Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6832.pdf: 3214384 bytes, checksum: 0ef6f81368240fad0ee476c019e48c11 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / Universidade Federal de Sao Carlos / Sugarcane bagasse (SCB) is a by-product generated after sugarcane milling in the process of manufacture of sugar and/or ethanol. In this study, pretreated SCB was used in different configurations of enzymatic hydrolysis and fermentation. The objective was obtaining the greatest amounts of fermentable sugars in the enzymatic conversion and then converted them to ethanol. SCB was hydrothermally pretreated (1:10 (w/v), solid-liquid ratio) under the conditions 170 °C/15 min, 195°C/10 min, and 195 °C/60 min at 200 rpm. The delignification step of the hydrothermal pretreated SCB was carried out with 0.02 and 0.5% NaOH solution at 1:10 (w/v). Pretreated and untreated samples of SCB were chemical and morphologically characterized. Enzymatic hydrolysis and fermentation assays were carried out in PSSF (pre-saccharification prior to simultaneous saccharification and fermentation) process. In the best condition, (10% pretreated SCB at 195 °C/10 min) it was obtained 57.4% of ethanol yield. SSF (simultaneous saccharification and fermentation) experiments were performed in Erlenmeyer flasks at 250 rpm and at 37 °C using commercial Saccharomyces cerevisiae during 72 h. In the first assay, it was evaluated the effect of initial buffered medium and non-buffered medium for hydrothermal pretreated SCBs. In the best result, it was obtained 53.8% of enzymatic conversion and an ethanol titer of 17.1 g/L (SCB pretreated at 195 °C/10 min in buffered medium). In the next assays, it was evaluated the effect of solid loading (10 and 15%) on delignified and non-delignified SCB using an enzyme loading of 20 FPU/g pretreated SCB. In these assays were obtained ethanol yields of 53.8 (17.1 g/L) and 60.0% (28.4 g/L) for 10 and 15% of SCB, respectively. These results showed that the increased in solid loading favored obtaining higher ethanol yield. Assays in SHF configuration (separate hydrolysis and fermentation) using delignified and non-delignified samples of SCB achieve ethanol concentration of 39.9 g/L and ethanol yield was 84% with 15% loading at 72 h. Other experiments were carried out in 10% SCB/15 FPU/g SCB loading, 10% SCB/30 FPU/g SCB loading, 15% SCB/15 FPU/g SCB loading and 15% SCB/30 FPU/g SCB loading employing the thermotolerant yeasts Kluyveromyces marxianus IMB3 and Saccharomyces cerevisiae D5A to ethanol production from hydrothermal pretreated SCB. The results showed enzymatic conversion was 64.3% and maximum ethanol concentration of 29.2 g/L using 15% of SCB at 72 h. D5A yeast showed ethanol yield was 76.2% and the maximum ethanol concentration of 42.6 g/L at 120 h using 15% of solid load and 30 FPU/g SCB of enzyme load. Overall, all evaluated conditions showing satisfactory results in obtaining ethanol from hydrothermal pretreated SCB. However, high concentration of substrate loading favored SHF process to operate separately enzymatic hydrolysis and fermentation. This configuration achieved high ethanol yields in the conditions assessed in this work. / O bagaço de cana-de-açúcar (BCA) é um subproduto gerado após a moagem da cana-deaçúcar no processo de produção de açúcar e/ou etanol. No presente trabalho, o BCA pré-tratado foi utilizado em diferentes configurações de hidrólise enzimática e fermentação com o objetivo de obter a maior quantidade de açúcares fermentescíveis na sacarificação e convertê-los a etanol. O BCA foi pré-tratado hidrotermicamente na proporção 1:10 (m/v) nas condições 170 °C/15 min, 195 °C/10 min e 195 °C/60 min com agitação de 200 rpm. A etapa de deslignificação do BCA prétratado hidrotermicamente foi realizada com 0,02 e 0,5% de solução de NaOH na proporção 1:10 (m/v). Amostras de BCA pré-tratada e não tratada foram caracterizadas quimicamente e morfologicamente. Os primeiros ensaios de hidrólise enzimática e fermentação foram realizados na configuração PSSF (pré-sacarificação e fermentação simultâneas). Na melhor condição (10% de BCA tratado a 195 °C/10 min) foi obtido rendimento em etanol de 57,5%. Os experimentos de SSF (sacarificação e fermentação simultâneas) foram realizados em frascos de Erlenmeyers com agitação de 250 rpm a 37 °C com levedura Saccharomyces cerevisiae comercial por 72 h. Nos primeiros ensaios avaliou-se o efeito do meio inicial tamponado e não tamponado