Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 623.pdf: 1119771 bytes, checksum: 03ec886c5b7c1e6b64f80f767a197553 (MD5) Previous issue date: 2005-03-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / The importance of the airlift bioreactor has grown in the biotechnology field by aspects as high oxygen transfer, with power input low. In this work were study the conditions heat and mass transfer, as well as the condenser efficiency in the water retention, of an airlift bench bioreactor of internal circulation of useful capacity 6 L. Such bioreactor is endowed with hollow draft tube working as a heat charger for temperature control and of aspersor type crosspiece for aspersion of air. Values of the heat transfer global coefficient (U) were certain in different operation conditions starting from applied energy balance in the system after the same to reach the steady state. Values of U varied in the range from 300 to 700 W.m-2.°C-1, showing that the device of thermal change proposed was efficient to heat removal. The results were correlated with the water flow inside the draft tube and with the feeding air flow in the bioreactor. After this stage, it was evaluated water drags of the bioreactor system plus condenser in different conditions of air flow and temperatures in the bioreactor and in the condenser. The condenser was shown efficient in the water retention, obtaining efficiency superior values to 80%, but it didn't solve the problem of water loss by water drag for the high air flows in that the airlift bioreactor is operated. The variable air flow was the variable that influenced more significantly water drags. The transfer oxygen was evaluated through the oxygen transfer volumetric coefficient (kLa). For comparison, kLa values were obtained in the airlift bioreactor operated in a range of specific feeding air flow from 1 to 5 vvm and in conventional bioreactor of 4 L, in different agitation conditions (600, 800 and 1000 rpm) and aeration (0,5 and 1,0 vvm). Two methods for kLa determination were employees, the sulfite method and the dynamic method considering the delay of the electrode answer. This last one that generated results between 2 and 6 times inferior, depending of bioreactor type, because it evaluates the kLa in coalescent media, similar to most of the media fermentation. Finally, to validate the use of the system as bioreactor, cultivations with Streptomyces clavuligerus seeking to the production of clavulanic acid, a potent inhibitor of β-lactamase, enzyme producted by patogenics microorganism that broke β-lactamic rings of antibiotics. Four cultivations were accomplished, two in airlift bioreactor and two in bioreactor conventional (Bioflo III) in two different conditions of oxygen transfer (kLa) and the results were compared in terms of clavulanic acid production. The maximum clavulanic acid concentrations obtained in the cultivations in airlift bioreactor were superior those obtained in conventional bioreactor, with minors consistence index (K), showing larger shear rate in the airlift bioreactors in the same conditions of transfer oxygen. In global terms, the obtained results suggest that bioreactor as the most appropriate for this cultivation type, justified for the appropriate heat and mass transfers formed an alliance with the smallest energy consumption. / A importância do biorreator airlift tem crescido no campo da biotecnologia por aspectos como a sua alta transferência de oxigênio, obtida através de consumo de potência. No presente trabalho foram avaliadas as condições de transferência de calor e massa, bem como a eficiência do condensador na retenção de água, de um biorreator airlift de circulação interna, onde o ar é injetado pelo centro do tubo interno, de bancada de 6 L de capacidade útil. Tal biorreator é dotado de tubo interno ( draft tube ) oco funcionando como um trocador de calor para controle de temperatura e de aspersor tipo cruzeta para aspersão de ar. Valores do coeficiente global de transferência de calor (U) foram determinados em diferentes condições de operação a partir de balanço de energia aplicado no sistema após o mesmo atingir o estado estacionário. Valores de U variaram na faixa de 300 a 700 W.m-2.°C-1, mostrando que o dispositivo de troca térmica proposto foi eficiente na remoção de calor.Os resultados foram correlacionados com a vazão de água no interior do tubo interno e com a vazão de alimentação de ar no biorreator. Após esta etapa, avaliou-se o arraste de água do sistema biorreator mais condensador em diferentes condições de vazão de ar e de temperaturas no biorreator e no condensador. O condensador mostrou-se eficiente na retenção de água, obtendo valores de eficiência superiores a 80%, mas não solucionou por completo o problema de perda de água do sistema por arraste pelos altos fluxos de ar em que se opera o biorreator airlift. A variável vazão de ar foi a variável que influenciou mais significativamente o arraste de água. A transferência de oxigênio foi avaliada através do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa). Para efeito de comparação, valores de kLa foram obtidos no biorreator airlift operado numa faixa de vazão específica de alimentação de ar de 1 a 5 vvm e em biorreator convencional de 4 L, em diferentes condições de agitação (600, 800 e 1000 rpm) e aeração (0,5 e 1,0 vvm). Dois métodos para determinação do kLa foram empregados, o método do sulfito e o método dinâmico considerando o atraso da resposta do eletrodo. Este último que gerou resultados entre 2 e 6 vezes inferiores, dependendo do tipo do biorreator, pois avalia o kLa em meios coalescentes, similares à maioria dos caldos de fermentação. Por fim, para validar a utilização do sistema como biorreator, foram realizados cultivos com Streptomyces clavuligerus visando à produção de ácido clavulânico, um potente inibidor de β-lactamases, enzimas produzidas por microrganismos patogênicos que clivam o anel dos antibióticos β-lactâmicos. Foram realizados quatro cultivos, dois em biorreator airlift e dois em biorreator convencional (Bioflo III) em duas diferentes condições de transferência de oxigênio (kLa) e os resultados foram comparados em termos de produção do ácido clavulânico. As concentrações máximas de ácido clavulânico obtidas nos cultivos em biorreator airlift foram superiores àquelas obtidas em biorreator tipo tanque agitado e aerado, com menores índices de consistência (K), mostrando maior cisalhamento nos biorreatores airlift nas mesmas condições de transferência de oxigênio. Em termos globais, os resultados obtidos sugerem esse biorreator como o mais adequado para este tipo de cultivo, justificado pelas adequadas transferências de calor e massa aliadas ao menor consumo de energia.