Die Eph-Familie, welche die Eph-Rezeptoren und die ephrin-Liganden umfasst, repräsentiert die größte Subgruppe der Rezeptortyrosinkinasen. Sowohl die Eph-Rezeptoren als auch die ephrin-Liganden sind Membran-assoziierte Proteine, deren Interaktion einen Typ der Zellkontakt-vermittelten Kommunikation darstellt und vielfältigste zelluläre Funktionen beeinflusst. Die aktuellen Eph/ephrin-bezogenen Forschungsschwerpunkte liegen vor allem im Bereich der Entwicklungs- und Tumorbiologie, wie z.B. dem Einfluss der Eph-Familie auf Angiogenese und Axonaussprossung. Die Rolle des Eph/ephrin-Systems in der Entwicklung der Atherosklerose und bei Reparaturmechanismen wie der Reendothelialisierung ist jedoch noch weitgehend unerforscht. Die vorliegende Arbeit befasst sich anhand von in vitro Experimenten mit HUVEC und HUAEC mit dem Einfluss des Liganden ephrin-A1 und des Rezeptors EphA2 auf die endotheliale Proliferation und Migration als elementare Mechanismen der Reendothelialisierung.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V ABBILDUNGSVERZEICHNIS IX TABELLENVERZEICHNIS XI 1 EINLEITUNG 1 1.1 Die Rolle des Endothels in der Atherosklerose 1 1.2 Die Migration von Endothelzellen 6 1.3 Die Eph-Familie 9 1.4 Potentielle Funktionen der Eph-Familie in der endothelialen Proliferation und Migration 14 1.5 Zielstellung der Arbeit 16 2 MATERIAL 17 2.1 Geräte 17 2.2 Zellkulturmaterial 18 2.3 Verwendete Kulturmedien 18 2.4 Verwendete Zelllinien und E. coli Stämme 19 2.5 Verwendete Kit-Systeme 19 2.6 Verwendete Oligonukleotide 20 2.7 Verwendete Plasmide 21 2.8 Konstruierte Plasmide 23 2.9 Chemikalien 23 2.10 Puffer, Gele, Lösungen 23 3 METHODEN 24 3.1 Zellbiologische Methoden 24 3.2 Proteinbiochemische Methoden 28 3.3 Molekularbiologische und gentechnische Methoden 32 3.4 Scratch Assay 44 3.5 Beurteilung der Zellproliferation mittels BrdU-Inkorporation 44 3.6 Wundheilungsassay 45 3.7 Migrationsassay 48 3.8 Baculovirale Talin-RFP- und Aktin-GFP-Expression 49 3.9 Datenanalyse und statistische Auswertung 49 4 ERGEBNISSE 50 4.1 Molekularbiologische und proteinbiochemische Charakterisierung verschiedener Eph/ephrine in proliferierenden Endothelzellen 50 4.2 Molekularbiologische Charakterisierung von ephrin-A1, EphA2 und EphA4 unter Kontaktinhibition in HUVEC 56 4.3 Einfluss eines Zellzyklusarrests auf die Expression verschiedener ephrin-Liganden und Eph-Rezeptoren in Endothelzellen 58 4.4 Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 mittels siRNA 63 4.5 Einfluss einer siRNA-vermittelten Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 auf die Proliferation von HUVEC 65 4.6 Überexpression von ephrin-A1 mittels eines adenoviralen Vektors 67 4.7 Einfluss einer Überexpression von ephrin-A1 auf die Proliferation von HUVEC 68 4.8 Reinitiation von Proliferation und Migration in HUVEC mittels Scratch Assay 69 4.9 Einfluss der Modulation des ephrin-A1- sowie EphA2-Gehaltes auf das Wundheilungsverhalten von HUVEC 73 4.10 Charakterisierung des Migrationsverhaltens von HUVEC unter veränderter ephrin-A1-Expression mittels live cell imaging 75 4.11 Einfluss einer veränderten ephrin-A1-Expression auf den EphA2-Phosphorylierungsstatus 78 4.12 Grenzzonenverhalten von HUVEC an ephrin-A1-beschichteten Oberflächen 80 4.13 