para os BCAs pré-tratados hidrotermicamente. No melhor resultado obteve-se 53,8% de conversão enzimática e concentração de etanol de 17,1 g/L (BCA tratado a 195 °C/10 min em meio tamponado. Nos ensaios seguintes, avaliou-se o efeito da carga de sólidos (10 e 15%) para amostras de BCA deslignificada e não deslignificada utilizando carga enzimática de 20 FPU/g BCA tratado. Nesses ensaios obteve-se máximos rendimentos em etanol de 53,8 e 60,0% e concentrações de etanol 17,1 e 28,4 g/L com 10 e 15% de BCA, respectivamente. Esses resultados mostraram que o aumento na carga de sólidos favoreceu o aumento no rendimento em etanol. Nos ensaios em configuração SHF (sacarificação e fermentação separadas) utilizando amostras de BCA deslignificada e não deslignificada obteve-se concentração de etanol de 39,9 g/L e rendimento em etanol de 84,0% com 15% de sólidos em 72 h. Ensaios nas configurações 10% BCA/15 FPU/g BCA tratado, 10% BCA/30 FPU/g BCA tratado, 15% BCA/15 FPU/g BCA tratado e 15% BCA/30 FPU/g BCA tratado foram realizados empregando as leveduras Kluyveromyces marxianus IMB3 e Saccharomyces cerevisiae D5A na produção de etanol a partir do BCA pré-tratado hidrotermicamente. Os resultados mostraram conversão enzimática de 64,3% e concentração máxima de etanol de 29,2 g/L utilizando 15% de sólidos em 72 h para IMB3. Para a levedura D5A obteve-se rendimento em etanol de 76,2% e a máxima concentração de etanol de 42,6 g/L em 120 h utilizando 15% de sólidos e 30 FPU/g BCA tratado. De modo geral, todas as condições avaliadas apresentaram resultados satisfatórios na obtenção de etanol a partir do BCA pré-tratado hidrotermicamente. Entretanto, cargas de substrato maiores favoreceram a configuração SHF por operar separadamente a hidrólise enzimática e a fermentação alcançando maiores rendimento em etanol nas condições avaliadas nesse trabalho.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2531.pdf: 1826513 bytes, checksum: 1b4aeefe4e23520d603b495bbd0b8832 (MD5) Previous issue date: 2009-04-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / Using recombinant DNA techniques, the lipase BTL2 gene of Bacillus thermocatenulatus was cloned in E. coli BL321 under control of the strong temperature-inducible λPL promoter. It was investigated, initially, in this work, the influence of different variables in cell growth and expression of lipase BTL2 by recombinant E. coli, through experiments performed in agitated flasks with LB medium. First, it was studied the influence of temperature of growth (between 27 ° C and 34.2 °C) and heat shock temperature (between 37.8 °C and 46.2 °C) in the expression of lipase BTL2 by E. coli recombinant, using statistical design of experiments. The results of this study, where the shock was performed in the early exponential phase, indicated as the best Tcresc = 27 °C and Tchoque = 45 °C, yielding cellular concentration of 0.6 g dry weight / L and enzyme activity of 121.000 U/g.wet.cel. Then, it was investigated the influence of the growth phase of the microorganism at the shock, through cultures with Tcresc = 27 °C and Tchoque = 45 °C, the results of these experiments showed how heat shock condition at the end of exponential phase, resulting in activity of 258.000 U/g.wet.cel It investigated the influence of different initial concentrations of glucose in the medium on cell growth and expression of the enzyme. The best results were obtained from cell mass with 10 g/L glucose and μmax = 0,16 h-1, Yx/s = 0,19 g/g, resulting in 1.2 g / L dry cel, enzymatic activity of about 250.000 U / g.wet.cel. Lower concentrations of glucose and higher concentrations led to smaller cell, but did not affect enzyme activity in the final. Based on previous cultures of E.coli were conducted simulations to calculate the best condition for feed-batch. The experimental test was performed with 10 g/L glucose at the beginning of cultivation, Tcresc = 30 °C, Tchoque = 45 °C. In this test, we were able to achieve 15 g/L dry.cel μmax = 0,38 h-1 with enzyme activity of 231.000 U/g.wet.cel, with resulting in 100 times more enzyme in this test than in cultivation in shaker in the best condition. The results of the simulation, obtained using model of Monod, predicted quite well those obtained experimentally. There was no significant accumulation of organic acids and all aminoacids consumed by the moment of shock. From the heat shock, those who were not exhausted with concentration remained constant. The enzyme produced in the test batch was recovered by breaking the cells in a French press to obtain with this methodology 272.000 U/g wet cells, whereas the results of the samples, which were disrupted by sonication resulted in much lower value. Was then investigated the efficiency of the protocol of sonication that was being used, by subjecting the cells to successive rounds of sonication. The results showed that actually the first cycle only 50% of the enzyme was released, indicating that the maximum production achieved was actually around 462.000 U/gcél.