Orientador: Marco Antonio Alvarenga / Resumo: A endometrite persistente pós-cobertura (EPPC) é uma afecção que acomete uma parcela significativa das éguas que estão em programas de reprodução. Em vista disso, o objetivo desta revisão de literatura foi abordar a fisiopatologia da EPPC e seus tratamentos. Após a cobertura ou inseminação artificial (IA) é fisiológico que ocorra inflamação no interior do útero a fim de promover a limpeza uterina e drenagem dos debris celulares e contaminantes. Éguas que são susceptíveis a EPPC permanecem com acúmulo de líquido uterino e elevado infiltrado neutrofílico no interior do útero por mais de 36 horas após o contato com o sêmen. Para que essas fêmeas possam ser utilizadas na reprodução e se obtenha índices de fertilidade aceitáveis é necessário controlar a inflamação, oferecendo um ambiente uterino adequando para o embrião. A maioria dos tratamentos usados para as éguas com EPPC são paliativos, como a utilização de fármacos ecbólicos e lavagem uterina para auxiliar na retirada do líquido e os polimorfonucleares (PMNs) acumulados no interior do útero. Outros tratamentos tem sido sugeridos, como os imunomoduladores que atuam bloqueando a resposta inflamatória inicial, evitando a liberação de mediadores inflamatórios. Recentemente tem sido mencionada a utilização de anti-inflamatórios não esteroidáis (AINEs) para o tratamento de éguas susceptíveis, que atuam bloqueando a cicloxigenase (COX) interrompendo assim liberação das prostaglandinas (PGs) que são as causadoras do processo inflama... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Endometrial prostaglandins (PGs) play a role in menstruation in primates and in luteolysis in nonprimates. Their biosynthesis is regulated by estrogen (E) and progesterone (P) in a manner not fully understood. The purpose of this thesis research was to (1) study the effects of E and P, both in vivo and in vitro, on basal endometrial PG output in vitro during the course of the artificial menstrual cycle in the rhesus monkey, and (2) further to examine the cellular mechanisms of P action in vivo on PG output using an ovine model system. To carry out the first objective, ovariectomized rhesus monkeys (n=39) were maintained on either a standard or manipulated artificial menstrual cycle (SAMC and MAMC, respectively) and endometrial biopsies were obtained at precise times in separate cycles on: cycle day 9 (mid-proliferative), 13 (mid-cycle E peak), 14 (one day post E peak), and 23 (mid-secretory). PGF2α was the most abundant PG produced in vitro by endometrial organ cultures, the levels of which changed most dramatically throughout the SAMC. Within the first 24 hours of organ culture, PGF2α accumulation was low on day 9 and rose significantly (p<0.01) on day 13, indicating a stimulatory effect of E in vivo. However, E added in vitro, at either physiologic or supraphysiologic concentrations, to endometrial cultures did not stimulate PGF2α accumulation on any cycle day examined. On day 14, just one day post E peak, there was a dramatic fall in PGF2α accumulation which appeared to be due to both a decline in stimulatory E in vivo and a rise in inhibitory P in vivo. Basal PGF2α accumulation in vitro by day 23 endometrial cultures was 10-fold higher (p<0.01) compared to days 9 and 14. This high level of PGF2α output on day 23 appeared to be caused by a paradoxical priming effect of P in vivo and also a slight enhancement by the mid-cycle peak of E in vivo. Padded in vitro, at a physiologic concentration, to day 23 endometrial cultures markedly inhibited (p<0.01) the high level of PGF2α accumulation, suggesting that P withdrawal in vivo promotes the rise in endometrial PGF2α production in vivo at the time of menstruation in primates. An ovine model system was further used to investigate the cellular mechanisms of P action in vivo. Ovariectomized sheep (n=8) were administered an infusion regimen of either E and P, or E and P vehicle alone, to examine the effects of P in vivo on PGF2α production in vitro by endometrial explants during short-term incubations. P in vivo increased the mass amount of stimulated PGF2α output by both physiologic and pharmacologic mechanisms. In addition, P did not appear to significantly alter the sensitivity of the endometrium to stimulatory levels of oxytocin in vitro indicating that the cellular events accounting for the P priming effect, in part, may occur independent of the oxytocin receptor closer to the PG biosynthetic pathway. In P-primed endometrium, the mass amount of PGF2α stimulated by a calcium-ionophore (A23l87) was less than that stimulated by OT suggesting the involvement of calcium-insensitive mechanisms in PGF2α synthesis.

Modern high-yielding dairy cows are currently producing far more milk than their ancestors due to a prolonged and intensive genetic selection for milk production trait accompanied by the revolutionary improvement in technology, management, and nutrition. On the other hand, a noticeable decline in fertility and reproductive performance was undeniably consistent with the increase in milk yield. This decline in fertility and reproductive performance are recognized worldwide and well documented in several studies. Dairy cows typically experience a period of energy deficit during the first few months of lactation due to the rapid increase in milk production and limited feed intake. This shortage of energy requirements results in loss of body fat which is associated with the disturbance of the normal levels of certain hormones and metabolites. The significant increase in milk yield has increased the severity and duration of the energy deficit which has an adverse effect on the main reproductive cells and tissues that profoundly contribute to fertility. These include the egg from the ovary, the early embryo, and the internal lining of the uterus. Fertilization of a healthy egg results in the development of an embryo with an excellent quality that can survive through the multiple stages of gestation, especially during the first two weeks of gestation when many embryos die. The embryos in the early stages are the most susceptible to the disturbance in their environment. Energy deficit was shown to negatively impact the egg and embryo quality and make the uterus lining suboptimal to support early embryo development. Understanding the mechanisms by which energy deficit influences the main reproductive tissues will help in developing profound strategies to improve fertility in dairy cows.