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:57:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissFJG.pdf: 1791684 bytes, checksum: b9fe91e0b1ce0a26bc778dae17796046 (MD5) Previous issue date: 2005-08-19 / Financiadora de Estudos e Projetos / With the reduction of vineyards in São Roque, the wine industry of this region has been seeking for alternatives to produce common wine with low cost. In the present work, wine production from Italia grape obtained at the Góes Wine-cellar (São Roque SP) with the wild yeast and the selected yeast (Y-904 Mauriferm from COATEC) was studed. Following a 22 factorial design complemented with a star configuration 44 experiments were carried out in bench scale bioreactors with 1 L working volume, whose fermentation conditions were initial pH values of 2.8, 3.0, 3.3, 3.6 and 3.8 and temperatures of 18, 20, 24, 28 and 30oC, being 22 with and 22 without skin. These experiments permitted to study the influence of initial pH and temperature in the ethanol and glycerol formation during turbulent fermentations in the presence and absence of skin. Besides, the advantages and disadvantages of the selected yeast in comparison to the wild yeasts were also evaluated. The results showed that high ethanol production from the Italia grape variety could be achieved, reaching up to 10 °GL. It was also observed a strong influence of the skin presence during the fermentation, but the wine made in the absence of skin produced colorless white wines with more pleasant flavours than the wines made in presence of skin. Furthermore, was observed that the wild yeast showed higher yield in converting sugar to alcohol than the selected yeast, however the later made higher glycerol concentration than the former. It was also noticed that the optimization results were consistent to the experimental ones. The feasibility of implementing the fermentation in the absence of skin as well as of employing the selected yeast in real production conditions was investigated by perfoming experiments in 1000L vats of Goes Wine-cellar. The results attained were compatible with the ones from the bench scale experiments. However, smaller values for the final ethanol concentration were observed as a consequence of the lack of temperature control, which caused more losses of ethanol due to evaporation. The major contribution of the present work, tested in the lab experiments and confirmed in the fermentations carried out at the Wine-cellar, is the development of a simple method for skin removal prior fermentation, which resulted in an important improvement in the quality of white wine made from Italia grape. / Com a redução do plantio de uvas em São Roque (SP), as vinícolas da região vem buscando alternativas para a produção de vinhos comuns com baixo custo. No presente trabalho estudou-se a produção de vinho proveniente da uva Itália obtida na Vitivinícola Góes (São Roque) com leveduras selvagens (obtidas nas dornas da própria vinícola) e leveduras selecionadas secas e ativas Mauriferm® Y-904 da COATEC. Seguindo um planejamento fatorial 2² ampliado com expansão estrela foram realizados 44 ensaios em biorreatores de bancada com volume de trabalho de 1L, cujas condições de fermentação foram pH iniciais de 2,8, 3,0, 3,3, 3,6 e 3,8 e temperaturas de 18, 20, 24, 28 e 30oC, sendo 22 com e 22 sem a presença da casca. Esses ensaios permitiram investigar a influência da temperatura e do pH inicial na formação de etanol, glicerol e acidez volátil durante fermentações realizadas na presença e ausência da casca, além disso, avaliar as vantagens e desvantagens das leveduras selecionadas frente às leveduras selvagens. Os resultados mostraram ótima produção de etanol nas fermentações com uva Itália, obtendo-se aproximadamente 10°GL. Observou-se também forte influência da presença ou não da casca durante a fermentação, pois os vinhos produzidos na ausência de casca apresentavam coloração menos amarelada e um aroma mais agradável do que o produzido com a casca. Além disso, observou-se que as leveduras selvagens apresentaram maior rendimento na transformação de açúcar em álcool do que as leveduras selecionadas, entretanto as últimas produziram maior teor de glicerol do que as primeiras. Também se notou que a otimização apresentou resultados coerentes com os obtidos nos experimentos. A viabilidade de implementar a fermentação na ausência de casca e de utilizar a levedura selecionada em condições reais de produção foi investigada em ensaios realizados na Vitivinícola Góes em dornas de 1000 L. Os resultados obtidos foram compatíveis com os dos ensaios de bancada, porém foram atingidos menores valores para a concentração final de etanol em decorrência da ausência de controle de temperatura que provoca maiores perdas de etanol por evaporação. A maior contribuição do presente trabalho, testada nos ensaios de bancada e confirmada nas fermentações realizadas na Vinícola, é o desenvolvimento de um método simples de remoção da casca antes da fermentação, que resulta em melhorias significativas na qualidade do vinho branco produzido a partir da uva Itália.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:57:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissFCT.pdf: 1275381 bytes, checksum: 37915954a1c8462e3ded3fb6eff3f70b (MD5) Previous issue date: 2005-09-08 / Universidade Federal de Minas Gerais / In the present work it was studied the influence of operational conditions particularly dissolved oxygen concentration in the penicillin G acylase (PGA) production. The experiments were carried out in aerated and agitated bioreactor employing bacteria Bacillus megaterium. The production of PGA is sensitive to dissolved oxygen concentration during its cultivation. As much its lack as its excess can be reduces PGA production. As regarding dissolved oxygen concentration the experiments realized in 10% of its saturation showed the better results. The media composition was not significantly influence on enzyme production. The use of potassium acetate instead of phenyl acetic acid as well as the reduction of eighteen for seven amino acids did not have effect on the cells and enzyme concentrations obtained. It was proposed an hybrid model combining mass balance equation with artificial neural network to infer the cellular concentration during the process. The proposed model showed good results to modeling cellular concentration in both training and validate data sets. / Este trabalho teve por objetivo estudar a influência de condições operacionais, particularmente a concentração de oxigênio dissolvido, na produção da penicilina G acilase (PGA) em cultivos empregando bactéria Bacillus megaterium em biorreator tipo tanque agitado e aerado. A importância desta variável reside no fato que tanto sua falta como seu excesso pode prejudicar a produção da enzima. A análise dos dados experimentais permitiu identificar a melhor condição experimental: experimento realizado com controle de oxigênio dissolvido em 10% da saturação. Em relação à composição dos meios, esta não se mostrou significativa. A substituição do ácido fenilacético pelo acetato de potássio, bem como a redução de dezoito para sete aminoácidos não teve efeito sobre as concentrações de células e de enzima obtidas. A operação do cultivo em batelada alimentada e o controle de pH não se mostraram efetivos para melhorar a produção da enzima. Propôs-se modelo híbrido combinando equação de balanço com redes neurais artificiais para inferir a concentração celular ao longo do processo. O modelo proposto foi capaz de inferir com boa precisão a concentração celular nos ensaios de treinamento e obteve boas previsões nos ensaios de validação para alguns testes realizados.