úmida. Study characterization of enzyme kinetics showed that the temperature of maximum activity is 65 °C with activation energy equal to 142.3 kJ/mol. Study of stability in solvent showed that the enzyme retains activity in the presence of 2- propanol. / Utilizando técnicas de DNA recombinante, o gene da lípase BTL2 de Bacillus thermocatenulatus foi clonado em E. coli BL321 sob controle do promotor λPL, com o qual a indução na produção da enzima é obtida através de choque térmico. Investigou-se, inicialmente, neste trabalho, a influência de diferentes variáveis no crescimento celular e na expressão da lípase BTL2 por E.coli recombinante, através de experimentos realizados em frascos agitados, com meio LB. Primeiramente, estudou-se a influência da temperatura de crescimento (entre 27°C e 34,2°C) e da temperatura de choque térmico (entre 37,8°C e 46,2°C) na expressão de BTL2 por E.coli recombinante, usando planejamento estatístico de experimentos. Os resultados desse estudo, onde o choque era realizado no início da fase exponencial, indicaram como as melhores temperaturas Tcresc=27°C e Tchoque=45°C, obtendose concentração celular de 0,6 g massa seca/L e atividade enzimática de 121.000U/gcél.úmida. A seguir, foi investigada a influência da fase de crescimento do microrganismo no momento do choque, através de cultivos com Tcresc=27°C e Tchoque =45°C, os resultados desses experimentos indicaram como melhor condição choque térmico no final da fase exponencial, obtendo-se nessa condição atividade de BTL2 de 258.000U/gcél. Úmida. Investigou-se assim a influência de diferentes concentrações iniciais de glicose no meio de cultivo no crescimento celular e expressão da enzima. Os melhores resultados de massa celular foram obtidos com 10g/L de glicose, obtendo-se 1,2 g/L de massa seca, μmax = 0,16 h- 1, Yx/s=0,19 g/g e atividade enzimática em torno de 250.000 U/gcél, úmida. Concentrações de glicose menores e maiores conduziram a menores concentrações celulares, mas não influenciaram na atividade enzimática final. Baseando-se em cultivos anteriores de E.coli foram realizadas simulações para cálculo de alimentação de meio em ensaio em batelada alimentada. O ensaio experimental foi realizado com 10 g/L de glicose no início do cultivo, Tcresc=30°C, Tchoque=45°C. Nesse ensaio, conseguiu-se atingir 15 g/L de massa seca, com μmax =0,38 h-1 e com atividade enzimática de 231.000 U/gcel.úmida, obtendo-se 100 vezes mais enzima nesse ensaio do que no cultivo em frasco agitado na melhor condição. Os resultados da simulação, obtidos usando modelo de Monod, previram bastante bem os obtidos experimentalmente. Não se observou acúmulo significativo de ácidos orgânicos e todos os aminoácidos.eram consumidos até o momento do choque. A partir do choque térmico, aqueles que não estavam esgotados permaneceram com concentração constante. A enzima produzida no ensaio em batelada foi recuperada rompendo-se as células em uma prensa francesa, obtendo-se com essa metodologia 272.000 U/g cel úmida, enquanto que os resultados das amostras , que eram rompidas por sonicação resultaram em valor muito menor. Investigou-se então a eficiência do protocolo de sonicação que vinha sendo utilizado, submetendo-se as células a sucessivos ciclos de sonicação. Os resultados mostraram que realmente no primeiro ciclo apenas 50% da enzima era liberada, o que indica que a máxima produção obtida estava na verdade em torno de 462.000U/gcél.úmida.Estudo de caracterização cinética da enzima mostrou que a temperatura de máxima atividade é 65°C, com energia de ativação igual a 142,3 kJ/mol. Estudo de estabilidade em solvente mostrou que a enzima mantém atividade na presença de 2-propanol.