Fluoreszenzmikroskopische Charakterisierung fokaler Adhäsionen und des Aktin-Zytoskelettes unter modulierter ephrin A1 Expression 81 5 DISKUSSION 84 5.1 Die Eph-Familie im Kontext der Reendothelialisierung 84 5.2 Einfluss des Eph/ephrin Systems auf das Proliferationsverhalten von Zellen 86 5.3 Auswirkungen einer ephrin-A1-EphA2-Wechselwirkung auf die Proliferation 90 5.4 Einfluss der Eph-Familie auf die zelluläre Migration und Wundheilung 93 5.5 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick 106 6 ZUSAMMENFASSUNG 109 6.1 In deutscher Sprache 109 6.2 In englischer Sprache 111 7 LITERATURVERZEICHNIS 113 8 DANKSAGUNG 133 9 ANHANG 134 10 ERKLÄRUNGEN 138 10.1 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 138 10.2 Erklärung über die Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben im Rahmen der Dissertation 140 / The Eph-family represents the largest subgroup of tyrosine kinase receptors. Both the Eph-receptors and the ephrin-ligands are membrane-associated proteins whose interaction is a way of contact-dependent communication that influences a wide variety of cellular functions. In scientific research the Eph-family is known for its impact on developmental and tumour-biology, whereas the role of Eph-receptors and ephrin-ligands in atherosclerosis and repair mechanisms is still not well understood. The aim of the present study was to examine the influence of the ligand ephrin-A1 and its interaction with its receptor EphA2 on endothelial proliferation and migration by performing cellcultural experimentation using HUVEC and HUAEC.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V ABBILDUNGSVERZEICHNIS IX TABELLENVERZEICHNIS XI 1 EINLEITUNG 1 1.1 Die Rolle des Endothels in der Atherosklerose 1 1.2 Die Migration von Endothelzellen 6 1.3 Die Eph-Familie 9 1.4 Potentielle Funktionen der Eph-Familie in der endothelialen Proliferation und Migration 14 1.5 Zielstellung der Arbeit 16 2 MATERIAL 17 2.1 Geräte 17 2.2 Zellkulturmaterial 18 2.3 Verwendete Kulturmedien 18 2.4 Verwendete Zelllinien und E. coli Stämme 19 2.5 Verwendete Kit-Systeme 19 2.6 Verwendete Oligonukleotide 20 2.7 Verwendete Plasmide 21 2.8 Konstruierte Plasmide 23 2.9 Chemikalien 23 2.10 Puffer, Gele, Lösungen 23 3 METHODEN 24 3.1 Zellbiologische Methoden 24 3.2 Proteinbiochemische Methoden 28 3.3 Molekularbiologische und gentechnische Methoden 32 3.4 Scratch Assay 44 3.5 Beurteilung der Zellproliferation mittels BrdU-Inkorporation 44 3.6 Wundheilungsassay 45 3.7 Migrationsassay 48 3.8 Baculovirale Talin-RFP- und Aktin-GFP-Expression 49 3.9 Datenanalyse und statistische Auswertung 49 4 ERGEBNISSE 50 4.1 Molekularbiologische und proteinbiochemische Charakterisierung verschiedener Eph/ephrine in proliferierenden Endothelzellen 50 4.2 Molekularbiologische Charakterisierung von ephrin-A1, EphA2 und EphA4 unter Kontaktinhibition in HUVEC 56 4.3 Einfluss eines Zellzyklusarrests auf die Expression verschiedener ephrin-Liganden und Eph-Rezeptoren in Endothelzellen 58 4.4 Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 mittels siRNA 63 4.5 Einfluss einer siRNA-vermittelten Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 auf die Proliferation von HUVEC 65 4.6 Überexpression von ephrin-A1 mittels eines adenoviralen Vektors 67 4.7 Einfluss