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2378.pdf: 2097970 bytes, checksum: 8d3821784c3492880401bb105fe5be96 (MD5) Previous issue date: 2009-03-12 / Financiadora de Estudos e Projetos / Internal-loop airlift reactors (ALR) are a special class of pneumatic reactors. The use of this type of reactor has been attractive for chemical and biological reactions because of their simple construction without moving parts and low energy costs when compared with stirred tank reactors. In the present work, a study related to hydrodynamic and oxygen transfer in three geometrically similar scales of internal tube airlift bioreactors (2, 5, and 10 L) was conducted. The aim was to obtain useful information for further studies related to the scale-up of such reactor configuration. The gas hold-up, circulation time, mixing time, volumetric oxygen transfer coefficient, average shear rate, and mean bubble diameter of the air bubbles were evaluated in order to achieve a better comprehension of the hydrodynamic and mass transfer in airlift bioreactors. Values of gas hold-up and oxygen transfer were obtained for the three scales of ALR utilizing eight Newtonian and five non-Newtonian fluids. The superficial gas velocity and liquid viscosity had opposite effects with same order of magnitude. General correlations based on the dimensional analysis were proposed to relate global gas hold-up (ε) and volumetric oxygen transfer coefficient (kLa) to the geometrical parameters of the system, physical properties of the Newtonian and Non-Newtonian fluids, and superficial gas velocity. The correlations presented excellent fittings to the experimental data obtained for the three scales of ALR. The influence of the reactor internal diameter on the volumetric oxygen transfer coefficient was considered positive showing that in largerscale reactors an appropriate oxygen transfer can be reached under smaller aeration conditions. New methodologies to estimate the mean bubble size (dB) and average shear rate ( m γ& ) in the three scales of ALR were proposed. The semi-theoretical method to estimate dB was based on Higbie´s penetration theory using experimental data of ε and kLa. The methodology for evaluating the m γ& in ALRs was developed for non-Newtonian systems. The volumetric oxygen transfer coefficient was chosen as the appropriate characteristic parameter. The results of dB and m γ& obtained by the proposed methods are in agreement with the experimental values found in the literature. The effect of shear rate on clavulanic acid (CA) production by Streptomyces clavuligerus was examined both in a stirred tank bioreactor (STR) of 4 L and in an ALR of 6 L working volume, respectively, based on experimental data of the literature. Results showed that CA production was positively affected by shear conditions. In addition, the ALR presented values of m γ& higher than those found in a STR operated under the same oxygen transfer conditions. / Os biorreatores pneumáticos têm mostrado um grande potencial para os processos biotecnológicos, pois não utilizam partes móveis em sua construção e operação e há um menor consumo de energia quando comparado com os biorreatores convencionais tipo tanque agitado. No presente trabalho foi realizado um estudo hidrodinâmico e de transferência de oxigênio em três escalas biorreatores airlift de tubos concêntricos geometricamente semelhantes (2, 5 e 10 L) com objetivo de obter informações úteis para aplicação na variação de escala deste modelo de biorreator. Foram avaliados parâmetros importantes como retenção gasosa, tempo de mistura, tempo de circulação, coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio, velocidade de cisalhamento e diâmetro médio de bolhas para o melhor entendimento de aspectos relacionados à hidrodinâmica e à transferência de massa. A retenção gasosa e a transferência de oxigênio foram estimadas nos três biorreatores airlift utilizando oito tipos de fluidos Newtonianos e cinco fluidos não-Newtonianos. A velocidade superficial de gás e a viscosidade do líquido tiveram efeitos contrários e com mesma ordem de magnitude no coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio. Foram obtidas correlações baseadas em análise dimensional para expressar a retenção gasosa (ε) e o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) em função dos parâmetros geométricos dos sistemas, propriedades físicas dos fluidos e da velocidade superficial de alimentação de ar. Tais correlações apresentaram excelentes ajustes aos dados experimentais obtidos nas três escalas de biorreatores. A influência do diâmetro interno do reator no kLa foi considerada positiva, mostrando que em escalas de reatores maiores, a transferência de oxigênio pode ser alcançada sob menores condições de aeração. Metodologias para estimativas do diâmetro médio das bolhas (dB) e da velocidade média de cisalhamento ( m γ& ) em biorreatores airlift de tubos concêntricos foram propostas. A metodologia para estimativa de dB foi desenvolvida com base na teoria de penetração de Higbie utilizando resultados experimentais de ε e de kLa. A metodologia de estimativa m γ& , desenvolvida para fluidos não- Newtonianos, utilizou o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) como parâmetro característico. Resultados estimados de dB e de m γ& apresentaram boa concordância com resultados experimentais de literatura. Foi também avaliada e comparada a influência das condições cisalhamento previstas pela metodologia proposta na produção de ácido clavulânico (AC) por Streptomyces clavuligerus em cultivos realizados em biorreatores airlift de 6 L e convencional tipo tanque agitado e aerado de 4 L. Os resultados mostraram que a produção de AC foi afetada positivamente pelo cisalhamento, bem como a velocidade média de cisalhamento ( m γ& ) foi superior em biorreator airlift em relação ao convencional sob mesmas condições de transferência de oxigênio.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DoutRGS.pdf: 2966707 bytes, checksum: 76003e0d6d999794b955bb26e523ff71 (MD5) Previous issue date: 2003-07-27 / Universidade Federal de Minas Gerais / The enzyme penicillin G acylase (E.C.3.5.1.11) is used in the production of 6-aminopenicillanic acid (6-APA) and 7-aminocephalosporinic acid (7-ACA), which are key intermediates for the production of β-lactam antibiotics. Its industrial importance was one of the motivations for this thesis. On-line measurement and monitoring of cultivations of Bacillus megaterium ATCC 14945 in a agitated and aerated bioreactor allowed the acquisition of variables such as mol fraction of CO2 and O2 in the exhaust gases, pH, dissolved oxygen. Batch and fed-batch runs, using either enzymatically hydrolyzed casein or a pool of free amino acids provided information concerning the extend of the cultivation, preservation of the microorganism and addition/exclusion of nutrients. Usual carbon sources as glucose, fructose and glycerol increased the cellular mass, but did not improve the productivity of PGA. The use of amino acids resulted in a 2.5-fold increase of productivity. Adding phenyl acetic acid at the beginning of the experiments did not inhibit cell growth. Three non-structured models of microbial growth were put forth, assuming one, two and three limiting substrates. However, these models were too simple for our purposes. Another approach was then followed, using neural networks (NN) as softsensors. Before implementing the inference algorithm, the blank noise of the instrumentation had to be reduced. A non-conventional filter was developed, combining a recursive NN, a moving average and a second recursive NN. The smoothed variables were the input for a second NN, for pattern recognition, which classified the run in one of the main growth phases: lag, exponential and stationary. The main purpose of this NN was to identify the exponential phase, which would be the domain of the next NN, a multilayer perceptron (MLP) for inference of the cellular mass. Several NN, with different topologies, were tested for this purpose. Finally, the product concentration (PGA activity in the medium) was estimated through a hybrid approach, using the growth rate inferred by the MLP NN, coupled to the cell-product yield, obtained from the fitting of the non-structured models. Another important information for this last algorithm was the knowledge that production of PGA was growth-associated, but with a 2hr-delay. The algorithm for inference was robust and accurate. / A grande importância da enzima penicilina G acilase (E.C.3.5.1.11), usada para a produção dos ácidos 6-aminopenicilânico (6-APA) e 7-aminocefalosporânico (7-ACA), compostos-chave na produção industrial de antibióticos β-lactâmicos, foi a principal motivação deste trabalho. Através de realização de