L’embolie pulmonaire survient lorsqu’un élément vient obstruer la micro-circulation pulmonaire et/ou endommager l’endothélium vasculaire local. Cette pathologie est associée à la libération de médiateurs vasoactifs, au développement d’une hypoxie artérielle et à des désordres hémodynamiques et respiratoires locaux et périphériques. L’embolie pulmonaire gazeuse (EPG) est attribuable à l’infiltration de bulles d’air au sein de la micro-circulation périphérique puis pulmonaire. Aucune stratégie présentement disponible pour traiter l’EPG n’a mené à une utilisation clinique à grande échelle. Il est alors nécessaire d’étudier les mécanismes impliquant les divers médiateurs dans cette pathologie, afin de développer un traitement efficace contre les désordres hémodynamiques variés que présentent les patients souffrant d’EP. Les endothélines (ETs; ET-1, -2, -3) forment une famille de médiateurs ayant une action vasoconstrictrice et bronchoconstrictrice. Ces trois isopeptides sont exprimés et libérés directement par les cellules endothéliales du poumon, mais aussi par les cellules musculaires lisses pulmonaires et vasculaires, ainsi que par les macrophages et les glandes submucosales. Les deux publications insérées dans ce mémoire tendent à démontrer que les premiers médiateurs libérés suite à l’induction d’une EPG aigüe seraient des membres de la famille des endothélines, notamment l’endothéline-1. Ces études s’intéressent à l’implication pharmacologique de cette hypothèse en évaluant l’efficacité de différentes molécules synthétisées dans l’objectif de bloquer l’action du système des endothélines, ainsi que leur intérêt pour le traitement de l’embolie pulmonaire. Les résultats présentés dans cet ouvrage portent sur l’étude d’un antagoniste de récepteur de l’endothéline et d’un inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’endothéline. Ces deux bloqueurs diminuent l’étendu des dysfonctions cardio-respiratoires, mais ne préviennent pas l’effondrement circulatoire systémique qui survient peu après le début de l’induction de la pathologie. De plus, afin d’obtenir un modèle expérimental pré-clinique encore plus représentatif de la pathologie humaine, quelques améliorations ont été apportées au modèle de rat d’EPG aigüe élaboré préalablement par notre laboratoire. / Pulmonary embolism (PE) is caused by the physical obstruction and subsequent injuries to the pulmonary microvasculature. This pathology is associated with the liberation of vasoactive mediators, and with the development of arterial hypoxia and local and systemic respiratory disorders. Pulmonary air embolism (PAE) is caused by air bubbles’ infiltration into the systemic blood circulation, then into pulmonary blood circulation. Until now, no strategy has lead to a large-scale clinical use for the treatment of PAE. Thus, it becomes necessary to study the mechanisms of this pathology implicating various mediators, with the objective of developing an efficient treatment against the different hemodynamic disorders observed in PAE affected patients. Endothelins (ETs; ET-1, -2, -3) form a family of vasoconstrictor and bronchoconstrictor mediators. These three isopeptides are expressed and secreted by endothelial cells in the lung, but also by pulmonary and vascular smooth muscle cells and macrophages. Both publications included in this thesis tend to demonstrate that the first mediators secreted following an acute PAE induction are part of the Endothelins family, especially Endothelin-1. The studies focussed on the pharmacological implication of this hypothesis by evaluating the efficiency of various molecules synthesized to block the action of the Endothelins system, and their interest for the treatment of PE. Studies presented in this work used an Endothelin receptor antagonist or an Endothelin-converting-enzyme inhibitor. These two blockers decreased the extent of cardio-respiratory disorders related to PAE, but did not prevent the systemic circulatory collapse observed shortly after the beginning of the induction of the pathology. With the idea of developing a pre-clinical experimental rat model more representative of the human pathology of acute PAE, some improvements have been made on the model previously developed by our laboratory.