Zielsetzung der vorgestellten Arbeit war die Etablierung und Validierung einer Zellkultur isolierter equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen für morphologische und funk-tionelle Untersuchungen an den einzelnen Zelltypen und ihrer Interaktionen. Ein solches In-vitro-System könnte insbesondere für Studien zur der Pathogenese der Endometrose zum Einsatz kommen. Zu diesem Zweck wurden Endometriumbioptate und Uteri von gynäkologisch unauffälli-gen Stuten entnommen. Die Isolierung der Zellen erfolgte nach mechanischer Zerklei-nerung des Gewebes mittels enzymatischer Verdauung durch Kollagenase. Für die Se-paration und Aufreinigung der Epithel- und Stromazellen kam, nach unbefriedigenden Ergebnissen bezüglich Zellausbeute und –reinheit bei Verwendung der Verfahren allein, eine Kombination aus Filtration, diskontinuierlicher Dichtegradientenzentrifugation und Differenzialadhärenz zum Einsatz. So konnten Kreuzkontaminationen der beiden Zell-fraktionen von ≤ 2 % erreicht werden. Die Kultivierung der so gewonnenen Zellen er-folgte bei 37 °C, in Raumluft mit 5 % CO2 in wasserdampfgesättigter Atmosphäre in RPMI 1640 als Medium mit 10 % fötalem Kälberserum. Der Proliferationsvergleich auf unterschiedlichen Oberflächenbeschichtungen (Kunst-stoff, Kollagen, Matrigel®) zeigte einen Wachstumsvorteil der Epithelzellen auf dem ECM-Substrat Matrigel®. Im Gegensatz zu den stromalen Zellen, deren Wachstum auf dieser gegenüber den anderen Beschichtungen verlangsamt war. Die Stromazellen konnten über 1 Jahr bis zur Passage 19 in Kultur gehalten werden bevor deutliche De-generationserscheinungen auftraten. Bei den epithelialen Zellen war die Subkultivierung nach Trypsinierung nicht erfolgreich. Eine morphologische und funktionelle Charakterisierung der kultivierten Zellen fand mit-tels Lichtmikroskopie mit verschiedenen Färbungen, Immunhistologie sowie Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie statt. Für diesen Zweck erfolgte die Kultivierung der Zellen auf chamber slides und in Matrigel®-beschichteten Membraneinsätzen als Mono- und Kokultur. Die Epithelzellen stellten sich auf unbeschichteten Kunststoffoberflächen als flache, po-lygonale Zellen dar. Bei Bereitstellung von Matrigel® bildeten sie Organoide aus polari-sierten Zellverbänden mit Mikrovilli und Protrusionen an der Oberfläche aus. Als Zellver-bindungen traten Interdigitationen, tight junctions und Desmosomen auf. Im Zytoplas-ma waren neben rauem endoplasmatischen Retikulum, Golgi-Apparat und Mitochond-rien auch Sekretvakuolen zu finden. Immunhistologisch reagierten die Epithelien auch in vitro Zytokeratin-positiv. Dieses Charakteristikum diente als Unterscheidungsmerkmal von den Stromazellen, da nach einer Woche Kulturzeit auch der Vimentinnachweis bei den epithelialen Zellen positiv ausfiel. Progesteron- und Östrogenrezeptoren waren mit-tels Immunhistologie bei beiden kultivierten Zelltypen nicht nachweisbar. Die spindeligen bis sternförmigen Stromazellen wiesen keine Oberflächenmodifikationen auf. Intrazytoplasmatisch waren Mitochondrien, raues endoplasmatische Retikulum und ein Golgi-Apparat nachweisbar. Die stromalen Zellen waren immunhistologisch durch einen Vimentinnachweis gekennzeichnet. Zusätzlich konnte nach wenigen Tagen in der Kultur -Aktin und teils auch Desmin nachgewiesen werden. Diese Differenzierung zu Myofibroblasten trat unter hypoxischen Kulturbedingungen (1 % O2) verstärkt auf. Die morphologische und immunhistologische Charakterisierung zeigte, dass die Diffe-renzierung sowohl der epithelialen als auch der stromalen Zellen unter den eingesetzten Kulturbedingungen der von Endometrose betroffenen Zellen oder den Zellen in inakti-ven Endometrien während des Winteranöstrus in situ ähnelt. Die etablierte Zellkultur equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen aus Biopsiema-terial bildet die Grundlage für morphologische und funktionelle Untersuchungen an den einzelnen Zelltypen und ihrer Interaktionen zur Erforschung der Pathogenese der En-dometrose. Aus praktischer und ethischer (tierschutzrechtlicher) Sicht bietet sie eine hervorragende Möglichkeit experimenteller Untersuchungen an endometrialen Zellen der Stute.

