L’implantation est caractérisée par les premiers contacts cellulaires permanents entre l’endomètre, tapissant l’utérus, et le conceptus (disque embryonnaire et tissus extra-embryonnaires). Cette étape se trouve être l’un des plus importants points de contrôle de la gestation nécessitant un dialogue finement régulé entre ces deux entités. Concernant les ruminants, un déclin de la fertilité a été observé notamment chez les vaches laitières hautes productrices. La moitié des gestations s’arrête pendant la période pré-implantatoire due à des mortalités embryonnaires précoces ainsi qu’à des défauts utérins. Depuis 10 ans, des analyses exploratoires ont été mises en place dans le but d’étudier les profils d’expression de gènes endométriaux sous l’influence du cycle oestral, de la gestation précoce ou encore des stéroïdes ovariens comme la progestérone et les oestrogènes. Ces études sont essentielles pour l’identification des gènes endométriaux clés pour la survie et la croissance du conceptus avant l’implantation. Notre laboratoire a réalisé une analyse transcriptomique à partir d’échantillons endométriaux collectés sur des vaches cycliques et gestantes au 20 ème jour post-oestrus correspondant respectivement à la phase folliculaire et au premier jour d’implantation. Plusieurs familles de facteurs de transcription apparaissent différentiellement exprimées dans cette étude, notamment FOXL2, un membre de la famille des Forkhead Box transcription factor considéré comme le gène clé de la différenciation ovarienne. Ce travail de thèse s’est intéressé à l’implication de FOXL2 dans la physiologie endométriale. FOXL2 est exprimé et régulé pendant le cycle oestral et la gestation précoce dans l’endomètre de ruminants. De plus, la progestérone a été identifiée comme le régulateur majeur de l’expression endométriale de FOXL2 chez la vache et la brebis alors que l’effet des estrogènes n’a pas été démontré. A partir d’une approche gènes candidats, la surexpression de FOXL2 induit la régulation différentielle de onze gènes potentiellement cibles de FOXL2 dans des cultures primaires endométriales de cellules stromales et épithéliales glandulaires. En particulier, PTGS2 qui est un gène impliqué dans la réceptivité utérine apparait inhibé par FOXL2 alors que SCARA5 et RSAD2, tout deux impliqués dans la réponse immunitaire sont stimulés. Enfin, DLX5 apparait différentiellement régulé entre les cellules stromales et épithéliales glandulaires sous l’impact d’une surexpression de FOXL2. Pour conclure, l’expression endométriale de FOXL2 est fortement liée au processus de réceptivité utérine qui se déroule avant l’implantation et peut moduler l’expression de gènes endométriaux essentiels. De nouvelles analyses sont nécessaires pour déterminer si FOXL2 est le gardien de la physiologie reproductive femelle. / Implantation is characterized by the first permanent cellular interactions between the endometrium, lining the uterus, and the conceptus (embryonic disk and extra-embryonic tissues) and appears to be one of the most important checkpoints of successful pregnancy. Regarding ruminant species, and more specifically dairy cows, half of pregnancies abort during the pre-implantation period due to early embryonic death and uterine defects. In the last decade, exploratory approaches have been developed to study endometrial genes expression under the influence of oestrous cycle, early pregnancy, and ovarian steroid hormones in order to identify systematically crucial endometrial genes for conceptus growth and survival leading to a successful implantation in ruminant specifically. A microarray analyse made at the laboratory based on endometrial samples collected from cyclic and pregnant cows at 20 days post-oestrous, corresponding respectively to the follicular phase and the implantation initiation. Several members of the transcription factor families appeared to be differentially expressed in this study including FOXL2, a member of the Forkhead box L sub-class originally considered as a key gene for ovarian differentiation. My PhD thesis focused on the implication of FOXL2 gene in endometrial physiology. FOXL2 gene had been demonstrated to be expressed and regulated during the oestrous cycle and early pregnancy in ruminant endometrium. Moreover, progesterone was identified as a master regulator of FOXL2 endometrial expression in both cattle and sheep whereas estrogens have no impact. Based on candidate genes approach, over-expression of FOXL2 gene induces a regulation of eleven putative FOXL2 target genes in primary endometrial stromal and glandular epithelial cells. In particular, PTGS2 which is a positive regulator gene for uterine receptivity was shown to be inhibited whereas SCARA5 and RSAD2 expressions that were involved in immune response were shown to be stimulated as well as DLX5 expression was differentially regulated between stromal and glandular epithelial cells. Collectively, FOXL2 endometrial expression is strongly linked to the uterine receptivity process prior to the implantation and modulates the expression of essential endometrial genes. Further investigations will be required to investigate whether FOXL2 is the gatekeeper of female reproduction in the vertebrate species.

