such as scFv (single chain fragment variable), which may be also conjugated to nanoparticles in order to increase their efficiency in the body. Given the role of LDL(-) in atherosclerosis, the aim of this project was to evaluate the in vitro and in vivo effects of a nanostructured system containing scFv anti-LDL(-) fragments derivatized on the surface of nanocapsules on murine and human primary macrophages and in the development and progression of the disease in LDL receptor knockout mice (Ldlr-/-). It was demonstrated that the treatment of macrophages with scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn formulation significantly decreases the uptake of LDL(-) and the expression IL-1β (mRNA and protein) and MCP-1 (mRNA). Moreover, the internalization of the nanoformulation by macrophages through different endocytosis mechanisms was shown, demonstrating its potential use as a nanocarrier. In vivo, the nanoformulation decreased the area of atherosclerotic lesions in Ldlr-/- mice evaluated by positron emission tomography with 18F-FDG associated with computed tomography with iodinated contrast agent (PET/CT), besides the lesion morphometric analysis at the aortic arch Thus, these data provide evidence of the atheroprotection action of the ateroprotection action of the scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn formulation, suggesting its promising use as a therapeutic strategy for atherosclerosis.

Os fungos filamentosos passam por um crescimento polarizado, desde a germinação ao alongamento das hifas, até formar um complexo micélio. A região apical do crescimento polarizado do fungo apresenta dois tipos diferentes de vesículas, entre elas, as microvesículas. As ADP-ribosylation factors (ARFs), são proteínas monoméricas ligadoras de GTP e pertence ao grupo de proteínas da superfamília Ras. Essas proteínas são divididas em cinco famílias: ARF, RAB, RAN, RAS e RHO que formam um conjunto de sub-sistemas que são responsáveis, entre outras funções, pela regulação do transporte de vesículas no interior da célula fúngica, entre outras funções, como transduções de sinais e regulação do tráfego vesicular na região de crescimento apical, o spitzenkörper. São proteínas de ancoramento e de marcação de vesículas, envolvidas no tráfego, catálise e fusão por meio de sinalização de membrana-alvo para as vesículas de transporte transmembrana. As ARF são importantes para o crescimento das hifas, além de participar da montagem de vesículas por meio de endocitoses, do transporte destas vesículas entre as organelas e na exocitose. Adicionalmente, as ARFs sofrem o processo de N-miristoilação, uma irreversível lipidação proteica em que o miristato do miristoil CoA é covalentemente ligado a uma glicina secundária da proteína alvo, aumentando a sua hidrofobicidade. Além desta regulação, as ARFs são moduladas pela ação das ARF-GAP (GTPase Activating Protein) e ARF-GEFs (Guanine nucleotide Exchange Factor). Neste trabalho foi proposta a deleção de três ARFs preditivamente miristoiladas (arfA, arfB and arlA), além de dupla-deleção com ?gcsA (ARF-GAP) e a caracterização genotípica e fenotípica das ADP ribosylation fator no fungo filamentoso patogênico Aspergillus fumigatus. Como caracterização das linhagens deletadas, notou-se que arfA demonstra ser essencial para A. fumigatus, enquanto que o fungo foi capaz de se desenvolver na ausência de arfB, arlA e duplo mutantes com ?gcsA. Porém, de forma alternada nas linhagens mutantes, houve redução do diâmetro da colônia, desestruturação de conidióforos, polarização dicotômica e redução de corpos lipídicos na região de crescimento apical. Além das alterações da parede celular que implicou em altações na carga de superfície, formação de biofilme e virulência. Testes de sensibilidades, bem como as análises de níveis de expressão gênica frente a a compostos danosos a eucariotos e antifúngicos evidenciaram que as ARFs e GcsA estão envolvidas em reparos a danos frente a diferentes alvos citoplasmáticos. Ainda, a localização das ARFs fusionadas com GFP (Green Flourescence Protein) em A. fumigatus evidenciou que ArfB está nas regiões apicais das hifas e conidióforos, enquanto ArlA está distribuído em todo citoplasma. Portanto as ARFs em A. fumigatus estão envolvidas nos processos básicos do fungo, como: o crescimento, a virulência e a reprodução / The filamentous fungi undergo polarized growth, from germination to hyphae elongation, to form a mycelial complex. The apical region of the polarized growth of the fungus presents two different types of vesicles, among them, the microvesicles. ADP-ribosylation factors (ARFs) are monomeric GTP-binding proteins and belong to a group of superfamily Ras proteins. These proteins are divided into five families: ARF, RAB, RAN, RAS and RHO that form a set of subsystems that are responsible, over others things, for the regulation of vesicle transport within the fungal cell, among other functions, such as signal transduction and regulation of the vesicular traffic in the apical growth region, the Spitzenkörper. They are anchoring and vesicle marking proteins involved in trafficking, catalysis and fusion by means of target membrane signaling to the transmembrane transport vesicles. ARFs are important for the growth of hyphae, besides participating in vesicle assembly through endocytosis, the transport of these vesicles between the organelles and exocytosis. In addition, the ARFs undergo the N-myristoylation process, an irreversible protein lipidation in which the myristoyl CoA myristate is covalently linked to a secondary glycine of the target protein, increasing its hydrophobicity. In addition to this regulation, the Arfs are modulated by the action of Arf-GAP (GTPase Activating Protein) and ARF-GEFs (Guanine nucleotide Exchange Factor). In this work, the deletion of three myristoylated ARFs (arfA, arfB and arlA), as well as double-deletion with ?gcsA (ARF-GAP) and phenotypic and genotypic characterization of ADP ribosylation fator in the pathogenic fungus Aspergillus fumigatus was proposed. As a characterization of the deleted strains, arfA shown to be essential for A. fumigatus, whereas the fungus was able to develop in the absence of arfB, arlA and double mutants with ?gcsA. However, in the mutant strains, there was a decrease in colony diameter, deconjugation of conidiophores, dichotomous polarization and reduction of lipid bodies in the apical growth region. In addition, cell wall changes were registered that implied in surface charge elevations, biofilm formation and virulence. In tests of sensitivities, as well as the analysis of levels of gene expression against compounds harmful to eukaryotes and antifungals showed that ARFs and GcsA (Arf-GAP) are involved in damage repair against different cytoplasmic targets. Furthermore, the location of the GFP-fused GFPs (Green Flourescence Protein) in A. fumigatus evidenced that ArfB is in the apical regions of the hyphae and conidiophores, while ArlA is diffuse in every cytoplasm. Therefore, the ARFs in A. fumigatus are involved in the basic processes of the fungus, such as growth, virulence and reproduction