In the human uterus prostaglandins (PG) PGE2, PGD2, PGI2, PGF2¿ and Thromboxane A2 (TXA2), also termed prostanoids, are synthesised and deactivated to 15-keto PGE2, J2 metabolites, 6-keto-PGF1¿, 15-keto PGF2¿ and TXB2 respectively. However, not all metabolites have been analysed simultaneously within the same tissue. The primary objective of this thesis was to determine full uterine prostanoid profiles in human non-pregnancy, pregnancy and parturition, to better understand these processes and find suitable tocolytic targets. In addition, ten cytokines in human cervico-vaginal fluid (CVF) were measured according to interval to labour to test their suitability as labour onset predictors, with a view to developing a test to determine women at risk of preterm labour. Prostanoid analysis was carried out in endometrium (n=9) and myometrium (n=15- 16) donated by non-pregnant women and lower segment myometrium obtained from pregnant women (before (n=14) and after labour onset (n=7)) by liquid chromatography coupled with electrospray ionisation mass spectrometry (LC/ESIMS/ MS). Cytokines produced by CVF collected from pregnant donors (20-41 weeks gestation, n=2-10) were investigated using Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) or Luminex®. Human endometrium produced greater concentrations of TXB2, PGE2 and PGF2¿ than myometrium in vitro (p<0.05). Fifteen prostanoids were detected in human myometrium. Production of 6-keto-PGF1¿, PGE1 and PGF1¿ increased whilst 15- keto PGE2 and PGJ2 decreased at term pregnancy (37-41 weeks gestation) versus non-pregnancy (p<0.05). Myometrium from parturient donors synthesised TXB2 and PGE2 more abundantly than the non-labouring equivalent. Cytokine concentration was greatest in CVF sampled the week before labour, in particular Interleukin-6 (IL-6), Macrophage Inflammatory Protein-1¿ (MIP-1¿) and Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1) (p<0.05). Endometrial TXB2, PGE2 and PGF2¿ could aid in proliferation of glandular epithelium prior to ovulation. Prostacyclin may facilitate prolongation of pregnancy to term and thromboxane could contribute to uterine stimulation during labour. Cervical dilation may be influenced by PGE2 in lower segment myometrium. MCP- 1, MIP-1¿ and IL-6 could mark a short interval to labour onset. / Allergan Inc.

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Delayed uterine clearance (DUC) is a significant problem contributing to subfertility and infertility in the mare, characterized by an accumulation of fluid and inflammatory debris in the uterine lumen following breeding events, venereal disease or an estral cycle. This syndrome is typically seen in older, multiparous mares and mares with poor reproductive tract conformation. The etiopathogenesis of DUC has not been fully elucidated but suggested causes include poor genital conformation, a cranioventrally tilted uterus, defective myometrial contractions, decreased intrauterine immune activity, inappropriate lymphatic drainage or mucus overproduction. The objective of this research was to evaluate gene expression of selected genes in endometrial tissue samples taken from three categories of mares (young fertile [YF], older clinically normal [ON] and older susceptible [OS]). The genes assayed in this research were oxytocin receptor, PGF2á receptor and progesterone receptor. The expression of each of these genes was normalized using the expression of two housekeeping genes, beta actin and ribosomal 18S RNA. Quantitative real-time polymerase chain reaction (QPCR) was used to evaluate gene expression of the selected genes. Results indicated that there was no statistically significant difference in the expression of any of the three experimental genes among any of the three categories of mares. From this research, the direction of further research regarding the pathogenesis of DUC can be made: myometrial tissues can be assayed for similar genes, the expression of other genes regulating myometrial contraction can be assayed or the expression of uterorelaxants can be studied. / Master of Science

Einleitung: Die Übergangszyklen (ÜZ) der Stute sind hinsichtlich klinischer Parameter bereits ausführlich charakterisiert. Das Endmetrium wird bislang, trotz seines elementaren Stellenwertes in der „Reproduktionsachse“, nicht oder nur sehr vereinzelt in die Betrachtungen mit einbezogen. Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Arbeit war eine umfassende morphologischfunktionelle Charakterisierung des equinen Endometriums während der ÜZ, insbesondere im Hinblick auf die endometriale Aktivität und Differenzierung. Zudem wurden die dokumentierten endometrialen Charakteristika in ein klinische Parameter beinhaltendes Gesamtkonzept eingebunden, um ein tiefergreifendes Verständnis der physiologischen Abläufe während des Frühjahrs und Herbstes zu erlangen. Auf dieser Grundlage sollte darüber hinaus der optimale Zeitraum einer diagnostischen Bioptatentnahme hinsichtlich der Funktionsmorphologie des Endometriums ermittelt werden. Tiere, Material und Methoden: Für die vorliegende Arbeit wurden insgesamt 260 Endometriumproben von Stuten verschiedener Rassen sowie mit einem variablen und individuellen Alters- und Reproduktionsstatus untersucht. Diese stammten im Wesentlichen aus den Routineeinsendungen (n = 253) des Instituts für Veterinär-Pathologie der Universität Leipzig der Jahre 1993 - 2012. Darüber hinaus wurden endometriale Gewebeproben von sieben Tieren im Rahmen von Obduktionen entnommen. Als Kontrollgruppe dienten Bioptate von sechs klinisch-gynäkologisch gesunden Stuten aus der physiologischen Zuchtsaison, welche an definierten Tagen des Zyklus entnommen wurden. Für die Auswertung des Herbst-Übergangszyklus (HÜZ) standen 76 Proben aus den Monaten September, Oktober und November zur Verfügung. Der Frühjahrs-Übergangszyklus (FÜZ) wurde durch 184 im Februar, März und April entnommene Bioptate repräsentiert. Die Gewebeproben wurden routinemäßig aufgearbeitet und mittels H.