experimentos de produção de PGA por Bacillus megaterium ATCC 14945 em reator convencional, utilizando sistema de aquisição de dados, foi possível monitorar em tempo real variáveis como, por exemplo, fração molar de oxigênio e dióxido de carbono nos gases de saída, pH, oxigênio dissolvido. Foram realizados cultivos em batelada e batelada alimentada tendo como substratos limitantes tanto caseína hidrolisada enzimaticamente como aminoácidos livres. Obtiveram-se informações relacionadas ao tempo de cultivo, à estocagem do microrganismo e à adição e exclusão de nutrientes. Fontes usuais de carbono, como glicose, lactose e glicerol, quando utilizadas, promoviam o crescimento da massa celular sem, no entanto, aumentar a produção de PGA. O uso de aminoácidos como principal substrato elevou em 2,5 vezes a produtividade. Observou-se, ainda, que a adição de ácido fenilacético (AFA) desde o início do cultivo não inibiu o crescimento do microrganismo. As informações experimentais permitiram a proposição e validação de três modelos cinéticos não-estruturados deste processo, com um ou mais substrato(s) limitante(s). Como essas propostas se mostraram demasiadamente simplificadas, optouse pelo uso de redes neurais como sensores baseados em software , já que não se chegou a um modelo fenomenológico satisfatório. Para implementação do algoritmo de inferência baseado em rede neural, mostrou-se necessário filtrar os ruídos das medidas provenientes do sistema de aquisição de forma a minimizar erros aleatórios da instrumentação. Propõe-se para isso filtro que utiliza redes recorrentes, combinadas a média móvel. As variáveis filtradas foram utilizadas numa segunda rede de identificação de padrões, que dividia o cultivo nas três principais fases do crescimento microbiano. O principal objetivo desta foi identificar a fase de crescimento exponencial, que seria a enfocada pelo algoritmo de inferência. Para essa inferência, com base nas variáveis medidas em tempo real, treinaram-se redes com várias topologias e entradas, de modo a escolher as variáveis que possibilitassem o aprendizado dos aspectos essenciais da dinâmica do processo. Por fim, a concentração de produto (atividade de PGA no meio de cultura) foi estimada através de enfoque híbrido, usando a velocidade de crescimento inferida por rede feedforward , acoplada ao fator de rendimento célula-produto estimado no ajuste dos modelos não-estruturados. Outra informação importante utilizada neste último algoritmo foi o fato da produção ser associada ao crescimento, mas com atraso de 2h. Novamente, os resultados quantitativos do algoritmo de inferência do produto foram muito satisfatórios.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DoutAAF.pdf: 3275307 bytes, checksum: f45ed0ce056382979fefde457b9cfe5f (MD5) Previous issue date: 2003-10-10 / The scope of the current work was to investigate the effect of glucose, amonium acetate, DL-methionine, phosphorus, oleic acid and salt solution on the maximum specific growth rate (µmax), as well as the effect of sucrose and DL-methionine on the specific cefalosporin C production rate (µp), by Cephalosporium acremonium ATCC 48272, using factorial design and response surface techniques. The initial medium of fermentation was used according to factorial design and the experiments were carried out in shaker flasks at controlled temperature at 28 °C, initial pH of 7,0+0,1 and agitation speed 250 rpm. For both specific rate the variables involved were correlated by a fitted second order model. The canonic and surface response analysis showed a maximum specific growth rate of 0.22 h-1 obtained when glucose and amonium acetate concentration, were 4.2 , 2.5 g/L, respectively, and specific cefalosporin C production rate of 1.12 mgCPC/gcel.h when sucrose and DL-methionine concentration, were 10.5, 2.5 g/L, respectively, for a celular concentration of 14.0 g/L. The experimental design showed to be very efficcient in evaluating the bioprocess, as long as high values of µmax e µp were obtained in comparison with literature data. The feedforward neural network (FNN) was employed for modelling and simulation the effect of glucose, amonium acetate, DL-methionine, phosphorus, oleic acid and salt solution on the maximum specific growth rate. The network topologies were used with 6 neurons in the input layer, 22 hidden layer and 1 output layer. The data base for training the FNN was obtained from results of the factorial designs processed with a backpropagation learning algorithm. The surfaces response obtained by simulations for all range of glucose and amonium acetate concentrations showed inhibitory effect for the two substrates on the maximum specific growth rate. The results of the simulation are in good agreement with the experimental and statistical model results. / Neste trabalho verificou-se o efeito das variáveis concentração de glicose, acetato de amônio, DL-metionina, fósforo, ácido oléico e solução de sais na velocidade específica máxima de crescimento (µmax), assim como sacarose e DL-metionina na velocidade específica de produção do antibiótico cefalosporina C (µp), pelo fungo Cephalosporium acremonium ATCC 48272, usando como ferramenta estatística a técnica de planejamento experimental e a análise por superfície de resposta. Na otimização destas variáveis, os ensaios foram conduzidos de acordo com os planejamentos fatoriais, fracionário, completo e composto central, em fermentações em incubador rotatório, variando as concentrações iniciais dos nutrientes do meio, a 28 oC, pH 7,0+0,1, com agitação de 250 rpm. Para ambos os casos, um modelo ajustado de 2a ordem foi o que melhor correlacionou as variáveis. Os resultados da otimização mostraram que uma velocidade máxima de crescimento de 0,22 h-1 pode ser atingida para uma concentração de glicose e acetato de amônio em torno de 4,20 e 2,5 g/L, respectivamente, e uma velocidade específica de produção de cefalosporina C de 1,12 mgCPC/gcel.h para uma concentração de sacarose de 10,5 g/L e DL-metionina 2,5 g/L com uma massa celular média, para produção, de 14,0 g/L. O planejamento estatístico mostrou-se uma ferramenta bastante eficiente para avaliação do bioprocesso, pois com a realização dos ensaios propostos, foi possível obter valores de µmax e µp superiores aos encontrados na literatura. Desenvolveu-se um modelo baseado na técnica de redes neurais para a simulação de todo o domínio das concentrações de glicose, acetato de amônio, DL-metionina, fósforo, ácido oléico e solução de sais na velocidade específica máxima de crescimento. A rede que melhor representou os valores experimentais foi uma do tipo "feedforward", com três camadas e 22 neurônios na camada oculta, treinada com o algoritmo de retropropagação, por um conjunto de resultados obtidos através de ensaios do planejamento estatístico. As superfícies obtidas pela simulação em amplo domínio de concentrações de glicose e acetato de amônio, mostraram que o crescimento do microrganismo segue um modelo cinético de inibição por este dois nutrientes, prevendo altos valores de µmax para concentrações de glicose e acetato de amônio, comparáveis com os obtidos pelo modelo estatístico.