ABSTRACT Selective progesterone receptor modulators (SPRM) represent a new class of synthetic steroids which can interact with the progesterone receptor (PR) and can exert agonist, antagonist or mixed effects on various progesterone target tissues in vivo. VA-2914 is a selective progesterone receptor modulator with potential contraceptive activity. We evaluated VA 2914 for ovulation inhibition in women, using three experimental doses ( 2,5 mg/d, 5 mg/d, 10 mg/d ) given continuously for three months. We examined the endometrial impact in each group. Anovulation (defined by absence of progesterone above 3 ng/ml ) was obtained in nearly 80% women in the 5 and 10 mg/d groups with a great rate of amenorrhea ( 81.2 and 90% cases in the 5 and 10 mg/d groups ). Estradiol levels remained in the physiological follicular phase range. Endometrial histological analysis show predominantly usual patterns of secretory phase. Some cystic glandular dilatations are observed in rare cases ; any hyperplasia was detected. VA-2914 induces amenorrhea while progestins cause endometrial spotting and bleeding. This abnormal bleeding due to progestins is a consequence of focal stromal proteolysis by increase in naked vessel size and density. We quantified the effects of VA 2914 on endometrial vascularisation, fibrillar matrix and VEGF-A expression in endometrial biopsies from 41 women before and after 12 weeks daily treatment (2,5 , 5 or 10 mg/d VA 2914 versus placebo). We did not observed changes in endometrial vessels, collagen network and VEGF-A distribution between the luteal phase at baseline and under VA 2914. From these observations, we can assess that VA 2914 does not behave like a progestin since it does not alter the endometrial matrix nor the pattern of endometrial vessels. Résumé : Les modulateurs sélectifs du récepteur de la progestérone ( SPRMs) constituent une nouvelle famille de stéroïdes présentant des propriétés mixtes agonistes ou antagonistes en fonction des gènes cibles, du contexte cellulaire, de la présence simultanée dautres ligands du récepteur de la progestérone (Spitz 2003). Le chef de file de cette famille, la mifépristone, est utilisé depuis plusieurs décennies pour ses propriétés abortives. Son intérêt dans la contraception post coïtale a été démontré. Des molécules aux propriétés abortives réduites sont à létude ou en cours de développement dans les domaines de la contraception, du cancer du sein, du traitement médical de lendométriose et des fibromes utérins (Pintiaux et al. 2009). Le VA2914 que nous étudions, fait partie de ces SPRMs en cours de développement. Nous avons démontré sa capacité à inhiber lovulation à partir de 5 mg administrés par voie orale quotidiennement. Il exerce une action endométriale participant vraisemblablement à leffet contraceptif . Il ninhibe pas le développement folliculaire et permet déviter la carence estrogénique observée sous progestatif antigonadotrope. A partir de la dose de 5 mg par jour, son utilisation saccompagne dun haut taux daménorrhée (Chabbert-Buffet et al. 2007). Lutilisation dun SPRM au long cours pose le problème dun endomètre soumis aux estrogènes endogènes sans opposition progestative. Limpact dun SPRM sur lendomètre varie en fonction de la molécule, de son dosage, de la présence concomitante dautres stéroïdes et de lespèce à laquelle ce SPRM est administré (Chwalisz et al. 2000). Des aspects histologiques particuliers sont décrits dans les endomètres soumis aux SPRMs. Il sagit de la coexistence daspects histologiques non présents de façon simultanée physiologiquement ( aspects sécrétoires et prolifératifs coexistant au sein du même endomètre, signes dapoptose et dactivité mitotique au sein dune même glande) (Mutter et al. 2008). La persistance dune activité mitotique est observée dans les glandes endométriales des patientes anovulatoires soumises au VA2914 (Chabbert-Buffet et al. 2007). Lutilisation de cette molécule quotidiennement et à long terme nest donc pas dactualité contrairement à son utilisation ponctuelle dans le cadre de la contraception postcoïtale (Creinin 2006). La place des SPRMs en contraception classique doit être définie. Différents schémas dadministration et différents dosages devront être évalués en termes defficacité et de sécurité. Lutilisation des SPRMs pourrait être utile pour contrer les saignements indésirables observés lors de la prise de progestatif seul. Contrairement aux patientes soumises aux progestatifs seuls, les patientes sous VA2914 présentent un haut taux d'aménorrhée. Lors du saignement physiologique menstruel comme lors de l'administration de progestatif seul, la dégradation locale du stroma endométrial et une lyse du réseau fibrillaire riche en collagène sont classiquement observées (Galant et al. 2000). Sous VA2914, nous nobservons pas de dégradation de la matrice extracellulaire (Ravet et al. 2009). Le rôle des métalloprotéases matricielles dans les saignements normaux et pathologiques de l'endomètre humain est bien connu . Le profil d'expression des métalloprotéases matricielles dans l'endomètre des patientes traitées par VA2914 à différents dosages peut contribuer à lintégrité endométriale observée. Une angiogenèse aberrante est observée sous progestatif. Une modification de la densité vasculaire endométriale et une altération de la maturation de la paroi des vaisseaux, déficitaire en péricytes et en cellules musculaires lisses ont été décrites (Hickey et al. 1999; Hickey et al. 2000; Jondet et al. 2005; Rogers et al. 1993; Stephanie et al. 2007). L'observation de la vascularisation de lendomètre exposé au dispositif intrautérin au lévonorgestrel durant 1 à 3 mois montre une augmentation très importante (11,5 fois) des petits vaisseaux non matures constitués exclusivement d'un endothélium. Le nombre de vaisseaux partiellement matures est augmenté de 6 fois. Au plus long cours, ces vaisseaux immatures ou partiellement matures restent néanmoins 4 fois plus fréquents que dans les endomètres non soumis à cette thérapeutique. La surface vasculaire et la densité augmentent au cours du temps sous ce dispositif hormonal (Stephanie et al. 2007). De telles modifications ne sont pas observées sous VA2914 et peuvent contribuer à l'absence de saignement. Au cours du cycle témoin, nous avons observé la présence de vaisseaux matures, représentant 80 % de la surface vasculaire totale. Après 3 mois de traitement sous VA2914 aux différentes doses, aucun changement vasculaire n'est observé. Sous VA2914, nous ne constatons pas de modification de l'expression du VEGFA ni de modification de sa distribution qui apparaît prédominante au niveau de la portion apicale des cellules épithéliales de surface et glandulaires. L'absence de modification de la distribution et de l'intensité du marquage du VEGFA (Vascular endothelial growth factor) et la stabilité du rapport Ang-1/Ang-2 avant et sous traitement par VA2914 n'est pas en faveur d'un remodelage vasculaire important (Ravet et al. 2009). Au niveau du réseau vasculaire endométrial, le VA2914 ne paraît donc pas se comporter comme un agoniste du récepteur de la progestérone.