-E. gefärbt. Eine lichtmikroskopische Untersuchung erfolgte im Besonderen hinsichtlich der endometrialen Aktivität sowie der glandulären und stromalen Differenzierung. An 100 ausgewählten Endometriumproben wurde zudem eine immunhistologische Untersuchung hinsichtlich der Expression von Östrogenrezeptor α und Progesteronrezeptor sowie des Proliferationsmarkers Ki67-Antigen durchgeführt. Ergebnisse: Während des HÜZ ergibt sich das Bild einer nahezu kontinuierlichen Abnahme der endometrialen Aktivität. Demgegenüber kann im Verlauf des FÜZ eine deutliche Zunahme der Aktivität beobachtet werden. Der Prozentsatz fehldifferenzierter Endometrien nimmt im Herbst von etwa 14 % im späten September auf nahezu 44 % in der ersten Novemberhälfte zu. In jenen den Untersuchungszeitraum begrenzenden Monatshälften (früher September, 33 %; später November, < 30 %) weichen die ermittelten Fehldifferenzierungsraten von der beobachteten Zunahme ab. Während des FÜZ ist der höchste Prozentsatz fehldifferenzierter Endometrien im späten März (32 %) zu verzeichnen. Im April fällt der Anteil nachgewiesener Differenzierungsstörungen auf < 15 % ab. Mehr als 90 % der fehldifferenzierten Gewebeproben weisen eine irreguläre Funktionsmorphologie auf, während bei den übrigen Endometrien (< 10 %) eine ungleichmäßige Differenzierung beobachtet werden kann. Die ermittelte Kongruenz der endometrialen funktionellen Morphologie und des klinisch- gynäkologisch (vorberichtlich) dokumentierten Zyklusstandes aller im HÜZ und FÜZ untersuchten Proben beträgt rund 70 %. Die dominierende Funktionsmorphologie fehldifferenzierter Endometrien passt in ca. 60 % der Fälle zu dem jeweiligen klinisch dokumentierten Zyklusstand. Während der ÜZ sind sowohl in regulär als auch in fehldifferenzierten Endometrien eine überwiegend schwache Steroidhormonrezeptorexpression und eine nahezu fehlende Ki67-Antigenexpression zu beobachten. Insgesamt zeigen die irregulär differenzierten Endometrien v. a. im Bereich des tiefen Drüsenepithels eine deutlich stärkere Expressionsintensität insbesondere von Östrogenrezeptor α als entsprechende Strukturen regulär differenzierter Endometrien. Schlussfolgerungen: Die vermehrte Nachweisbarkeit endometrialer Fehldifferenzierungen sowie einer fehlenden Kongruenz histomorphologischer und klinisch-gynäkologischer Befunde während der ÜZ ist möglicherweise auf eine in diesen Zeiträumen physiologische Entkopplung insbesondere der ovariell-endometrialen Regulationsmechanismen zurückzuführen. Eine diagnostische Bioptatentnahme zur endometrialen Funktionsanalytik sollte demzufolge ab der zweiten Aprilhälfte und bis Ende August stattfinden.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Der Sexualzyklus der Stute 2 2.1.1 Allgemeine Betrachtungen 2 2.1.2 Regulation des Sexualzyklus während der physiologischen Zuchtsaison 3 2.1.3 Der Anöstrus (anovulatorische Phase) 5 2.1.3.1 Der Herbst-Übergangszyklus 6 2.1.3.2 Der tiefe Winteranöstrus (ovarielle Inaktivität) 9 2.1.3.3 Der Frühjahrs-Übergangszyklus 10 2.2 Histomorphologie des Endometriums der Stute 11 2.2.1 Morphologische Charakteristika des zyklisch aktiven Endometriums 12 2.2.2 Endometriale Differenzierungsstörungen 12 2.2.2.1 Endometriale Atrophie und Inaktivität 15 2.2.2.2 Histomorphologie des equinen Endometriums während der Übergangszyklen – Physiologische endometriale Asynchronizität 18 2.2.2.3 Endometriale Hyperplasie 18 2.2.2.4 Endometriale Hypoplasie 19 2.2.2.5 Irreguläre glanduläre Differenzierung 19 2.2.2.6 Ungleichmäßige glanduläre Differenzierung 22 2.2.2.7 Vollständig irreguläre und ungleichmäßige glanduläre Differenzierung 24 2.3 Östrogen- und Progesteronrezeptoren 25 2.3.1 Aufbau, Struktur und Wirkmechanismen der Steroidhormonrezeptoren 25 2.3.2 Hormonelle Beeinflussung der Steroidhormonrezeptorexpression 26 2.3.3 Hormonrezeptoren im Endometrium der Stute 27 2.4 Ki67-Antigen 28 2.4.1 Allgemeine Betrachtungen 28 2.4.2 Ki67-Antigen im Endometrium der Stute 29 2.5 Fazit aus der Literatur im Hinblick auf den eigenen Forschungsschwerpunkt 30 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 31 3.1 Tiergut, Material und Probenherkunft 31 3.2 Nähere Charakterisierung des Tiergutes und des Untersuchungsmaterials 31 3.2.1 Selektionskriterien für die Auswahl des Untersuchungsmaterials aus der Datenbank 31 3.2.2 Probenentnahme und Dokumentation der Ovarbefunde von Sektionstieren 32 3.2.3 Endokrinologische Analysen der Blutserumproben 33 3.2.3.1 Bestimmung von E2 im Pferdeserum (mit Extraktion) 33 3.2.3.2 Bestimmung von P4 im Pferdeserum (mit Extraktion) 34 3.2.4 Kontrollstuten 35 3.3 Probenaufarbeitung und histologische Präparation 35 3.4 Lichtmikroskopie 36 3.4.1 Auswertung der histologischen Präparate 36 3.5 Immunhistologie 39 3.5.1 Anfertigung der immunhistologischen Präparate 39 3.5.2 Auswertung der immunhistologischen Untersuchungen 40 3.5.2.1 Steroidhormonrezeptoren 41 3.5.2.2 Proliferationsmarker – Ki67-Antigen 42 4 ERGEBNISSE 43 4.1 Charakterisierung des HÜZ 43 4.1.1 Lichtmikroskopische Beurteilung der endometrialen Proben (HÜZ) 45 4.1.1.1 