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DoutMFV.pdf: 2941614 bytes, checksum: c89443c6ac79393c7b5d25f9d4a761db (MD5) Previous issue date: 2003-11-07 / Financiadora de Estudos e Projetos / The separation/concentration process of the products obtained from the enzymatic synthesis of ampicillin (AMP) catalyzed by immobilized penicillin G acylase was the focus of this Thesis. Hydrophobic resin adsorption and isoelectric precipitation were the processes herein evaluated. The antibiotic was produced in the solid phase, from 6-aminopenicillanic acid (6-APA) and phenylglycine methyl ester (PGME), and phenylglice (PG) was an undesired product. The immobilized enzyme was retained in the reactor by a sieve and the precipitated products formed (AMP and PG) were withdrawn and further dissolved at alkaline pH. After a filtration step, PG crystals were retrieved. In a second step, AMP crystals could be obtained by isoelectric precipitation. A combined process for separation/concentration of AMP, using isoelectric precipitation and hydrophobic adsorption, was put forth. The isolectric points of the molecules involved in the enzymatic synthesis were determined. In addition, the pH influence (range 5.5-7.5) on the solubility of the compounds was assessed. The results, in accordance with the literature, have shown that a pH increase leaded to an increase of the solubility of AMP and 6-APA. On the other hand, PGME solubility decreased with pH, while PG solubility was practically constant in this pH range. The adsorption efficiency and selectivity of three hydrophobic commercial resins XAD-4, XAD-7 and XAD-761 (Rohm and Haas) were evaluated at different pHs for the separation of dissolved products and unconverted reactants. Batch experiments were carried out to determine which resin had higher AMP adsorption capacity and higher selectivity (AMP/PG), at different pHs. XAD-4 was chosen: it presented higher selectivity (maximum AMP/PG = 7,0 at pH 8.5) and adsorption capacity (maximum 455 mg of AMP/g of resin, at pH 6.5). Equilibrium adsorption models were fitted: linear and Langmuir models represented PG and AMP adsorption on XAD-4 resin at pH 6.5, respectively. In a parallel work, our research group has decided to integrate synthesis and separation (precipitation of the products) in the enzymatic reactor: AMP and PG were in solid phase, and the immobilized enzyme was separated by sieving. Consequently, a combined process using isolectric precipitation and hydrophobic adsorption to separate/concentrate the AMP coming from enzymatic synthesis, with PG as impurity, was proposed. Based on the physical-chemical properties of the components, the separation process started by the elevation of pH, aiming at dissolving all AMP crystals, together with a minimum of PG crystals. Better results were obtained using pH 8.5. After filtration, un-dissolved PG was obtained. In a second step, the pH it was brought to the AMP isolectric point, causing its precipitation. Two acids and two temperatures were evaluated in this step: chloridric and sulfuric acid, 4 and 250C. Better results were obtained at 40C. No significant difference observed between the two acids. AMP crystals had purity above 97% at 40C. The following step was the separation/concentration of the mother solution, composed by a mixture of AMP and PG, using in a fixed bed of XAD-4 resin. Previously, adsorption constants, effective diffusion coefficients, and axial dispersion coefficients for AMP (at low concentrations, where a linear adsorption model fits the data) and PG were estimated by analysis of moments. The influence of temperature, flow rate, resin average particle diameter and the presence of ethanol on the performance of the system was assessed. The results obtained have shown that lower resin average particle diameters, as expected, leaded to a significant improve in the resolution of the elution curve of PG, and higher temperatures decreased retention times. The fixed bed was capable to separate, in an efficient way, a mixture of AMP and PG, reaching a separation resolution of 1.60 using a flow rate of 0.5 mL/min. Increasing ethanol concentration in the mobile phase influenced significantly the elution curves for both components. AMP de-sorption was facilitated and consequently, 5-fold and 2-fold reduction of the bed volume was achieved for AMP and PG, respectively. These results allowed the proposal of the following protocol for AMP purification, when it is reach in the solid form, containing PG as impurity: solubilization at pH 8,5 of the crystal mixture (AMP and PG), obtained from the antibiotic synthesis. Filtration of the solution, obtaining PG crystals. Reduction of the pH of the solution (containing PG, together with high concentrations of AMP), to precipitate the antibiotic at its isoelectric point. Concentration of the mother solution through adsorption on XAD-4 resin, using a water as mobile phase for adsorption and 15% (v/v) of ethanol for AMP elution. The concentrated solution should be recycled to the synthesis reactor. / Estudou-se neste trabalho o processo de Separação/concentração dos produtos da síntese de ampicilina, catalisada pela enzima penicilina G acilase imobilizada, através das técnicas de adsorção em resina hidrofóbica e precipitação no ponto isoelétrico. O antibiótico era produzido pela reação entre ácido 6-amino penicilânico (6-APA) e éster metílicode fenilglicina (EMFG), gerando também fenilglicina (FG) como sub-produto. Visando conhecimento das propriedades físico-químicas dos componentes da reação, a pesquisa se iniciou pela determinação dos pontos isoelétricos dos compostos que envolvem a reação de síntese, assim como determinação da influência do pH (na faixa de 5,5 a 7,5) na solubilidade dos mesmos. Os resultados obtidos, que estão em acordo com os disponíveis na literatura, mostraram que o aumento do pH conduz a um aumento na solubilidade da ampicilina e de 6-APA. No sentido oposto, o éster metílico de fenilglicina apresenta queda na Solubilidade com o aumento do pH, enquanto a fenilglicina mantém seu limite de solubilidade, praticamente, constante. Foram avaliadas a seguir as eficiências de adsorção e seletividades das resinas XAD-4, XAD-7 e XAD-761, a diferentes valores de pH, visando separação entre reagentes não convertidos e produtos em solução. Os resultados obtidos através de ensaios em batelada mostraram que a resina XAD-4 apresentava os melhores valores de seletividade e capacidade de adsorção. Essa resina atingiu uma razão de ampi/FG= 7,0, ou seja, a resina adsorve 7 vezes mais ampicilina do que fenilglicina a pH 8,5. e apresentou capacidade de adsorção máxima de, aproximadamente, 455 mg de ampicilina/g de resina, a pH 6,5. Diferentes modelos de equilíbrio de adsorção foram ajustados aos dados experimentais: os modelos Linear e Langmuir representaram a adsorção de FG e ampicilina sobre a resinas XAD-4 a pH 6,5, respectivamente. Em trabalho paralelo, o grupo definiu-se por processo de produção de ampicilina através de síntese integrada à Separação. Nesse processo, ampicilina e fenilglicina são obtidas na forma cristalina, separando-se o biocatalisador por peneiramento. Passou-se a avaliar assim a utilização de um processo Combinado de precipitação no ponto isoelétrico e adsorção hidrofóbica para separação e/ou concentração de ampicilina obtida por síntese enzimática, tendo como impureza fenilglicina. Baseando-se nas propriedades físico-químicas dos compostos, se iniciou o processo de separação pela elevação do pH, visando dissolução de todos os cristais de ampicilina e a menor possível de fenilglicina. Foram avaliados os valores de pH 8,5 e 9,5, sendo o pH 8,5 o escolhido como mais adequado. Através de filtração, fenilglicina pura não dissolvida podia ser obtida. Num segundo estágio, diminuía-se o pH até o ponto isoelétrico da ampicilina visando sua precipitação. Dois ácidos e duas temperaturas foram avaliados nessa etapa, clorídrico e sulfúrico, a 4 e 250C. Os melhores resultados foram obtidos a 40C, não se observando diferenças significativas para os dois ácidos, os quais permitiram atingir graus de pureza acima de 97% para ampicilina, a 40C. Estudou-se a seguir a separação e/ou concentração da solução mãe, composta de uma mistura de ampicilina e fenilglicina, através de adsorção em leito fixo, contendo a