einer Überexpression von ephrin-A1 auf die Proliferation von HUVEC 68 4.8 Reinitiation von Proliferation und Migration in HUVEC mittels Scratch Assay 69 4.9 Einfluss der Modulation des ephrin-A1- sowie EphA2-Gehaltes auf das Wundheilungsverhalten von HUVEC 73 4.10 Charakterisierung des Migrationsverhaltens von HUVEC unter veränderter ephrin-A1-Expression mittels live cell imaging 75 4.11 Einfluss einer veränderten ephrin-A1-Expression auf den EphA2-Phosphorylierungsstatus 78 4.12 Grenzzonenverhalten von HUVEC an ephrin-A1-beschichteten Oberflächen 80 4.13 Fluoreszenzmikroskopische Charakterisierung fokaler Adhäsionen und des Aktin-Zytoskelettes unter modulierter ephrin A1 Expression 81 5 DISKUSSION 84 5.1 Die Eph-Familie im Kontext der Reendothelialisierung 84 5.2 Einfluss des Eph/ephrin Systems auf das Proliferationsverhalten von Zellen 86 5.3 Auswirkungen einer ephrin-A1-EphA2-Wechselwirkung auf die Proliferation 90 5.4 Einfluss der Eph-Familie auf die zelluläre Migration und Wundheilung 93 5.5 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick 106 6 ZUSAMMENFASSUNG 109 6.1 In deutscher Sprache 109 6.2 In englischer Sprache 111 7 LITERATURVERZEICHNIS 113 8 DANKSAGUNG 133 9 ANHANG 134 10 ERKLÄRUNGEN 138 10.1 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 138 10.2 Erklärung über die Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben im Rahmen der Dissertation 140

Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems sind trotz erheblicher Fortschritte in Diagnostik und Therapie noch immer die häufigste Todesursache in Deutschland. Neben bekannte Risikofaktoren wie Hypercholesterinämie, Hyperlipoproteinämie, Diabetes mellitus, Adipositas, Bewegungsmangel, Stress und hohem Alter wird eine pathophysiologisch erhöhte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) als Ursache für deren Entstehung diskutiert. NAD(P)H-Oxidasen, von denen 7 Isoformen der katalytischen Nox-Untereinheiten bekannt sind, stellen dabei die Hauptquelle für vaskuläre Superoxidanionen und oxidativen Stress dar. In dieser Arbeit konnte die vorrangige Bedeutung eines intrazellulär lokalisierten Nox4-haltigen NAD(P)H-Oxidase-Komplexes für die konstitutive Radikalbildung in primären humanen Endothelzellen nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass durch chronische Applikation der biomechanischen Kräfte Schubspannung und Dehnung oxidativer Stress in humanen Endothelzellen in vitro vermindert werden kann. Die Herabregulation der Superoxidanionen-Bildung sowie die vermehrte Freisetzung von NO durch chronische Applikation biomechanischer Kräfte trägt zur positiven Balance von NO/Superoxidanionen und zum vasoprotektiven Potential physiologischer Schubspannung bzw. Dehnung bei. Durch Nox4-Promotordeletionsanalysen und Mutationsstudien konnte der Transkriptionsfaktor AP-1 als entscheidend für die schubspannungsabhängige Herabregulation von Nox4 identifiziert werden. Durch Stimulation von Endothelzellen bzw. murinen Gefäßringen mit oxidiertem LDL konnte dagegen die vaskuläre ROS-Bildung in vitro und ex vivo induziert werden. Zur weiteren Aufklärung des Mechanismus der LDL-induzierten ROS-Bildung in vivo und des Einflusses von NAD(P)H-Oxidasen wurden C57BL/6 (Wildtyp)- und Nox2-/--Mäuse 10 Wochen lang mit