Endometriale Aktivität 45 4.1.1.2 Endometriale Differenzierung 47 4.1.1.3 Endometriale Alterationen 49 4.1.2 Immunhistologische Beurteilung ausgewählter endometrialer Proben (HÜZ) 51 4.1.3 Gegenüberstellung histomorphologisch-funktioneller und klinisch-gynäkologischer Befunde unter Berücksichtigung anamnestischer Daten 54 4.1.4 Zusammenfassende Darstellung des HÜZ 56 4.2 Charakterisierung des FÜZ 60 4.2.1 Lichtmikroskopische Beurteilung der endometrialen Proben (FÜZ) 62 4.2.1.1 Endometriale Aktivität 62 4.2.1.2 Endometriale Differenzierung 64 4.2.1.3 Endometriale Alterationen 65 4.2.2 Immunhistologische Beurteilung ausgewählter endometrialer Proben (FÜZ) 67 4.2.3 Gegenüberstellung histomorphologisch-funktioneller und klinisch-gynäkologischer Befunde unter Berücksichtigung anamnestischer Daten 70 4.2.4 Zusammenfassende Darstellung des FÜZ 74 4.3 Morphologisch-funktionelle Beurteilung endometrialer Bioptate im Zyklusverlauf (Kontrollstuten) 78 5 DISKUSSION 79 5.1 Ziel der Arbeit 79 5.2 Kritische Beurteilung des Untersuchungsmaterials 79 5.3 Charakteristika der Übergangszyklen 81 5.3.1 Endometriale Aktivität und deren Vergleich mit den Befunden der klinisch-gynäkologischen Untersuchung 81 5.3.2 Endometriale Differenzierung im saisonalen Kontext 83 5.3.2.1 Potenzielle Einflussfaktoren auf die endometriale Funktionsmorphologie während der ÜZ (Alter, Parität und Güstzeit) 85 5.3.2.2 Vergleich der Ergebnisse der endometrialen Funktionsanalyse mit den Befunden der klinisch-gynäkologischen Untersuchung 87 5.3.3 Expressionsverhalten von ERα, PR und Ki67-Antigen in ausgewählten endometrialen Bioptaten 88 5.3.3.1 Expressionsverhalten von ERα, PR und Ki67-Antigen in Endometrien mit einer regulären Funktionsmorphologie 88 5.3.3.2 Expressionsverhalten von ERα, PR und Ki67-Antigen in Endometrien mit einer irregulären Funktionsmorphologie 90 5.4 Fazit 91 5.5 Ausblick und weiterführende Untersuchungen 93 5.5.1 Homogenität des Probenmaterials 93 5.5.2 Funktionelle Charakterisierung des Endometriums während der ÜZ 93 6 ZUSAMMENFASSUNG . 95 7 SUMMARY 97 8 LITERATURVERZEICHNIS 99 9 ANHANG 116 9.1 Fragebogen zur Vervollständigung der klinisch-anamnestischen Daten 116 9.2 Charakterisierung der Kontrollstuten 117 9.3 Reagenzien für die Immunhistologie 118 9.4 Auswertungsprotokoll Lichtmikroskopie und Immunhistologie 119 10 DANKSAGUNG 122 / Introduction: With regard to clinical parameters the transitional period of the mare is already characterized thoroughly. Despite its important key-role in the reproductive axis, however, the endometrium is largely neglected in these considerations. Objective: The aim of the present study was a detailed morphofunctional characterization of the equine endometrium during the autumn (ATP) as well as the spring transitional period (STP). Special emphasis was placed regarding the endometrial activity and differentiation. Furthermore, the investigated endometrial characteristics were integrated in a superordinate concept, also considering clinical parameters, in order to gain a more comprehensive understanding of physiological processes during both ATP and STP. Based on these findings the most effective time span for diagnostic biopsy sampling, especially regarding the functional morphology of the endometrium, should be evaluated. Material and methods: For this survey altogether 260 endometrial samples of mares with a variable age and foaling status as well as of different breeds were investigated. The main part of the examined specimens (n = 253) was obtained from routine biopsy submissions sent to the Institute of Pathology at the University of Leipzig from 1993 to 2012. Moreover, endometrial tissue was retrieved from 7 mares, which were submitted for necropsy to the same department. Samples with no endometrial alterations taken from 6 gynaecologically healthy mares during the physiological breeding season on defined days of the oestrus cycle served as positive controls. To outline the ATP, 76 specimens taken in September, October and November were selected for examination. Samples taken in February, March and April were chosen to investigate the STP (184). All samples were routinely processed and stained with haemalum and eosin (H.-E.). Subsequently, the samples were evaluated microscopically especially with regard to the functional morphology of the endometrium, that means activity as well as glandular and stromal differentiation. An immunohistochemical evaluation of the expression of oestrogen receptor α and progesterone receptor as well as of Ki67-antigen was performed on selected endometrial samples (n = 100). Results: Concerning the endometrial activity a considerable decrease in activity from September to the second half of November could be detected in ATP. Compared to this course in autumn, a noticeable increase in activity could be recognized during STP. The appearance of endometrial disorders in ATP is characterized by a straight increase from about 14 % in late September to nearly 44 % in the first half of November. At the ‘margins’ of ATP (early September, 33 %; late November, < 30 %) results deviating form the mentioned increase were observed. During STP the highest percentage of endometrial differentiation disorders could be detected in late March (32 %). At the end of STP in April, the percentage of endometrial maldifferentiations declined to about 15 % or lower. Altogether, the vast majority (90 %) of specimens with differentiation disorders were classified as being differentiated ‘irregularly’. Accordingly, only