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3049.pdf: 2440029 bytes, checksum: f8b9ee5d47547364d040e6797729060f (MD5) Previous issue date: 2010-03-19 / Universidade Federal de Sao Carlos / Pork is one of the most widely eaten meats in the world and pig farming is an economic activity booming in Brazil and the world. Several efforts have been made to develop more effective vaccines for major diseases that are affecting livestock such as swine erysipelas, caused by the bacterium Erysipelothrix rhusiopathiae. The currently available vaccines for the prevention of erysipelas are produced with culture broth of this microorganism inactivated or attenuated. The main antigenic agent identified is an protein fraction of 64-69 kDa, present in cell wall of bacteria and the supernatant of the culture. Given the accumulated knowledge of the studies conducted by Silva (2007), this study aimed to: i) study the conditions employed in the preparation of cell suspension for freezing and formation of culture stocks in crytubes and the stage of their activation; ii) studying the growth of E. rhusiopathiae, the formation of lactic acid and expression of antigen in culture media containing carbon sources alternative to glucose and in culture media containing nitrogen sources of plant origin; iii) to study the behavior of the microorganism in the new culture medium, animal-free, in a bioreactor. The studies for the improvement of the medium formulation were carried out in flasks incubated at static condition or under agitation of 200 rpm. The temperature was set at 37°C and the initial pH at 8,0 in all experiments. The studies in bioreactor were made using a 4.0 L stirred-tank bioreactor, with an agitation frequency kept between 100 and 700 rpm and air flow rate of 1.0 L/min. Samples of cell extracts made with choline chloride were analyzed by electrophoresis under denaturating conditions (SDS-PAGE) to evaluate the antigen expression. Studies of activation of the criotubes containing frozen cell suspensions led to the standardization of this step, with high reproducibility, and reduced activation time by 50%. The studies were grew with different carbon sources, showing that E. rhusiopathiae is able to assimilate galactose, lactose, and glucose. However, there was no assimilation of glycerol. The replacement of proteose peptone, a nitrogen source animal widely used in the cultivation of E. rhusiopathiae to produce bacterins, by Soytone, a soy peptone, animal-free, was a promising alternative for the production of the inactivated vaccine, helping to increase the specific growth rate and substrate conversion of cells in relation to values obtained in conventional medium. In batch cultivation performed in a bioreactor with medium containing glucose and Soytone, it was reached a biomass concentration of 10 g / L at 5 hours of cultivation. For the conventional medium, containing proteose peptone, the maximum cell concentration reported for the test batch in a bioreactor was approximately 2 g / L, which was reached after 7 hours of culture. Note also that a higher level of expression of antigenic protein in relation to those observed with peptone of animal origin was achieved in cultures performed with medium containing soytone.This result shows that could be incorporate the best practices of manufacturing practices for pharmaceutical and veterinary products, subject to the productivity of the process and with significant cost reduction. / A carne suína é a mais consumida no mundo e a suinocultura é uma atividade econômica em franca expansão no Brasil e no mundo. Diversos esforços vêm sendo realizados para o desenvolvimento de vacinas mais eficientes para as principais doenças que afetam os rebanhos, como a erisipela suína, causada pela bactéria Erysipelothrix rhusiopathiae. As vacinas disponíveis atualmente para a prevenção da erisipela são produzidas com o caldo de cultivo deste microrganismo inativado ou atenuado. O principal agente antigênico identificado é uma fração protéica de 64-69 kDa, presente tanto na parede celular da bactéria quanto no sobrenadante do cultivo. Diante do conhecimento acumulado ao longo dos estudos conduzidos por Silva (2007), o presente trabalho teve como objetivos: i) estudar as condições empregadas na preparação das suspensões celulares para armazenamento na forma de cultura estoque em criotubos assim como a etapa de ativação dos mesmos; ii) estudar o crescimento de E. rhusiopathiae, a formação de ácido lático e a expressão do antígeno SpaA em meios de cultivo contendo fontes de carbono alternativas à glicose e fontes de nitrogênio de origem vegetal; iii) estudar o comportamento do microrganismo no meio