einer fettreichen Diät (Western diet) gefüttert und anschließend der Einfluss dieser Fütterung auf die NAD(P)H-Oxidase-Expression und ROS-Bildung analysiert. In der Aorta thoracalis beider Mausstämme zeigte sich durch das fettreiche Futter ein signifikanter Anstieg der NAD(P)H-Oxidase-Aktivität im Vergleich zum Standardfutter. Durch Western diet-Fütterung wurde die Nox4-mRNA-Expression in der A. thoracalis von Nox2-/--Mäuse und die p22phox-mRNA-Expression in beiden Mausstämmen induziert. Die Analyse weiterer Organe (Herz, Niere) zeigte keine Induktion von NAD(P)H-Oxidase-Untereinheiten durch Western diet-Fütterung. Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für eine entscheidende Rolle der Nox4-haltigen NAD(P)H-Oxidase bei der vaskulären Radikalbildung in vitro und in vivo. / Cardiovascular diseases are the most common causes of death in Germany. Beside the known risk factors hypercholesteremia, hyperlipoproteinemia, diabetes mellitus, obesity, sedentary lifestyle, stress and high age, a pathophysiologically increased formation of reactive oxygen species (ROS) are discussed as cause of development of cardiovascular diseases. Nicotine adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase complexes have been identified as main source of oxidative stress and vascular superoxide anions. There are 7 known isoforms of the catalytic Nox subunit of the NADPH oxidase. In this dissertation it was shown that NADPH oxidase subunit Nox4 is the major Nox isoform in human endothelial cells. Nox4 could be localized in the perinuclear space. Overexpression of Nox4 enhanced endothelial superoxide anion formation. Furthermore, a reduction of oxidative stress could be demonstrated by chronic application of the biomechanical forces laminar shear stress and cyclic strain in endothelial cells in vitro. The observed downregulation of superoxide anion formation and upregulation of NO formation by application of biomechanical forces contribute to the positive balance between NO and superoxide anion and the vasoprotective potential of physiological shear stress and cyclic strain. Molecular cloning and functional analysis of the human Nox4 promoter revealed that an AP-1 binding site is essential for downregulation of Nox4 by laminar shear stress. On the other hand stimulation of endothelial cells and murine vessels with oxidized lipids caused an upregulation of vascular ROS production in vitro and ex vivo. In order to examine the mechanism of LDL induced ROS formation and the influence of NADPH oxidase, C57BL/6 (wild-type) and Nox2-/- mice were feed with a diet high in fat and sugar (Western-type diet) for 10 weeks. After feeding, the influence of diet on the expression of NADPH oxidase and ROS production was analyzed in the A. thoracalis. Both mice strains showed a significant upregulation of aortic ROS production in comparison to normal chow. The mRNA expression of aortic Nox4 was induced in Nox2-/- mice. Furthermore, the aortic p22phox mRNA expression was upregulated in both mice strains. The analysis of other organs (heart, kidney) showed no influence of the Western-type diet. In conclusion, the results demonstrate a major role of a Nox4 containing NADPH oxidase in the vascular radical formation in vitro and in vivo.

Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems sind trotz erheblicher Fortschritte in Diagnostik und Therapie noch immer die häufigste Todesursache in Deutschland. Neben bekannte Risikofaktoren wie Hypercholesterinämie, Hyperlipoproteinämie, Diabetes mellitus, Adipositas, Bewegungsmangel, Stress und hohem Alter wird eine pathophysiologisch erhöhte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) als Ursache für deren Entstehung diskutiert. NAD(P)H-Oxidasen, von denen 7 Isoformen der katalytischen Nox-Untereinheiten bekannt sind, stellen dabei die Hauptquelle für vaskuläre Superoxidanionen und oxidativen Stress dar. In dieser Arbeit konnte die vorrangige Bedeutung eines intrazellulär lokalisierten Nox4-haltigen NAD(P)H-Oxidase-Komplexes für die konstitutive Radikalbildung in primären humanen Endothelzellen nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass durch chronische Applikation der biomechanischen Kräfte Schubspannung und Dehnung oxidativer Stress in humanen Endothelzellen in vitro vermindert werden kann. Die Herabregulation der Superoxidanionen-Bildung sowie die vermehrte Freisetzung von NO durch chronische Applikation biomechanischer Kräfte trägt zur positiven Balance von NO/Superoxidanionen und zum vasoprotektiven Potential physiologischer Schubspannung bzw. Dehnung bei. Durch Nox4-Promotordeletionsanalysen und Mutationsstudien konnte der Transkriptionsfaktor AP-1 als entscheidend für die schubspannungsabhängige Herabregulation von Nox4 identifiziert werden. Durch Stimulation von Endothelzellen bzw. murinen Gefäßringen mit oxidiertem LDL konnte dagegen die vaskuläre ROS-Bildung in vitro und ex vivo induziert werden. Zur weiteren Aufklärung des Mechanismus der LDL-induzierten ROS-Bildung in vivo und des Einflusses von NAD(P)H-Oxidasen wurden C57BL/6 (Wildtyp)- und Nox2-/--Mäuse 10 Wochen lang mit einer fettreichen Diät (Western diet) gefüttert und anschließend der Einfluss dieser Fütterung auf die NAD(P)H-Oxidase-Expression und ROS-Bildung analysiert. In der Aorta thoracalis beider Mausstämme zeigte sich durch das fettreiche Futter ein signifikanter Anstieg der NAD(P)H-Oxidase-Aktivität im Vergleich zum Standardfutter. Durch Western diet-Fütterung wurde die Nox4-mRNA-Expression in der A. thoracalis von Nox2-/--Mäuse und die p22phox-mRNA-Expression in beiden Mausstämmen induziert. Die Analyse weiterer Organe (Herz, Niere) zeigte keine Induktion von NAD(P)H-Oxidase-Untereinheiten durch Western diet-Fütterung. Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für eine entscheidende Rolle der Nox4-haltigen NAD(P)H-Oxidase bei der vaskulären Radikalbildung in vitro und in vivo. / Cardiovascular diseases are the most common causes of death in Germany. Beside the known risk factors hypercholesteremia, hyperlipoproteinemia, diabetes mellitus, obesity, sedentary lifestyle, stress and high age, a pathophysiologically increased formation of reactive oxygen species (ROS) are discussed as cause of development of cardiovascular diseases. Nicotine adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase complexes have been identified as main source of oxidative stress and vascular superoxide anions. There are 7 known isoforms of the catalytic Nox subunit of the NADPH oxidase. In this dissertation it was shown that NADPH oxidase subunit Nox4 is the major Nox isoform in human endothelial cells. Nox4 could be localized in the perinuclear space. Overexpression of Nox4 enhanced endothelial superoxide anion formation. Furthermore, a reduction of oxidative stress could be demonstrated by chronic application of the biomechanical forces laminar shear stress and cyclic strain in endothelial cells in vitro. The observed downregulation of superoxide anion formation and upregulation of NO formation by application of biomechanical forces contribute to the positive balance between NO and superoxide anion and the vasoprotective potential of physiological shear stress and cyclic strain. Molecular cloning and functional analysis of the human Nox4 promoter revealed that an AP-1 binding site is essential for downregulation of Nox4 by laminar shear stress. On the other hand stimulation of endothelial cells and murine vessels with oxidized lipids caused an upregulation of vascular ROS production in vitro and ex vivo. In order to examine the mechanism of LDL induced ROS formation and the influence of NADPH oxidase, C57BL/6 (wild-type) and Nox2-/- mice were feed with a diet high in fat and sugar (Western-type diet) for 10 weeks. After feeding, the influence of diet on the expression of NADPH oxidase and ROS production was analyzed in the A. thoracalis. Both mice strains showed a significant upregulation of aortic ROS production in comparison to normal chow. The mRNA expression of aortic Nox4 was induced in Nox2-/- mice. Furthermore, the aortic p22phox mRNA expression was upregulated in both mice strains. The analysis of other organs (heart, kidney) showed no influence of the Western-type diet. In conclusion, the results demonstrate a major role of a Nox4 containing NADPH oxidase in the vascular radical formation in vitro and in vivo.