about 10 % of all maldifferentiated endometria showed an ‘unequal’ functional morphology. A comparison of the clinically evaluated ovarian status and the endometrial functional morphology revealed that both parameters were in accordance in about 70 % of all mares examined during ATP and STP. Regarding only maldifferentiated endometria, a consistence of the predominant functional morphology and the ovarian status could only be detected in about 60 % of all investigated cases. During the transitional peroids, both regularly differentiated endometria and specimens showing functional disorders showed an only mild steroid hormone receptor expression and almost no expression of Ki67-antigen. However, a distinctively higher oestrogen receptor α expression could be observed in the epithelial cells of mainly mid to basal glands especially in ‘irregular’ differentiated specimens compared to according structures of regularly differentiated endometria. Conclusion: Endometrial maldifferentiations as well as a relatively low ratio of concordance of the histomorphological findings in the endometrium compared to the reported gynaecological status are frequently found in biopsies taken during the transitional periods. These two conditions might display a physiological decoupling of the regulatory processes between ovaries and endometrium. Therefore, a diagnostic sampling – with regard to a functional analysis of the endometrium – should take place during the physiological breeding season between late April and before September.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Der Sexualzyklus der Stute 2 2.1.1 Allgemeine Betrachtungen 2 2.1.2 Regulation des Sexualzyklus während der physiologischen Zuchtsaison 3 2.1.3 Der Anöstrus (anovulatorische Phase) 5 2.1.3.1 Der Herbst-Übergangszyklus 6 2.1.3.2 Der tiefe Winteranöstrus (ovarielle Inaktivität) 9 2.1.3.3 Der Frühjahrs-Übergangszyklus 10 2.2 Histomorphologie des Endometriums der Stute 11 2.2.1 Morphologische Charakteristika des zyklisch aktiven Endometriums 12 2.2.2 Endometriale Differenzierungsstörungen 12 2.2.2.1 Endometriale Atrophie und Inaktivität 15 2.2.2.2 Histomorphologie des equinen Endometriums während der Übergangszyklen – Physiologische endometriale Asynchronizität 18 2.2.2.3 Endometriale Hyperplasie 18 2.2.2.4 Endometriale Hypoplasie 19 2.2.2.5 Irreguläre glanduläre Differenzierung 19 2.2.2.6 Ungleichmäßige glanduläre Differenzierung 22 2.2.2.7 Vollständig irreguläre und ungleichmäßige glanduläre Differenzierung 24 2.3 Östrogen- und Progesteronrezeptoren 25 2.3.1 Aufbau, Struktur und Wirkmechanismen der Steroidhormonrezeptoren 25 2.3.2 Hormonelle Beeinflussung der Steroidhormonrezeptorexpression 26 2.3.3 Hormonrezeptoren im Endometrium der Stute 27 2.4 Ki67-Antigen 28 2.4.1 Allgemeine Betrachtungen 28 2.4.2 Ki67-Antigen im Endometrium der Stute 29 2.5 Fazit aus der Literatur im Hinblick auf den eigenen Forschungsschwerpunkt 30 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 31 3.1 Tiergut, Material und Probenherkunft 31 3.2 Nähere Charakterisierung des Tiergutes und des Untersuchungsmaterials 31 3.2.1 Selektionskriterien für die Auswahl des Untersuchungsmaterials aus der Datenbank 31 3.2.2 Probenentnahme und Dokumentation der Ovarbefunde von Sektionstieren 32 3.2.3 Endokrinologische Analysen der Blutserumproben 33 3.2.3.1 Bestimmung von E2 im Pferdeserum (mit Extraktion) 33 3.2.3.2 Bestimmung von P4 im Pferdeserum (mit Extraktion) 34 3.2.4 Kontrollstuten 35 3.3 Probenaufarbeitung und histologische Präparation 35 3.4 Lichtmikroskopie 36 3.4.1 Auswertung der histologischen Präparate 36 3.5 Immunhistologie 39 3.5.1 Anfertigung der immunhistologischen Präparate 39 3.5.2 Auswertung der immunhistologischen Untersuchungen 40 3.5.2.1 Steroidhormonrezeptoren 41 3.5.2.2 Proliferationsmarker – Ki67-Antigen 42 4 ERGEBNISSE 43 4.1 Charakterisierung des HÜZ 43 4.1.1 Lichtmikroskopische Beurteilung der endometrialen Proben (HÜZ) 45 4.1.1.1 Endometriale Aktivität 45 4.1.1.2 Endometriale Differenzierung 47 4.1.1.3 Endometriale Alterationen 49 4.1.2 Immunhistologische Beurteilung ausgewählter endometrialer Proben (HÜZ) 51 4.1.3 Gegenüberstellung histomorphologisch-funktioneller und klinisch-gynäkologischer Befunde unter Berücksichtigung anamnestischer Daten 54 4.1.4 Zusammenfassende Darstellung des HÜZ 56 4.2 Charakterisierung des FÜZ 60 4.2.1 Lichtmikroskopische Beurteilung der endometrialen Proben (FÜZ) 62 4.2.1.1 Endometriale Aktivität 62 4.2.1.2 Endometriale Differenzierung 64 4.2.1.3 Endometriale Alterationen 65 4.2.2 Immunhistologische Beurteilung ausgewählter endometrialer Proben (FÜZ) 67 4.2.3 Gegenüberstellung histomorphologisch-funktioneller und klinisch-gynäkologischer Befunde unter Berücksichtigung anamnestischer Daten 70 4.2.4 Zusammenfassende Darstellung des FÜZ 74 4.3 Morphologisch-funktionelle Beurteilung endometrialer Bioptate im Zyklusverlauf (Kontrollstuten) 78 5 DISKUSSION 79 5.1 Ziel der Arbeit 79 5.2 Kritische Beurteilung des Untersuchungsmaterials 79 5.3 Charakteristika der Übergangszyklen 81 5.3.1 Endometriale Aktivität und deren Vergleich mit den Befunden der klinisch-gynäkologischen Untersuchung 81 5.3.2 Endometriale Differenzierung im saisonalen Kontext 83 5.3.2.1 Potenzielle Einflussfaktoren auf die endometriale Funktionsmorphologie während der ÜZ (Alter, Parität und Güstzeit) 85 5.3.2.2 Vergleich der Ergebnisse der endometrialen Funktionsanalyse mit den Befunden der klinisch-gynäkologischen Untersuchung 87 5.3.3 Expressionsverhalten von ERα, PR und Ki67-Antigen in ausgewählten endometrialen Bioptaten 88 5.3.3.1 Expressionsverhalten von ERα, PR und Ki67-Antigen in Endometrien mit einer regulären Funktionsmorphologie 88 5.3.3.2 Expressionsverhalten von ERα, PR und Ki67-Antigen in Endometrien mit einer irregulären Funktionsmorphologie 90 5.4 Fazit 91 5.5 Ausblick und weiterführende Untersuchungen 93 5.5.1 Homogenität des Probenmaterials 93 5.5.2 Funktionelle Charakterisierung des Endometriums während der ÜZ 93 6 ZUSAMMENFASSUNG . 95 7 SUMMARY 97 8 LITERATURVERZEICHNIS 99 9 ANHANG 116 9.1 Fragebogen zur Vervollständigung der klinisch-anamnestischen Daten 116 9.2 Charakterisierung der Kontrollstuten 117 9.3 Reagenzien für die Immunhistologie 118 9.4 Auswertungsprotokoll Lichtmikroskopie und Immunhistologie 119 10 DANKSAGUNG 122

