京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13384号 / 論医博第2216号 / 新制||医||1048(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 高橋 淳, 教授 渡邊 直樹, 教授 中川 一路 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Le bourgeonnement est l'étape finale du cycle viral du virus VIH. Les particules virales vont devoir modifier la topologie de la membrane plasmique afin de promouvoir leur libération dans le milieu extracellulaire ; cette étape est réalisée par le recrutement de protéines ESCRT (en particulier CHMP4 et CHMP2) au point de bourgeonnement. A ce jour, les détails moléculaires de ce recrutement sont méconnus. Lethal Giant Discs (LgD) a été décrite dans la littérature comme un régulateur du traffic endosomal, et une interaction avec CHMP4B a été proposée pour l'orthologue humain CC2D1A. Un point majeur de ce travail aura été de caractériser l'interaction CC2D1A.CHMP4B, mais également de mieux comprendre l'organisation de la protéine. En particulier j'ai résolu la structure d'un fragment de LgD à 2.4 Å, comprenant une région hélicale et un domaine C2 en c-terminal. En outre, nous montrons que CC2D1A inhibe la capacité de CHMP4B à polymériser in vitro. A partir d'une structure cristallographique de CHMP4B et de données biochimiques, nous montrons que le site d'interaction de CC2D1A sur CHMP4B est impliqué dans la polymérisation de CHMP4B, et important pour la fonction de la protéine dans le contexte du bourgeonnement du HIV. Un projet parallèle m'a également conduit à définir un protocole de purification de la protéine CHMP2B recombinante sous forme monomérique, cet isoforme ayant été récemment impliqué dans la formation de structures tubulaires à la membrane plasmique et dans des activités de scission membranaire. En particulier, j'ai pû caractériser la protéine en présence de liposomes et préciser de nouveaux partenaires cellulaires. / Budding is the final step of HIV infection. Viral particles will have to modify the topology of the plasma membrane in order to achieve their correct release from the infected cell, by recruiting ESCRT proteins at the budding point, and among them CHMP4 and CHMP2 isoforms. So far, the molecular details of this recruitment are not precisely known.. Lethal Giant Discs (LgD) has been descibed in the litterature as a regulator of endosomal trafficking, and an interaction with CHMP4B has been proposed. A major point of this research is to propose a structural basis for this interaction, as well as a better understanding of the role and general organization of LgD/CC2D1A. The crystal structure of a LgD fragment (comprising a predicted coiled-coil motif and a c-terminal C2 domain) was solved in our lab at 2.4 A. Moreover, we show that CC2D1A impairs in vitro the ability of CHMP4B to polymerize. Based on a crystallographic structure of CHMP4B and biochemical data, we also show that the binding site of CC2D1A on CHMP4B is itself involved in polymerization, in the context of HIV budding. As a side project, I've also set up a protocole to obtain pure monomeric CHMP2B, which has been shown to polymerize at the plasma membrane, and I've characterized the protein in the presence of liposomes, along with new partners.

L’autophagie est une voie catabolique durant laquelle des constituants cytoplasmiques sont engloutis dans des vésicules à double membrane nommées autophagosomes. Elle sert à éliminer les protéines mal repliées ou les agrégats protéiques, à détruire les organites défectueux comme les mitochondries, le réticulum endoplasmique et les peroxysomes mais aussi des pathogènes intracellulaires. Le matériel séquestré dans les autophagosomes est ensuite envoyé, pour dégradation, vers le lysosome. La dégradation du matériel séquestré génère des nucléotides, des acides aminés et des acides gras qui seront recyclés en vue de la synthèse de macromolécules et de la génération d’ATP.Dans cette étude nous explorons l’aspect cellulaire et fonctionnel de la voie de l’autophagie chez Caenorhabditis elegans. Nous montrons que le génome du nématode contient deux homologues du gène autophagique de levure Atg8. Ces homologues codent pour les protéines LGG-1 et LGG-2 qui sont des protéines des membranes des autophagosomes. Ces protéines agissent de façon synergique dans les processus physiologiques impliquant l’autophagie, en l’occurrence, la longévité et la formation des larves dauer.Nous montrons également que l’autophagie est impliquée dans le maintien de l’homéostasie cellulaire chez les mutants ESCRT. Les complexes ESCRT sont impliqués dans l’adressage des protéines ubiquitinées vers les corps multi vésiculaires pour les dégrader. Les mutants ESCRT se caractérisent par des altérations cellulaires et développementales. Nos résultats indiquent que l’inactivation des ESCRT cause une augmentation du flux autophagique. L’inactivation de l’autophagie dans ces mutants exacerbe les défauts cellulaires alors que son induction protège de la dégradation. / Macroautophgagy is a catabolic process involved in the clearance of cellular components in the lysosome when cells face starvation conditions. This eukaryotic process requires the formation of double membrane vesicles named autophagosomes. Autophagy is implicated in the elimination of misfolded proteins, protein aggregates and long-lived or damaged organelles such as mitochondria, endoplasmic reticulum and peroxysomes. It is alos required for the clearance of intracellular pathogens. The material enclosed inside autophagososmes in degraded in the lysosome: nucleotides, amino-acids and fatty-acids are generated and reused for neosynthesis of macromolecules and ATP.In the present study, we are exploring the cellular and functional aspects of the autophagic pathway in Caenorhabditis elegans. We show that the genome of the worm contain two homologues of the Yeast autophagic gene, Atg8. These homlogues encode for two proteins namely, LGG-1 and LGG-2, which localize to the autophagosomal membranes. We have shown that this two proteins act synergistically in dauer formation and longevity.We have also shown that autophagy play an important role in maintaining cell homeostasis in endosomal maturation mutans. These latter mutants show defects in the ESCRT coplexes (Endosomal Sorting Complex Required for Transport). ESCRT complexes are required the recycling of cell surface receptors and for the sorting of ubiquitinated prtoteins into the multivesicular bodies. Mutations in the ESCRTs cause cellular et developmental defects. In our study, we show that autophagy is induced in these mutants and play a beneficial role in correcting cellular defects.