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Die Schädigung des Organs durch Ischämie-Reperfusion (IR) im Rahmen der kadaverischen Organtransplantation hat bedeutenden Anteil an der Pathogenese verzögert einsetzender Organfunktion und Auswirkungen auf das Langzeitüberleben des Transplantats. In der vorliegenden Studie sollte der Einfluss unspezifischer Schädigung durch IR verglichen mit spezifischen Alloantigen-abhängigen Mechanismen während der Frühphase nach der Transplantation sowie die Auswirkungen prolongierter Aufbewahrung auf Schädigung und Immunogenität des Organs ermittelt werden. Nach vorausgegangener vierstündiger kalter Ischämiezeit wurden Organe aus syngen (Lew/Lew) und allogen (F344/Lew) transplantierten Ratten an 8 aufeinander folgenden Zeitpunkten innerhalb der ersten 10 Tage zu funktionellen, immunhistochemischen und morphologischen Veränderungen untersucht. In weiteren Gruppen wurden syngen transplantierte Organe 24 Stunden nach der Transplantation untersucht, die zuvor ansteigenden kalten Ischämiezeiten zwischen 2 und 48 Stunden ausgesetzt wurden. Im zeitlichen Verlauf zeigten sich bis 7 Tage nach der Transplantation keine wesentlichen Unterschiede zu Nierenfunktion, Morphologie, Zellinfiltration und Expression von Adhesionsmolekülen zwischen allogenen und isogenen Gruppen. Die zunächst eintretende Verschlechterung der Nierenfunktion war begleitet von einem Einstrom neutrophiler und monozytärer Zellen und morphologischen Veränderungen im Sinne von akuter Tubulusnekrose (ATN). Unter zunehmender Infiltration von Monozyten/Makrophagen kam es funktionell und morphologisch zur Regeneration. Neutrophile traten vornehmlich über Interaktion von ICAM-1/LFA-1 und Monozyten/Makrophagen über VCAM-1/VLA-4 aus dem Gefäßsystem aus. Gabe von Cyclosporin A führte zu signifikanter Reduktion ED-1-positiver Makrophagen nach 10 Tagen, ohne jedoch den Anteil des aktivierten Makrophagensubtyps ED-2 zu beeinflussen. Ansteigende kalte Aufbewahrung des Organs führte zu größerer vaskulärer Schädigung, die sich durch abnehmende Intensität und lückenhaftere Verteilung von PECAM-1 auf dem Endothel äußerte. Die Zunahme der Intensität von Tissue Factor auf Endothel und infiltrierenden Leukozyten deutete neben gesteigerter Thrombogenese auf alternative Adhäsionsmechanismen hin. Diese Ergebnisse zeigen, dass innerhalb der ersten 10 Tage nach der Transplantation wichtige Phasen der Gewebeschädigung und Regeneration ausgelöst durch die Schädigung nach IR und weitestgehend ohne Beteiligung Alloantigen-abhängiger Faktoren ablaufen. Eine bedeutende Rolle als Mediatoren während dieser Phasen kommt dabei den Monozyten/Makrophagen zu. / Organ damage due to long cold preservation is associated with delayed graft function and has important effects on graft survival. Aim of this study was to determine the impact of ischemia-reperfusion (IR) injury compared to antigen-specific mechanisms and the effect of prolonged cold ischemia on intragraft injury and antigenicity during the early phase post transplantation. Rat renal grafts were four-hours cold-preserved, transplanted to syngeneic (Lew/Lew) or allogeneic recipients (F344/Lew) and harvested at 8 different time points after transplantation for further investigation of functional, immunhistochemical and histologic changes. In five additional syngen groups organs were cold preserved from 2 hours to 48 hours and harvested after 24 hours post transplantation. No significant differences in renal function, morphologic changes, cellular infiltration and expression of adhesion molecules occurred between syngeneic and allogeneic groups within the first 7 days. Initial functional impairment was accompanied by the influx of neutrophils and monocytes/macrophages together with morphologic changes reflecting acute tubular necrosis (ATN). Increasing infiltration of monocytes/macrophages paralleled functional and morphologic regeneration. Extravasation of neutrophils was mediated mainly by interaction of ICAM-1/LFA-1 and infiltration of monocytes/macrophages by VCAM-1/VLA-4. Treatment with the standard dose of Cyclosporin A (CsA) lead to a significant decrease of ED1-positive macrophage infiltration 10 days post NTx but the portion of ED2-positive macrophage subtype was not affected. Prolonged cold organ preservation lead to more severe vascular damage indicated by decreased color intensity and continuity of PECAM-1 staining on endothelial cells. Higher staining intensity for Tissue Factor (TF) on endothelium and infiltrating leukocytes implicated enhanced intragraft procoagulant capacity and alternative adhesion mechanisms. These results show that within the first 10 days post transplantation phases of tissue injury and repair after ischemia-reperfusion are largely independent of the immunologic background and monocytes/macrophages play an important role as mediators during these processes.