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, 1. die Einflüsse von Alter bzw. Parität auf Prävalenz und Entwicklung endometrialer Alterationen beim Rind zu untersuchen, 2. einen repräsentativen Überblick über die mittels Endometriumbiopsie erfassbaren Erkrankungen bei klinisch gesunden Kühen zu schaffen 3. die Entwicklung der histopathologischen Befunde nach einer weiteren Trächtigkeit zu dokumentieren. Grundlage dieser Arbeit sind sechs Endometriumbioptate von klinisch (inklusive rektaler Untersuchung) gesunden Färsen (Gruppe A), 165 Bioptate von klinisch gesunden Kühen (Gruppe B) sowie Bioptat-Paare (Gruppe C) von 46 Tieren, die im Abstand einer Trächtigkeit entnommen wurden. Die Proben der Gruppe A dienten als Kontrollgruppe, wobei die Gefäße als Grundlage für die Normalstruktur vor der ersten Trächtigkeit herangezogen wurden. Innerhalb der Endometriumbioptate der Färsen (Gruppe A) waren keine pathologischen Veränderungen (Endometritis, Endometrose, Angiosklerose) und keine Lymphfollikel nachweisbar. Bezüglich der Endometritis-Prävalenz, die bei 23,6 % lag, ließ sich in Gruppe B keine Abhängigkeit von der Parität oder dem Entnahmezeitpunkt nachweisen. Eine Endometrose trat überwiegend bei Erstkalbinnen (24,4 %) und Tieren mit fünf Abkalbungen (41,6 %) auf. Eine Korrelation mit dem Alter lag nicht vor. Auffällig war die signifikant höhere Endometrose-Prävalenz innerhalb der ersten acht Wochen p.p. (20,1 %), im Vergleich zu später entnommenen Proben (3,2 %). Für das Auftreten von Lymphfollikel, die im Mittel bei 53,3 % der Kühe auftraten, konnten keine Korrelationen mit der Parität oder dem Zeitpunkt der Bioptatentnahme ermittelt werden. Auch scheint weder das Vorliegen einer Endometritis die Entwicklung von Lymphfollikeln zu begünstigen, noch schützen Lymphfollikel im Endometrium vor einer Entzündung des Uterus. Mit steigender Parität war eine Zunahme der Angiosklerose-Prävalenz zu verzeichnen, allerdings konnte keine statistisch signifikante Korrelation zum Grad der Gefäßveränderungen (anhand der H.E.-Färbung) nachgewiesen werden. Innerhalb der Karunkel lagen signifikant höhergradige Veränderungen vor als in interkarunkulären Gefäßen. Da das Alter der Tiere eng mit der Anzahl der Abkalbungen korreliert, war eine gesonderte Betrachtung der altersassoziierten Einflüsse anhand des untersuchten Materials nicht möglich. Mittels der durchgeführten Untersuchungen ließ sich kein negativer Einfluss der vorwiegend geringgradigen histopathologischen Veränderungen im Endometrium (Endometritis, Endometrose, Angiosklerose, Lymphfollikel) auf die Fertilität (Erstbesamungserfolg, Rastzeit, Güstzeit, Gesamtträchtigkeitsrate) nachweisen. Innerhalb der Gruppe C konnte nach einer weiteren Trächtigkeit ein signifikanter Anstieg der Endometrose-Prävalenz von 7,0 % auf 25,6 % nachgewiesen werden, während der Anteil der Tiere mit einer Endometritis bzw. Angioskerose nahezu unverändert blieb. Bei einigen Tieren wurde allerdings in der ersten Probe, jedoch nicht im Folgebioptat, eine Endometrose diagnostiziert. Bei einer Kuh lag dabei sogar zuerst eine mittelgradige periglanduläre Fibrose vor, die im zweiten Bioptat nicht mehr nachweisbar war. Im Hinblick auf die Entwicklung vaskulärer Alterationen konnte nach einer weiteren Trächtigkeit eine signifikante Zunahme der Faserzubildungen (Pikrosiriusrot-Färbung) in der Tunica media interkarunkulärer arterieller Gefäße und karunkulärer Arterien sowie in der Tunica adventitia von interkarunkulären Arteriolen nachgewiesen werden. Weiterhin wurden im Zweitbioptat anhand der Pikrosiriusrot-Färbung signifikant höhergradigere Veränderungen (Gesamtschädigung) der karunkulären Arterien und Arteriolen diagnostiziert. Für alle übrigen Gefäßtypen lag zwar eine Zunahme der Gesamtschädigung im zweiten Bioptat vor, diese war jedoch nicht statistisch signifikant. Zu beiden Untersuchungszeitpunkten konnten innerhalb des untersuchten Materials vor allem Elastosen und Elastofibrosen nachgewiesen werden. Dabei lagen bezüglich der Art der zugebildeten Fasern keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Proben vor. Insgesamt konnten anhand des untersuchten Materials von klinisch gesunden Kühen zahlreiche pathologische Befunde im Endometrium diagnostiziert werden. Allerdings ist die Interpretation der Befunde bislang schwierig, da keine Einflüsse auf die Fertilität nachweisbar waren. Jedoch lagen besonders im Hinblick auf die Endometritis und Endometrose meist nur geringgradige Veränderungen vor, so dass sich diese vermutlich nicht negativ auf die Fruchtbarkeit auswirken. Weiterhin ist anhand der vorliegenden Ergebnisse fraglich, ob eine Endometrose beim Rind als irreversible Erkrankung angesehen werden muss. Hierzu sind weitere Studien erforderlich.