L'administration systémique de gènes représente une voie intéressante pour le traitement par thérapie génique de la mucoviscidose ou des cancers pulmonaires. Dans cette optique, les polyplexes (complexes ADN/polymère cationique) doivent atteindre le poumon et traverser les vaisseaux sanguins pour transfecter les cellules épithéliales mutées ou les cellules cancéreuses. Il existe peu de données sur le passage transendothélial de polyplexes. Afin d'en améliorer les connaissances, nous avons mis au point un modèle d'endothélium microvasculaire pulmonaire et étudié l'influence de la polarisation cellulaire sur les voies d'internalisation de polyplexes formés avec la polylysine histidylée (pLK-His) et la polyéthylènimine (PEI), leur efficacité de transfection, leur capacité à traverser la barrière endothéliale et leur adhésion sur la monocouche de cellules endothéliales en conditions de flux. Les travaux réalisés montrent que la polarisation des cellules endothéliales diminue l'internalisation et l'efficacité de transfection des polyplexes pLK-His mais pas celles des polyplexes PEI. Par contre, la polarisation des cellules épithéliales n'a pas d'influence sur l'efficacité des polyplexes pLK-His. Les polyplexes pLK-His et PEI sont capables de traverser la monocouche de cellules endothéliales et transfecter des cellules épithéliales à la fois par leur côté apical et basolatéral. L'incubation des cellules endothéliales avec des cytokines pro-inflammatoires permet d'augmenter ce passage. Enfin, l'adhésion des polyplexes sur les cellules endothéliales est plus importante dans les conditions de flux des microvaisseaux que dans les conditions de flux des veines. L'adhésion des polyplexes PEI est légèrement supérieure à celle des polyplexes pLK-His. Des polyplexes formés avec une PEI sur laquelle a été greffée des motifs de tétraglucose spécifiques des cellules endothéliales adhèrent trois fois plus que les polyplexes formés avec la PEI ce qui montre un ciblage des cellules endothéliales pulmonaires en conditions de flux. L'ensemble des résultats montre qu'il est indispensable de mieux considérer les effets des conditions physiologiques des cellules (polarisation, effets du flux sanguin, conditions d'inflammation) sur la transfection pour concevoir de nouveaux vecteurs synthétiques afin d'améliorer leur efficacité in vivo.

Les protéines kinases sont importantes dans de nombreux processus biologiques comme la prolifération, la différenciation, la migration, l’apoptose cellulaire et dans le maintien de l’intégrité de l’ADN. Dans de nombreuses pathologies comme le cancer, ces kinases sont anormalement suractivées. Pour ces raisons, plusieurs inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) ont été développés comme le dasatinib (Sprycel®), un ITK ciblant principalement le BCR-Abl et la famille SRC, qui montre une grande efficacité contre la leucémie myéloïde chronique. Cependant, le dasatinib présente aussi d’importants effets indésirables qui se manifestent au niveau pulmonaire, comme le développement d’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) et l’apparition d’épanchements pleuraux dont l’incidence est respectivement de 0,45% et de 15-35%. Ces effets secondaires représentent donc un problème majeur de santé publique. Les mécanismes impliqués dans ces effets indésirables ne sont pas connus.Mon projet de thèse entre donc dans l’étude des mécanismes par lesquels le dasatinib peut induire ces effets indésirables. Dans ce contexte, nous avons testé l’hypothèse que l’utilisation du dasatinib est associée à l’inhibition inappropriée d’une ou de plusieurs kinases qui jouent un rôle central dans l’intégrité de l’endothélium pulmonaire.Mon travail s’est articulé autour de trois grands axes : (1) Le premier axe a visé à déterminer le rôle des atteintes de la perméabilité endothéliale par le dasatinib dans l’apparition d’épanchement pleural ; (2) Le deuxième axe a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans l’HTAP induite par le dasatinib ; (3) Le troisième axe a permis d’identifier le rôle de l’inhibition de la protéine kinase c-Abl dans l’intégrité de la cellule endothéliale pulmonaire.L’ensemble de nos données montre que le dasatinib altère, à forte dose, les fonctions des cellules endothéliales pulmonaires et ainsi fragilise l’intégrité vasculaire. Tout