Bei der Hornhauttransplantation (Keratoplastik) handelt es sich um die häufigste Transplantation humanen Gewebes. Das Hornhautendothel, eine empfindliche Zellschicht auf der Innenseite der Kornea, verfügt nicht über die Fähigkeit, Zellverluste durch Proliferation auszugleichen. Zwei grundsätzliche Probleme ergeben sich aus dieser Eigenschaft des kornealen Endothels für die Keratoplastik: ein Endothelzellverlust tritt zum einen während der Hornhautkonservierung vor Keratoplastik auf und führt zu einem Ausschluss vieler Transplantate, zum anderen ist er oftmals im Zuge von immunvermittelten Abstoßungsreaktionen oder in Folge chronischer Vorgänge nach Keratoplastik zu beobachten. Aus diesem Grund ist eine möglichst hohe Endothelzelldichte auf kornealen Transplantaten eine Voraussetzung für den Erfolg einer Keratoplastik. Das erste Ziel dieser Arbeit war deshalb die Übertragung des Gens für den aziden FGF (aFGF) in korneale Endothelzellen mit Hilfe des nicht-viralen Gentransfers. Dazu wurden verschiedene Lipid-Formulationen für den Gentransfer in humane korneale Endothelzellen in vitro optimiert. Der Einsatz von DAC-30 und Lipofectin für den aFGF-Gentransfer führte zu einer deutlichen Proliferationssteigerung (um ca. 50 %) der Zellen, womit der Einsatz dieses Wachstumsfaktors eine gute Möglichkeit darzustellen scheint, die prä-operative Ausgangssituation kornealer Transplantate zu verbessern. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit Untersuchungen zur Immunmodulation nach Keratoplastik. Eine Hauptrolle bei der Abstoßung kornealer Transplantate spielen CD4+ T- Lymphozyten. In anderen Transplantationsmodellen konnte durch die lokale Überexpression immunmodulatorischer Zytokine die Entstehung und Aktivierung dieser Zellen gehemmt und eine verlängerte Transplantatüberlebenszeit erzielt werden. Mit Hilfe gentherapeutischer Vektoren (Adenoviren, Liposomen) wurden die immunmodulatorischen Zytokine vIL-10 und rIL-4 ex vivo in korneale Transplantate eingebracht. Nach erfolgreichen in vitro- Untersuchungen zur Genexpression wurden die transduzierten/transfizierten Hornhäute in einem starken Abstoßungsmodell der Ratte transplantiert, was jedoch zu keiner signifikanten Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führte. Diese Arbeit liefert Hinweise darauf, dass der lokale Gentransfer von vIL-10 in der Keratoplastik nicht für eine Immunmodulation geeignet ist, und dass sowohl die Zytokindosis, als auch der Zeitpunkt und der Ort der Vektorapplikation eine entscheidende Rolle für den Transplantationserfolg spielen. / Keratoplasty is the most common transplantation of human tissue. The corneal endothelium constitutes a damagable cell layer on the inner surface of the cornea, unable to proliferate. From this, two general problems arise for the outcome of keratoplasty: loss of corneal endothelial cells occurs on the one hand during corneal long time storage before keratoplasty and enforces the lack of donor tissue, on the other hand it is often correlated with immune mediated rejections as well as with chronic processes after keratoplasty. Therefore an endothelial cell number as high as possible on corneal grafts displays a requirement for successful keratoplasties. The first aim of this study was non-viral gene transfer of the aFGF (acidic FGF) gene in