resina XAD-4 que foi previamente selecionada. Inicialmente, foram determinados os coeficientes de transferência de massa e dispersão axial para ampicilina (a baixas concentrações nas quais o modelo linear era ajustado) e fenilglicina, por análise de momento. Foram estudadas também as influências da temperatura, diâmetro médio das partículas da resina, conteúdo de etanol e vazão da fase móvel na performance do sistema. Os resultados obtidos mostraram que a diminuição no diâmetro das partículas, conforme previsto, conduzia a uma melhora significativa na resolução da curva de eluição da fenilglicina e que o aumento na temperatura (na faixa de 5 a 45oC) levou a uma diminuição dos tempos de retenção. Os resultados obtidos demonstraram ainda que a coluna foi capaz de separar de forma eficiente uma mistura de ampicilina e fenilglicina alcançando uma resolução de 1,60 para uma vazão de 0,5 mL/min. O aumento do conteúdo de etanol na fase móvel influencia de forma significativa as curvas de eluição dos compostos, facilitando a dessorção de ampicilina; obtendo-se reduções no número de volumes de leito para eluição de 5 e 2 vezes para ampicilina e fenilglicina, respectivamente. Os estudos realizados permitiram assim a proposição do seguinte protocolo para purificação de ampicilina gerada na forma sólida contendo fenilglicina como impureza: Solubilização da mistura de cristais (ampicilina e fenilglicina), obtidos durante a síntese, a pH 8,5; filtração da solução obtendo-se cristais de fenilglicina com alto grau de pureza. Redução do pH da solução (ampicilina em alta concentração e fenilglicina) para precipitação do antibiótico no seu ponto isoelétrico. Concentração da solução mãe por adsorção na resina XAD-4 e eluição com etanol 15% (v/v) de etanol, com retorno da solução concentrada ao reator de síntese.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5228.pdf: 2240292 bytes, checksum: 0afa7318b447dd1c9b5cbc1d58e3434b (MD5) Previous issue date: 2013-04-29 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cephalosporins are β-lactam antibiotics which are widely used in the treatment of bacterial infections. Within this group, cephamycin C (CefC) stands out from the others cephalosporins antibiotics due to its greater resistance to β-lactamases enzymes and its broader spectrum of action against Gram-negative pathogens. It is produced by the bacteria Nocardia lactamdurans and Streptomyces clavuligerus, usually in submerged fermentation. In the literature, the available information about the purification processes of this antibiotic are restricted to patents or papers published in the past decades. As cefC is the raw material for the production of important semi-synthetic antibiotics and due to the lack of scientifically substantiated information about its separation and purification processes, the motivation for the development of this thesis has arisen. Then, the aim of this thesis was to study the purification process of CefC produced by S. clavuligerus, by using the processes of adsorption and ion exchange in fixed bed columns. The techniques of adsorption and ion exchange present themselves as good strategies for CefC purification due to the amphoteric nature of the antibiotic molecule, which has positive or negative charges depending on the environmental pH, and the bicyclic nucleus in its structure, which allows the interaction with hydrophobic structures. As there is no chemical standard of cefC available on the market, in this study we have only used culture broth containing this antibiotic. The adsorbents evaluated were the neutral resins Amberlite XAD4 and Amberlite XAD16 and the anionic resin Q Sepharose XL. At first, ion exchange column experiments using the resin QXL were carried out. The results showed that the variation of the flow rate in the range of 2.5 mL/min to 7.5 mL/min did not affect the efficiencies of product recovery nor of bed utilization, and it did not interfere with the bioactive compounds elution. The isocratic elution modes using 0.1% or 1% NaCl (w / v) were able to separate cefC from other (s) compound (s) with antimicrobial activity present in the broth, which were not identified. But the use of 1% NaCl solution promoted the antibiotic recovery in a shorter process time and smaller volume than using 0.1 % NaCl solution. After analysis by mass spectrometry, carried out by ESI ionization in the positive mode, it was observed that the ion exchange process with QXL resin followed by adsorption on a C18 SPE cartridge were able to separate cefC from compound (s) whose molecules after ionization acquired m/z ratios corresponding to the lysine s molecule, and they also reduced the concentration of contaminants with m/z ratios corresponding to the molecules of penicillin N, deacetylcephalosporin C and deacetoxycephalosporin C. As the ion exchange studies were done, the adsorption studies using the neutral resins were initiated. At first, adsorption isotherms of cefC on XAD4 and XAD16 resins were obtained, and the effects of pH and temperature in the adsorption equilibrium were evaluated. The results showed that the broth pH had strong influence on the adsorption and the best condition was observed at pH 2.6 at 15° C. The kinetic experiments have shown that equilibrium is reached more quickly on the resin XAD16. Estimation of intrinsic kinetic parameters and mass transfer coefficients returned higher values for this resin. The column adsorption processes with XAD4 resin, when the column feed consisted of the ultrafiltered or clarified broth and the elution solutions were 1% or 5% (v/v) EtOH solutions, did not lead to separation of cefC from contaminants that were monitored in the experiments. But when the feed consisted of a preAbstract iv purified fraction, obtained in the ion exchange column with QXL resin, added with cephalosporin C, it was possible to separate the two antibiotics. Cephalosporin C was added to simulate the presence of some contaminants in the culture broth - deacetylcephalosporin C and deacetoxycephalosporin C. As these contaminants are in very low concentrations and there are not commercial chemical standards available to purchase, neither an analytical methodology to quantify them, it was decided to add cephalosporin C, whose chemical structure is very similar to the contaminants, the commercial standard is commercially available and there is a quantification method to determinate it. The column experiments with resin XAD16 showed similar results to the experiments with resin XAD4, in which it was also observed the separation of cefC from cephalosporin C. The moment analysis of the chromatographic peaks showed that cefC average retention times and peak dispersions were smaller in the column assays with XAD16 than with XAD4. Thus, a more concentrated fraction containing cefC was obtained in the column experiments with XAD16 resin. Therefore, it was demonstrated by the purification processes studied that the techniques of adsorption and ion exchange were effective in the purification of cefC in relation to contaminants that are difficult to separate / As cefalosporinas são antibióticos β-lactâmicos muito utilizados no tratamento de infecções bacterianas. Dentro do grupo, a cefamicina C (cefC) se destaca devido a sua maior resistência à ação das β-lactamases bacterianas e ao seu maior espectro de ação contra patógenos Gramnegativos. Ela é produzida pelas bactérias Nocardia lactamdurans e Streptomyces clavuligerus, geralmente em cultivos submersos. Na literatura, as informações existentes sobre os processos de purificação deste antibiótico estão disponíveis apenas em patentes ou em artigos publicados em décadas passadas. Sendo um composto que é matéria-prima para produção de antibióticos semissintéticos de grande importância clínica e comercial, e devido à falta de informações fundamentadas cientificamente sobre os processos de separação e purificação deste antibiótico, surgiu a motivação para o desenvolvimento desta tese. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a purificação da cefC produzida por S. clavuligerus, utilizando o processo de adsorção e troca iônica em colunas de leito fixo. As técnicas de adsorção e troca iônica apresentam-se como uma boa estratégia para purificação da cefC devido à natureza anfótera da molécula do antibiótico, que possui cargas positivas ou negativas dependendo do pH do meio, e ao núcleo bicíclico em sua estrutura, que permite a interação com estruturas hidrofóbicas. Como não há o padrão da cefC disponível no mercado, neste estudo trabalhou-se apenas com o caldo de cultivo. Os adsorventes avaliados foram as resinas neutras Amberlite XAD4 e Amberlite XAD16 e a resina de troca iônica Q Sepharose XL. Inicialmente, foram realizados experimentos em coluna de troca iônica com a resina QXL. Os resultados destes ensaios mostraram que a variação da vazão no intervalo de 2,5 mL/min a 7,5 mL/min não alterou as eficiências de recuperação do produto e de utilização do leito, nem interferiram na eluição dos compostos bioativos. A eluição no modo isocrático com solução de NaCl 1% (m/v) possibilitou a separação da cefC de outro(s) composto(s) com atividade antimicrobiana presentes no caldo, mas não identificados, e promoveu uma recuperação do antibiótico em um tempo menor de processo e em um volume menor de solução que a eluição com NaCl 0,1%. Após análise por espectrometria de massas, com ionização feita por ESI no modo positivo, observou-se que o processo de troca iônica seguido da adsorção em cartucho de SPE C18 foi capaz de separar a cefC de composto(s) com a razão m/z correspondente à lisina, e diminuir a concentração de contaminantes presentes no caldo cujas moléculas apresentaram, após ionização, razão m/z correspondentes à das moléculas de penicilina N, desacetilcefalosporina C e desacetoxicefalosporina C. Finalizados os experimentos de troca iônica, iniciaram-se os estudos de adsorção utilizando as resinas neutras. Os primeiros experimentos consistiram na determinação de isotermas de adsorção da cefC nas resinas XAD4 e XAD16, avaliando a influência do pH e da temperatura no equilíbrio de adsorção. Os resultados mostraram que o pH do caldo teve drástica influência na adsorção, sendo que a melhor condição observada foi no valor de pH 2,6 à 15°C. Os ensaios cinéticos mostraram que o equilíbrio é atingido mais rapidamente na resina XAD16. A estimativa dos parâmetros cinéticos intrínsecos e de transferência de massa retornaram valores maiores para esta resina. O processo de adsorção em coluna com a resina XAD4, quando a alimentação da coluna consistiu do caldo ultrafiltrado ou clarificado e a eluição foi feita com as soluções de EtOH 1% ou 5% (v/v), não levou à separação da cefC dos contaminantes que Resumo ii foram monitorados nos ensaios. Mas quando a alimentação foi feita com uma fração prépurificada, oriunda da troca iônica, adicionada de cefalosporina C, foi possível obter a separação dos dois antibióticos. A cefalosporina C foi adicionada para simular a presença de alguns contaminantes presentes no caldo de cultivo a desacetilcefalosporina C e desacetoxicefalosporina C. Como estes contaminantes estão em concentrações muito baixas e não existem os padrões comerciais disponíveis para serem adquiridos, nem metodologia analítica para quantificá-los, optou-se por adicionar cefalosporina C, cuja estrutura química é bem similar à dos contaminantes, existe o padrão comercial para ser adquirido e possui um método de quantificação. Os experimentos em coluna com a resina XAD16 mostraram resultados similares aos experimentos com a resina XAD4, nos quais também foi observada a separação entre a cefC e a cefalosporina C. Após análise dos momentos dos picos cromatográficos, verificou-se que a cefC apresentou tempos de retenção médios menores na resina XAD16 e a dispersão dos picos foi menor. Desta forma, foi obtida uma fração mais concentrada em cefC nos ensaios em coluna com esta resina do que com a resina XAD4. Portanto, pôde-se constatar pelo processo de purificação estudado que as técnicas de adsorção e troca iônica mostraram-se eficientes na purificação da cefC em relação a contaminantes difíceis de serem separados.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5315.pdf: 2167736 bytes, checksum: 42c21ae0612a2550b93786bcc8cd967b (MD5) Previous issue date: 2013-04-26 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cephamycin C is a β-lactam antibiotic that belongs to the cephalosporins. This antibiotic stands out from other cephalosporins because it has activity against gram-negative bacteria and for being resistent to β-lactamases produced by pathogenic microorganisms, and which represent one of the major mechanisms of bacterial resistance to β-lactam antibiotics. In view of the restricted information in the literature about the steps of the process, both from the point of view of research and of industrial production of cephamycin C, the study about its production and, consequently, the process of separation and purification becomes of great importance. Therefore, the main objective of this work was to develop a separation and purification process of cephamycin C from a fermentation broth produced by cultivations of Streptomyces clavuligerus in aired submerged processes. Extraction and separation processes of cephamycin C were performed by means of an aqueous two-phase system (ATPS) and ionexchange chromatography, respectively. Initially, studies on the stability of cephamycin C were performed in order to allow the establishment of conditions which minimize losses and increase the yield of the global process. In these studies, conditions at pH levels of 2.2, 3.0, 5.0, 6.0, 7.0, 7.6 and 8.7 at a temperature of 20 °C were evaluated. The smallest half-life was of 52.6 hours and was verified for pH 8.7; the longest half-life was of 459 hours for pH 6.0; and for the most acid pH (2.2), half-life was of 118.2 hours. The second step of the work was the study of the separation of cephamycin C and amino acids with the aqueous two-phase system composed by PEG/phosphate. The presence of ornithine, lysine and asparagine amino acids in the fermentation broth, even after the primary separation steps performed by filtration processes consisting of microfiltration and ultrafiltration, is due to the composition of the culture medium which is of complex origin. The experiments were carried out by varying the following parameters: molecular mass of PEG (400, 600, 1000 and 4000), pH (6, 7 and 8), tieline length (TLL 37 and 43) and phase volume ratio (rTLL 0.75, 1.00 and 1.25), in order to enable the determination of the best system for cephamycin C extraction. The best conditions obtained for this process were pH 8, PEG 400, TLL 43 and rTLL 1.00, where the highest partition coefficient, kp of 5.57, was acquired. For the separations of cephamycin C and the amino acids present in the broth, it was possible to verify the following separation efficiencies: 3.4 (ornithine), 6.9 (lysine) and 2.8 (asparagine). The last step of the work showed that it is possible to recover cephamycin C from the PEG phase promoting an even greater purification with the residual amino acids. The ion-exchange chromatography was used to propose so. For this proposal, we used the ion exchange chromatographic technique, with use of anionic resin Amberlite IRA 400. These experiments were performed under temperatures of 20, 25 and 30 °C and pH 2.8 and 6.8. The Amberlite IRA 400 Cl- resin showed affinity for