Endometriosis is a reproductive disease affecting women in their prime reproductive years characterized by the presence of endometrial glands and stroma in ectopic locations. Animal models have been proven to be indispensable not only for the study of the disease but also to develop better non-invasive diagnostic imaging modalities. A major limitation with the diagnosis of endometriosis is the lack of a specific and sensitive non-invasive diagnostic test. Our objective was to develop a domestic animal model of endometriosis suitable for serial diagnostic imaging procedures and assessment of therapies. Two major studies were conducted to achieve this objective. First study involved in vitro whole tissue-explant culture and surgical induction of endometriosis in dog, pig and sheep to choose the most suitable model. For in vitro co-culture, dog, pig and sheep endometrium was placed on visceral peritoneum for 24 to 72 h to assess the degree of attachment and adhesion characteristics of endometrium (epithelium, glandular and stromal cells). Surgical induction of endometriosis was tested in dog, sheep (n=5 each) and pig (n=4) using autologous endometrial (n=4 grafts per animal) and fat grafts sutured to visceral (urinary bladder surface in dog and pig, uterus in sheep) and parietal (abdominal wall) peritoneum. Sham surgeries were performed in control group animals (dog and sheep n=5, pig n=3) using fat grafts alone. Animals were euthanized between 80-110 days post-surgery. Size, gross characteristics and histopathologic features of endometriotic lesions were recorded. During in vitro explant culture, surface epithelial, stromal and glandular cells of endometrium were capable of attaching to visceral peritoneum within 24 hours with and without an intact layer of mesothelial lining in dog, pig and sheep. The proportion of successful endometrial attachments were greater at 24h compared to 72h (15/18 vs. 7/18, p=0.008; data combined among species) with intermediate attachment at 48h (12/15). Following surgical induction, there was no difference (p>0.05) in proportion of successful tissue grafts placed on serosal surface of visceral vs. parietal peritoneum in dog (10/10 vs. 10/10), pig (7/8 vs. 8/8) or sheep (7/10 vs. 8/10). A variety of outcomes (endometriotic cysts with sero-sangunous fluid, solid lesions, vesicles, absence of lesions) were found. The proportion of cystic lesions was greater (p<0.01) in dog (19/20 grafts) than in pig (8/16) and sheep (5/20). Further, the area of endometriotic lesions at euthanasia was larger (0.89 ± 0.11 cm2) compared to that at the time of surgery (0.50 ± 0.09 cm2) in dog, whereas, the size of lesions decreased by half or more (p<0.05) in pig and sheep. Combined among grafting sites (visceral and parietal peritoneum) and species, a greater proportion (p=0.015) of surgical sites had adhesions in treatment (12/14) versus control group animals (5/13). The wall of majority of endometrial cysts in dogs were characterized by simple cuboidal/columnar epithelium, endometrial glands (normal, dilated and cystic), subepithelial capillary network and presence of stromal and smooth muscle cells. Hemorrhage and/or hemosiderin-laden macrophages were observed in the cystic lesions in dog. Development of a greater proportion of growing lesions in the form of endometriotic cysts in dogs compared to sheep and pig led us to conclude dog as a better suitable domestic animal model for endometriosis than sheep and pig. Second study involved assessing the usefulness and limitations of ultrasonography, magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography-computed tomography (PET-CT) in detecting cystic endometriotic lesions in dog and sheep. Surgical induction of endometriois was performed in dogs (n=5) and sheep (n=5) using autologous endometrial grafts (n=4 grafts per animal) and fat grafts sutured to visceral peritoneum (urinary bladder in dogs, uterus in sheep) and parietal peritoneum (ventral abdominal wall). Weekly ultrasonography was performed from Week 1-9 post-surgery and day of euthanasia (Week 14-15). T1 and T2 weighted weighted MRI images (n=2 each for dog and sheep) and PET-CT (n=3 dog, n=1 sheep) using 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) as radiolabel was performed between Week 13-15 post-surgery in dog and sheep. Gray-scale B-mode ultrasonography was able to detect endometriotic cysts (0.25-1.75cm) on urinary bladder and abdominal wall in dogs; endometrial grafts Week 1 post-surgery appeared as a homogenous, hypoechoic masses, following which they grew larger with evidence of cyst formation by Week 5. Cysts were undetectable from Week 10-13, whereas they appeared as homogenous masses with a hypoechoic fluid-filled cavity with diffuse hyperechoic echoes and low vascularisation (Color-Doppler imaging) by Week 14-15. In sheep, endometrial grafts were detected as hypoechoic masses Week 1 post-surgery that became smaller until no detectable lesions were visible beyond Week 6-7. Cysts in dogs and sheep appeared hyperintense on T2 and hypointense on T1 weighted images. 18F -FDG PET-CT did not show hypermetabolic activity in endometriotic cysts in dogs and sheep. In conclusion, MRI appeared to provide the most definitive diagnostic images of endometriotic cysts in dogs and sheep, particularly for lesions in sheep which were not evident by ultrasonography. However, ultrasonography was sufficient to characterize most endometriotic cysts in dogs. Further research needs to be carried out to develop specific PET tracers for endometriosis.