de cultura novo, livre de substratos de origem animal, em biorreator. Os experimentos foram conduzidos em câmara incubadora, em cultivos estáticos ou com agitação de 50 ou de 200 rpm. A temperatura utilizada foi de 37°C e o pH inicial foi de 8,0 em todos os ensaios realizados. Os estudos em biorreator foram realizados em biorreator de 5,0 L, com agitação entre 100 a 700 rpm e vazão de ar de 1,0 a 2 L/min. Amostras retiradas durante os cultivos foram empregadas para análise da densidade ótica (a 420 nm) e das concentrações de glicose, biomassa e metabólitos. A expressão do antígeno foi avaliada por eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) a partir de extratos das células preparados com solução de cloreto de colina. Os estudos envolvendo a ativação dos criotubos contendo as suspensões celulares congeladas levaram à padronização desta etapa, com alta reprodutibilidade, e à diminuição do tempo de ativação em 50 %. Os cultivos realizados com diferentes fontes de carbono, mostraram que E. rhusiopathiae é capaz de assimilar galactose e lactose, além de glicose. No entanto, não foi verificada assimilação de glicerol. A substituição da proteose peptona, fonte de nitrogênio de origem animal amplamente utilizada nos cultivos de E. rhusiopathiae para produção de bacterinas, pela peptona de soja hidrolisada Soytone, de origem vegetal, mostrou-se um alternativa promissora para a produção da vacina de células inativadas, contribuindo para aumento da velocidade específica de crescimento e da conversão de substrato em células em relação aos valores obtidos no meio convencional. Em cultivo descontínuo realizado em biorreator de bancada com o meio contendo glicose e Soytone, foi alcançada uma concentração de biomassa de 10 g/L em 5 horas de cultivo. Para o meio convencional, contendo proteose peptona, a máxima concentração celular relatada para ensaio em batelada em biorreator de bancada foi aproximadamente 2 g/L, a qual foi atingida após 7 horas de cultivo. Destaca-se ainda que um nível superior de expressão da proteína antigênica em relação aos observados com a peptona de origem animal foi alcançado nos cultivos realizados com o meio contendo soytone. Esse resultado mostra ser possível incorporar as boas práticas de manufatura recomendadas para produtos farmacêuticos e veterinários, sem prejuízo à produtividade do processo e com significativa redução do custo do meio.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3641.pdf: 2915031 bytes, checksum: 75a88eb9fcd13120c484443ffeae1a1a (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / The aim of this work was evaluated the sugarcane bagasse (SCB) pretreatment by aqueous ammonia, an alkaline method. Samples of SCB (in natura and steam exploded unwashed) were pretreated with ammonium hydroxide solution (NH4OH) at 1:5 solid-liquid ratio (by weight), in a bench scale. Preliminary assays were carried out employing NH4OH solution (28% w/w) at room temperature 24 ± 3 ⁰C by 7, 15 and 30 days. In these experiments, it was observed that the pretreatment was selective in removing lignin and hemicellulose. New experiments were carried out using at 50⁰C and NH4OH 15% during 30, 60 and 90 minutes. In these pretreatments the same behavior was observed. In the next assays, it decided to fix the reaction time in 60 minutes and the temperature in 100⁰C. Samples of in nature and steam exploded SCB were pretreated at diffent NH4OH concentrations (4 to 15%). Enzymatic hydrolysis assays were carried out in Erlenmeyers flasks (50⁰C, pH 4.8 and 250 rpm) using 30 FPU/g bagasse (Accellerase 1500, Genencor) and 5 CBU/g bagasse (BG, Genencor). Experiments were carried out employing in natura SCB (pretreated conditions 4, 10 and 15% NH4OH solution, 60 min., 100⁰C) with 3% of solid loading. A glucose conversion of 64.2% was reached in the best condition (10% NH4OH solution). Experiments were carried out employing steam exploded SCB (5, 10 e 15% NH4OH solution, 60 min. and 100⁰C) with 5% of solid loading. A glucose conversion of 79.9% was reached in the best condition (15% NH4OH solution). Hydrolysis experiments using higher solid loading (5% for in natura and 10% for steam exploded) and 30 FPU/g cellulose (Accellerase 1500) were carried out. A glucose conversion of 69.6% for in natura and 82.2% for steam exploded SCB were obtained. Fermentation assays (250 rpm, 30⁰C) employing commercial and industrial Saccharomyces cerevisiae were conducted, in a rich and poor medium. A