cephamycin C, and in the experiments in fixed bed column, it was possible to separate cephamycin C from PEG, from the phosphate salt and from the amino acids present in the top phase. The results allowed the conclusion that the proposed process is an excellent alternative for the extraction, separation and purification of cephamycin C. / A cefamicina C (cef C) é um antibiótico β-lactâmico que pertence à classe das cefalosporinas. Este antibiótico se destaca das demais cefalosporinas por possuir atividade frente a bactérias gram-negativas e ser resistente à ação das β-lactamases, produzidas por micro-organismos patogênicos, e que representam um dos principais mecanismos de resistência bacteriana aos antibióticos β-lactâmicos. Tendo em vista as restritas informações na literatura sobre as etapas do processo, tanto sob o ponto de vista de pesquisa e industrial de produção da cefamicina C, torna-se de grande importância o estudo de sua produção e consequentemente do processo de separação e purificação. Portanto, o objetivo principal deste trabalho foi desenvolver um processo de separação e purificação da cefamicina C, a partir de um caldo fermentado produzido por cultivos da bactéria Streptomyces clavuligerus, em processos submersos aerados. Os processos de extração e separação da cefamicina C foram realizados por meio de sistema de duas fases aquosas (SDFA) e cromatografia de troca iônica em coluna de leito fixo, respectivamente. Inicialmente, foram realizados estudos de estabilidade da cefamicina C, tendo em vista permitir o estabelecimento de condições que minimizem as perdas e aumentem o rendimento do processo global. Nestes estudos foram avaliadas as condições em pH de 2,2, 3,3, 5,0, 6,0; 7,0; 7,6 e 8,7 a uma temperatura de 20 °C. A meia-vida para o pH 8,7 foi de 52,6 horas, para o pH 6,0 a meia-vida foi de 459 horas e, para o pH mais ácido (2,2), a meia-vida foi de 118,6 horas. A segunda etapa do trabalho correspondeu ao estudo da separação entre a cefamicina C e os aminoácidos, por meio do sistema de duas fases aquosas composto por polietileno glicol (PEG) /fosfato. A presença dos aminoácidos ornitina, lisina e asparagina no caldo fermentado, mesmo após as etapas de separação primária, realizada por processos de filtração compostos por microfiltração e ultrafiltração, devem-se a composição do meio de cultura de origem complexa. Os experimentos foram realizados variando-se os seguintes parâmetros: massa molecular de PEG (400, 600, 1000 e 4000), pH (6, 7 e 8), tamanho de tieline (TLL 37 e 43) e razão de volume das fases (rTLL 0,75, 1,00 e 1,25), de modo a possibilitar a determinação do melhor sistema para a extração da cefamicina C. As melhores condições obtidas para este processo foram pH 8, PEG 400, TLL 43 e rTLL 1,00, onde se obteve o maior coeficiente de partição, kp de 5,57. Para as separações entre a cef C e os aminoácidos presentes no caldo foi possível verificar as seguintes eficiências de separação: 3,4 (ornitina), 6,9 (lisina) e 2,8 (asparagina). Na etapa final do trabalho foi possível recuperar a cef C da fase PEG, promovendo ainda uma maior purificação com os aminoácidos residuais. Para tal proposta, utilizou-se a técnica cromatográfica de troca iônica, com utilização da resina aniônica Amberlite IRA 400. Estes experimentos foram realizados sob temperaturas de 20, 25 e 30 °C e pH 2,8 e 6,8. A resina Amberlite IRA 400 mostrou afinidade em relação à cef C, e nos experimentos em coluna de leito fixo, foi possível separar a cef C do PEG, do sal de fosfato e dos aminoácidos presentes na fase de topo. Os resultados obtidos permitiram concluir, que o processo proposto mostrou-se viável para a extração e separação da cefamicina C.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLMB.pdf: 688899 bytes, checksum: 1da3502ed4adcb1c200a2f4d30584493 (MD5) Previous issue date: 2005-10-19 / Universidade Federal de Sao Carlos / A study was made of the extraction of clavulanic acid (CA) from a fermented medium and its concentration and purification, based on a comparison of two liquid-liquid extraction methods, followed by adsorption in a fixed bed column containing resins (hydrophobic polymeric resin and ion exchange resin). The extraction and adsorption steps proposed here were evaluated from the standpoint of Yield (Y), purification factor (PF) and concentration factor (CF). The extractions were carried out with the organic solvents ethyl acetate, butyl acetate, 2-butanol, n-butanol and methyl isobutyl ketone. These extractions were carried out at ambient temperature, pH values of 2.0, 3.0, 4.0 and 5.0 and with different volume ratios of aqueous phase and organic phase (VAF/VOP). After extraction with the organic solvent, the solution was reextracted with a phosphate buffer solution. Extractions were also done with two-phase aqueous systems (TPAS) composed of polyethylene glycol (PEG) and phosphate. The experimental conditions were: ambient temperature, pH of 6.0 and 7.0, and different molecular weights of PEG (400, 600, 4000). For the extractions involving organic solvents, an evaluation was made of the purification of clavulanic acid by ion exchange adsorption with Amberlite IRA-400 resin in a fixed bed column at a temperature of 10°C and pH 6.2. After adsorption by ion exchange, the column was washed with Milli-Q water and the elution was studied with different compositions of a solution composed of NaCl 5% (p/v) and Tris-HCl. The elution was carried out at pH 6.2 and a feed flow of approximately 6 mL.min-1. The solution eluted from the ion exchange was fed into a column filled with Amberlite XAD-4 resin at a temperature of 10°C and pH of 6.2. For the TPAS extractions, the application of ion exchange and nonspecific adsorption with Amberlite XAD-4 resin for the separation of CA from PEG was evaluated separately. / Propôs-se e estudou-se a extração do ácido clavulânico do meio fermentado, sua concentração e purificação, através da comparação de dois métodos de extração líquidolíquido, seguida de adsorção em coluna de leito fixo com as resinas (polimérica hidrofóbica e de troca iônica). As etapas de extração e adsorção, propostas neste trabalho, foram avaliadas em termos do Rendimento (R), o fator de purificação (FP) e o fator de concentração (FC). Para isso foram realizadas extrações com vários solventes orgânicos, sendo estes o acetato de etila, acetato de butila, 2-butanol, n-butanol e metil-isobutilcetona. Estas extrações foram feitas na temperatura ambiente, diferentes valores de pH (2,0; 3,0; 4,0 e 5,0) e em diferentes razões de volume entre as fases aquosa e orgânica (VFA/VFO). Após a extração com o solvente orgânico, a solução foi re-extraída com uma solução tampão fosfato. Também foram realizadas extrações com sistemas de duas fases aquosas (SDFA) formadas por polietileno glicol (PEG) e fosfato. As condições experimentais foram: temperatura ambiente; pH de 6,0 e 7,0; e diferentes pesos moleculares de PEG (400, 600, 4000). Para as extrações realizadas com solventes orgânicos, foi avaliada a purificação do ácido clavulânico através de adsorção por troca iônica com a resina Amberlite IRA-400 em coluna de leito fixo, na temperatura de 10ºC e pH 6,2. Após a adsorção por troca iônica a coluna foi lavada com água milli Q, sendo que a eluição foi estudada com diferentes composições da solução constando de NaCl 5% (p/v) e tris - HCl. A eluição foi realizada a pH 6,2 e vazão de alimentação em torno de 6 mL.min-1. A solução eluída da troca iônica foi alimentada em uma coluna recheada com a resina Amberlite XAD-4, na temperatura de 10°C e pH de 6,2. Para as extrações com SDFA avaliou-se separadamente a aplicação da troca iônica e da adsorção não específica com a resina Amberlite XAD-4, para a separação do AC do PEG.