Les hémorragies endométriales sont une cause fréquente de consultation gynécologique. Lapparition de ces saignements est probablement facilitée par des perturbations du développement et de la structure des vaisseaux, ce qui est également observé lors dun traitement avec un progestatif à long terme. Toutefois, la raison du déclenchement des hémorragies reste encore obscure. Le but de notre étude a été de développer un modèle de transplantation dendomètre humain chez des souris immunodéficientes afin de déterminer les mécanismes impliqués dans lapparition de saignements utérins lors des menstruations ou liés au traitement local continu par progestatif (lévonorgestrel). Dans ce travail, nous avons étudié les vaisseaux sanguins endométriaux (nombre, taille, maturation), lexpression des enzymes protéolytiques (métalloprotéinases matricielles ou MMPs) et des récepteurs hormonaux aux strogènes et à la progestérone en présence ou non dun progestatif (lévonorgestrel). Nous avons également étudié laction combinée du progestatif et dun inhibiteur de MMPs dans le but de prévenir les saignements utérins. La meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant ces pathologies devrait ouvrir des nouvelles perspectives thérapeutiques que le modèle que nous avons mis au point permettra de tester.

Evidence from an abundant number of studies suggests that human female reproductive functions have become impaired over the past half century and that there might be a relationship between endocrine disrupting chemicals (EDCs) and reduced fertility. It is, however, not known by what mechanisms EDCs affect different reproductive functions such as endometrial receptivity, embryo implantation and placentation. The endometrium is continuously changing its morphological and functional properties, responding to cyclic changes of oestrogen and progesterone levels during the menstrual cycle. These changes include monthly preparation for embryo implantation through changed endometrial angiogenic activity and consequent changes in endometrial vasculature. Use of primary human endometrial endothelial cells (HEECs) in this work was evaluated as a possible screening tool for effects caused by EDCs on human endometrial vasculature and subsequently on various endometrial functions. In this study HEEC and endometrial stromal cells were isolated. HEECs were grown in monocultures, and together with stromal cells in co-cultures, and exposed to endocrine active substances. These were cadmium, which has oestrogenic properties, tamoxifen, with anti-oestrogenic effects, mifepristone, which is an anti-progestin, and bisphenol A, with oestrogenic properties. The effects were evaluated by using proliferation and viability assays, migration and tube formation assays, quantitative PCR (qPCR), immunohistochemistry and western blot. Cadmium affected the expression of angiogenesis-related genes, and caused different effects in HEECs cultured alone vs. HEECs co-cultured with stromal cells. Tamoxifen altered the expression of angiogenesis-related genes and reduced HEEC migration, thus having an anti-angiogenic effect. Mifepristone caused reduced formation of tubular structures in tube-formation assays involving HEECs co-cultured with stromal cells. Bisphenol A promoted tube formation in co-cultured HEECs which was related to changes in the expression of several angiogenesis-related genes as well as up-regulated expression of VEGF-D protein. In conclusion, we showed that EDCs have the ability to induce changes in endometrial angiogenic activity in vitro and may thus disturb normal endometrial functions related to fertility and pregnancy. HEECs grown in vitro may provide valuable information on the effects of EDCs on human endometrial functions. However, this model is not suitable as a large-scale screening tool.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2001. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 180-198). Also available on the Internet.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2009. / Härtill 4 uppsatser.

published_or_final_version / Medical Sciences / Master / Master of Medical Sciences

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri-Columbia, 2008. / "May 2008" The entire dissertation/thesis text is included in the research.pdf file; the official abstract appears in the short.pdf file (which also appears in the research.pdf); a non-technical general description, or public abstract, appears in the public.pdf file. Vita. Includes bibliographical references.