theoretical fermentation yield up to 78% was found for the poor medium and around 88% for the rich medium. The industrial S. cerevisiae shows a value of yield slightly superior to those of commercial strain. Samples of SCB (before and after pretreatment) were analyzed by scanning electron micrograph (SEM). / O objetivo deste trabalho foi avaliar a etapa de pré-tratamento do bagaço de cana de açúcar empregando amônia aquosa, um método alcalino. Amostras de bagaço (in natura e explodido a vapor não lavado) foram tratadas na proporção 1:5 (massa de bagaço seco por massa de solução de NH4OH), em escala de bancada. Ensaios preliminares foram realizados empregando solução 28% (m/m) de NH4OH, a temperatura ambiente 24 ± 3 ⁰C por 7, 15 e 30 dias em recipiente fechado. Nestes experimentos verificou-se que o pré-tratamento foi seletivo na remoção de lignina e hemicelulose. Novos experimentos foram realizados fixando-se a temperatura em 50⁰C e a concentração de NH4OH em 15%. Avaliaram-se tempos de reação de 30, 60 e 90 min. Nestes prétratamentos o mesmo comportamento foi observado. Nos próximos ensaios o tempo de reação foi fixado em 60 min e a temperatura em 100⁰C. Amostras de bagaço foram pré-tratadas em soluções de NH4OH (4 a 15%). Experimentos de hidrólise enzimática foram realizados em frascos de Erlenmeyer (50⁰C, pH 4,8 e 250 rpm) empregando 30 FPU/g bagaço (Accellerase 1500, Genencor) e 5 CBU/g bagaço (BG, Genencor). Na hidrólise das amostras de bagaço in natura (pré-tratadas com soluções de NH4OH 4, 10 e 15%, 60 min, 100⁰C) com carga de sólidos de 3% a melhor conversão em glicose foi de 64,2% (amostra tratada NH4OH 10%). Na hidrólise da amostra de bagaço explodido (pré-tratadas com NH4OH 5, 10 e 15%, 60 min e 100⁰C) com carga de sólidos de 7% a melhor conversão em glicose foi de 79,9% (amostra tratada com NH4OH 15 %). Hidrólises com maior carga de sólidos, 5% (bagaço in natura) e 10% (bagaço explodido), utilizando 30 FPU/g celulose (Accellerase 1500, Genencor) foram realizadas. Nestes ensaios obteve-se conversão em glicose de 69,6% (bagaço in natura) e 82,2% (bagaço explodido). Experimentos de fermentação alcoólica (250 rpm, 30⁰C) foram realizados empregando levedura Saccharomyces cerevisiae (comercial e industrial) em meios de cultivo denominados rico e pobre . A eficiência na conversão da glicose em etanol nos experimentos foi acima de 78% (meio pobre ) e da ordem de 88% (meio rico ). A levedura industrial apresentou eficiência um pouco superior à comercial. As amostras de bagaço (antes e após o pré-tratamento) foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV).

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Os demais resultados variaram com o amadurecimento, porém, com comportamentos diferentes em cada progênie, exceto os teores de açúcares totais, sólidos solúveis e relação SS/ATT, que mostraram tendência de aumento, e a acidez titulável total, que diminuiu em todas as progênies. No geral, foram obtidos maiores conteúdos de vitamina C no estádio verde, com uma primeira etapa de degradação, ao atingir o estádio semimaduro, seguido de uma etapa de síntese até o final da maturação, exceto na progênie 38, que mostrou somente redução. Quanto aos compostos fenólicos, durante o amadurecimento, as três progênies foram caracterizadas por processos de síntese e degradação de compostos fenólicos totais; os flavanóis totais diminuíram; os flavonóis comportaram-se de maneira distinta entre as progênies, com elevação do conteúdo nas progênies 17 e 38, e redução na progênie 44; devido à limitação do método utilizado para pequenas quantidades, foi possível quantificar antocianinas somente nas progênies 17 e 44 no estádio maduro. As capacidades antioxidantes, por meio dos métodos TEAC e DPPH, diminuíram em todas as progênies. Além do efeito significativo do estádio de maturação, os resultados mostraram que a variabilidade genética do camu-camu influenciou de forma significativa nas características físicas dos frutos e nos conteúdos de todos os compostos estudados, além das capacidades antioxidantes obtidas pelos métodos utilizados. / This study aimed to determine physical and physico-chemical characteristics, bioactive compounds and antioxidant capacity from camu-camu pulp of three different progenies, came from Active Germplasm Bank of camucamuzeiro, at Embrapa Amazônia Oriental, in three ripening stages. Over the ripening, the mass and the diameters varied (p ≤ 0.05) just for progeny 44 