corneal endothelial cells. Different lipid formulations were optimized for gene transfer in human corneal endothelial cells in vitro. Application of DAC-30 and Lipofectin for aFGF gene transfer clearly showed a stimulating effect on cell proliferation (approximately 50 %). Thus, the use of aFGF seems to be a good possibility for improving the pre-operative situation of corneal allografts. The second part of this study deals with the immune modulation after keratoplasty. CD4+ T- lymphocytes play a key role in rejection processes after keratoplasty. Local over expression of immunomodulatory cytokines in different transplantation models could inhibit the development and activation of these cells and was able to prolong the allograft survival time. Using different gene therapeutic vectors (adenoviruses, liposomes) the immunomodulatory cytokines vIL-10 and rIL-4 were transferred ex vivo in corneal allografts. After successfully determined gene expression in vitro, the transduced/transfected corneal allografts were transplanted in a strong rejection model of the rat. However, this was not sufficient in prolonging the graft survival time significantly. This study provides indications, that local gene transfer of vIL-10 in keratoplasty is not suitable for an immune modulation, and that both cytokine dose as well as time point and site of vector application play an important role for successful transplantation.

Experimentelle Melanin-induzierte Uveitis (EMIU): Modulation der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion durch Makrophagendepletion - intravitalmikroskopische Analysen. Einleitung: Die Experimentelle Melanininduzierte Uveitis (EMIU) dient als Modell für eine autoimmune Iridozyklitis und Choroiditis. Die frühe Entzündungsreaktion ist durch eine gesteigerte Leukozyten-Endothel-Interaktion gekennzeichnet. Um die Rolle von Makrophagen bei der Induktion der EMIU zu untersuchen, analysierten wir Veränderungen der Leukozyten-Endothel-Interaktionen in Irisvenolen anästhesierter Ratten nach Makrophagendepletion mit liposomalem Clodronat. Methoden: Die EMIU wurde durch intraperitoneale Injektion einer Emulsion aus 250 µg bovinen Melanosomen in komplettem Freund Adjuvant und Pertussistoxin bei Lewis Ratten induziert. Die Tiere wurden mit 2 ml Clodronat-Liposomen (Clodronat-lip) an den Tagen 2; 1; 4; 6 beziehungsweise 8 nach Immunisierung behandelt. Kontrolltiere erhielten anstelle von Clodronat-lip Leerliposomen (Kontrolle). Für die Intravitalfluoreszenzmikroskopie wurden Leukozyten intravasal mit Rhodamin 6G gefärbt. Anschließend wurden die postkapillären Irisvenolen am 4.; 6.; 8. und 10. Tag untersucht, um die Zahl der rollenden und fest am Endothel adhärenten Leukozyten zu quantifizieren. Weitere Parameter wie Zellzahl und Proteingehalt des Kammerwassers, TNF-alpha und IFN-gamma im Plasma und das Differentialblutbild wurden zur Charakterisierung der Entzündungsreaktion herangezogen. Ergebnisse: Bei makrophagendepletierten Tieren konnten spaltlampenmikroskopisch keine entzündlichen Veränderungen des Vorderabschnittes beobachtet werden. Der prozentuale Anteil rollender Leukozyten war am 8. Tag mit 2 +/- 1.1 vs. 15.2 +/- 1.6; 5.2 +/- 0.5% (Clodronat-lip vs. EMIU; Kontrolle, Mittelwert +/- MSF, ANOVA, p

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