d’abord, nous avons en effet pu mettre en évidence qu’un traitement quotidien à fortes doses de dasatinib chez le rat augmente la perméabilité endothéliale et conduit à l’apparition d’épanchements pleuraux. De manière intéressante, nous avons pu démontrer que cette augmentation de perméabilité endothéliale est liée à une génération de dérivés oxygénés capable de redistribuer les protéines de jonctions intercellulaires. Deuxièmement, nous avons pu mettre en évidence que le dasatinib, à forte dose, induit une apoptose des cellules endothéliales (CE) pulmonaires, un phénomène lié en partie à la génération d’un stress oxydant d’origine mitochondriale. De plus, nous avons noté que des prétraitements de rats avec du dasatinib conféraient une prédisposition à l’hypertension pulmonaire expérimentale par la mise en place d’une dysfonction endothéliale. Ces dernières observations n’ont pas été retrouvées avec d’autres ITK proches du dasatinib comme l’imatinib. Enfin, nous avons pu identifier que c-Abl est une protéine kinase clef de l’intégrité de la cellule endothéliale pulmonaire. En effet, son inhibition par certain ITK conduit à un défaut de réparation des cassures ADN et ainsi à une altération de certaines fonctions des cellules endothéliales.En conclusion, les effets indésirables pulmonaires associés au dasatinib semblent directement liés à une perte de l’homéostasie de l’endothélium pulmonaire par des mécanismes faisant appel à la génération de stress oxydatif mitochondrial, à l’induction d’apoptose et à la perte de perméabilité vasculaire. / By catalysing reversible phosphorylation of their substrates, protein kinases play central role in regulating a multitude of cellular processes, including division, proliferation, apoptosis, and differentiation as well as in the maintenance of DNA integrity. Since deregulation of different protein kinases contribute to several human disorders, a multitude of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) inhibiting various kinases have been developed and some of them are currently approved for different indications, and many more are under development. Dasatinib (Sprycel®), an orally available short-acting dual ABL/SRC tyrosine kinase inhibitor (TKI), is an effective treatment for Philadelphia-positive chronic myelogenous leukemia (CML) and for all phases of Philadelphia-positive CML with resistance or intolerance to prior therapy, including imatinib. However, dasatinib treatment is associated with the development of pulmonary arterial hypertension (PAH; 0.45%) and pleural effusion (15-35%). These serious pulmonary adverse events represent a serious public health problem.Therefore, my PhD project is seeking to identify the underlying molecular mechanisms responsible for these pulmonary adverse events induced by dasatinib. My work has followed three different strategic axes seeking to: 1) Determine whether dasatinib alters endothelial integrity, resulting in increased pulmonary vascular endothelial permeability and pleural effusion; 2) Study the mechanisms involved in the long-term development of dasatinib-induced PAH; 3) Precise the role of c-Abl protein kinase inhibition in pulmonary endothelial cell DNA integrity.First, our data indicate that dasatinib can lead to pulmonary endothelial dysfunction and thus affect vascular integrity. Interestingly, we demonstrated that this increased endothelial permeability is a reactive oxygen species (ROS)-dependent mechanism in vitro and in vivo. Second, we also found that high doses of dasatinib induce pulmonary endothelial cell apoptosis by increasing mitochondrial oxidative stress and cause endothelial cell apoptosis. Consistent with these observations, we found that pretreatment of rats with dasatinib leads pulmonary endothelial dysfunction and confers increased susceptibility to experimental pulmonary hypertension (PH) in contrast to rats pretreated with imatinib or vehicle. Finally, we identified c-Abl as a key protein kinase in pulmonary endothelial cells, since its inhibition by dasatinib and ponatinib leads to impaired DNA repair in human pulmonary endothelial cells.Taken together, my PhD results demonstrate the importance played by damage to the pulmonary endothelium in the onset of dasatinib-induced PAH and pleural effusion.

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