and the pulp yield increased for all the progenies, with results over 50% in the ripe stage. The ripening stage didn’t show effects in the moisture and ashes content and also pH for progeny 38; ashes for progeny 44 and fat and insoluble fibers for progeny 17. The others results varied with the ripening, but, with different behaviors to each progeny, except for the total sugar, soluble solids contents and the SS/TTA ratio, which showed a tendency to increase, and the total titratable acidity decreased in all the progenies. Overall, a higher level of vitamins C were obtained in the green stage, with a first step of degradation, as it reached the semi-ripe stage, followed by a synthesis step until the end of the ripening stage, except for the progeny 38, which showed a reduction. As for the phenolic compounds, during the ripening stage, the three progenies were characterized for synthesis and degradation processes of the total phenolic compounds; the total flavanols decreased; the flavonols content had a distinct behavior in each progeny, with an increasing in the progenies 17 and 38, and a decreasing in the progeny 44; due to a limitation of the method used to determine small quantities, It was possible to quantify anthocyanins only for progenies 17 and 44 in the ripening stage. The antioxidant capacity, determinated through the methods TEAC and DPPH, decreased in all the progenies. Besides the significant effects of the ripening stage, the results showed that the genetic variability of camu-camu influenced significantly the physical characteristics of the fruits and the continents of all compounds studied, and still the antioxidant capacity obtained through the methods mentioned.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3277.pdf: 7015864 bytes, checksum: 9834075e819d2bb62213cf25d21ce5e5 (MD5) Previous issue date: 2010-08-27 / Haemophilus influenzae type b (Hib) is a Gram negative bacterium responsible for causing meningitis worldwide. The capsular polysaccharide b, a polymer composed by repeating units of ribosyl-ribitol phosphate (PRP), is the major virulence factor and it is used in the formulation of the vaccine against this microorganism. Despite their high efficiency, the conjugated vaccine against Hib is a product of high production cost, which involves fermentation, purification and conjugation processes to obtain a final product within the specifications of the World Health Organization (WHO). The improvement of the culture medium and cultivation conditions can contribute to reduce the cost of this vaccine in order to facilitate its dissemination in developing countries. The main objective of this work was to identify culture conditions that result in higher production of capsular polysaccharide, helping to reduce costs in the steps of purification and conjugation. The experiments were carried out in shake flasks or in bioreactors with 7-13 liters of capacity. The temperature was maintained at 37 °C, pH controlled at 7.5 by adding NaOH 5M and the concentration of dissolved oxygen (CDO) maintained at 30% of air saturation. The specific flow rate of air ranged between 0.2 and 1 VVM. Samples were collected at regular time intervals to measure optical density (DO540nm), biomass concentration, capsular polysaccharide (PRP) production and concentrations of glucose and metabolites. Two possibilities for increasing polysaccharide production were studied: 1) different strategies of fed-batch cultivation consisting of: a) intermittent addition of glucose (FBIG), b) constant feeding (FBCF), c) exponential feeding (FBEF), e d) exponential feeding with cell recycle and perfusion (FBER + P); 2) improvement of culture media composition regarding the carbon/nitrogen ratio through the use of central composite rotational design (CCRD) methodology, having as independent variables: Soy Peptone (S), Yeast Extract (YE) and Glucose (G). Quality parameters were also evaluated to assess the molecular weight profile of the product (PRP) as well as morphological aspects of the microorganism. Economic analysis of different cultivation strategies was used to identify the more economically viable process. The results of the different cultivation strategies together with the outputs of the studied processes cost analysis showed that FBCF, with a cost of U.S.$ 425.50/g PRP and productivity of 88 mg/L.h, showed to be the best alternative among PRP production processes due to its lower cost with a good productivity. In the study of the culture media composition through the statistical analysis of the CCRD results showed that the best culture media composition (BCM) consisted of S 5 g/L; YE 5.5g /L and G of 15.25 g/L. DO540nm and PRP volumetric production values of 8.4 and 410 mg/L, respectively, were attained in validation experiments carried out in shake flasks at the BCM condition. For the bioreactor BCM validation experiment, biomass concentration of 3 g DW/L and polysaccharide production of 600 mg PRP/L were observed. Similar values were reached at validation runs performed in shake flasks and bioreactor for the central point CP condition, showing that both BCM and CP conditions belong to the optimum region. The analysis of quality parameters showed that the cultivation time influences strongly the size of the polysaccharide molecule. The longer the cultivation time, the lower molecular weight was found. The analysis by transmission electron microscopy (TEM) of H. influenzae cells revealed a predominance of round cells in the sixth hour of cultivation, whereas in the twelfth hour of cultivation the cells exhibited a more elongated morphology with the presence of cytoplasmic inclusions in the shape of granules, possibly due to the accumulation of some reserve material. Based on these results, the new composition of the culture medium resulted in an increased of cell growth and capsular polysaccharide production with half of the sources nitrogen (soybean peptone and yeast extract) concentrations, which reduces the production cost. The cultivations that resulted in higher production and productivity of polysaccharide were FBCF (1600 mg PRP/L and 88 mg PRP/(L.h)) and FBER+ P (1800 mg PRP/L and 129 mg PRP/(L.h)). The FBER+P reached 30% higher productivity of polysaccharide than the best result described in the literature (90 mg PRP/(L.h)). However, the FBCF cultivation was economically more viable. / Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é uma bactéria Gram negativa responsável por causar meningite em todo o mundo. O polissacarídeo capsular b, um polímero composto por unidades repetidas de ribosil-ribitol-fosfato (PRP) e o principal fator de virulência, sendo utilizado na formulação da vacina contra este microrganismo. Apesar de sua elevada eficiência, a vacina conjugada contra Hib é um produto de alto custo de produção por envolver processos de fermentação, purificação e conjugação para obtenção de um produto final dentro das especificações da Organização Mundial da Saúde (OMS). O melhoramento do meio de cultura e das condições de cultivo pode contribuir para redução do custo desta vacina de forma a facilitar sua difusão nos países subdesenvolvidos. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi identificar condições de cultivo que resultem em maior produção de polissacarídeo capsular, contribuindo para reduzir os custos nas etapas de purificação e conjugação. Os ensaios foram conduzidos em frascos agitados ou em biorreatores com 7 a 13 litros de capacidade nominal. A temperatura foi mantida em 37oC, o pH controlado em 7,5 através da adição de NaOH 5M e a concentração de oxigênio dissolvido (COD) mantida em 30 % da saturação do ar. A vazão especifica de ar variou entre 0,2 e 1 VVM. Amostras foram coletadas em intervalos regulares de tempo para mensurar densidade óptica (DO540nm), concentração celular, produção de polissacarídeo capsular (PRP) e concentrações de glicose e metabolitos. Duas possibilidades para aumentar a produção de polissacarídeo foram estudadas: 1) diferentes estratégias de cultivo descontinuo alimentado consistindo por: a) adição intermitente de glicose (CDAIG), b) vazão constante (CDAVC), c) vazão exponencial (CDAVE), e d) reciclo de células seguido de perfusão (CDAVE+P)); e 2) o melhoramento da composição do meio de cultura quanto à relação carbono/nitrogênio através do uso da metodologia de delineamento composto central rotacional (DCCR), tendo como variáveis independentes: Peptona de Soja (S), Extrato de Levedura (EL) e Glicose (G). Parâmetros de qualidade também foram avaliados para verificar o perfil da massa molecular do produto (PRP) e os aspectos morfológicos do microrganismo. Os resultados das diferentes estratégias de cultivo juntamente com os resultados da analise econômica do custo dos processos estudados mostraram que o CDAVC, com custo de US$ 425.50/g PRP por ano e produtividade de 88 mg/(L.h), demonstrou ser a melhor alternativa para o processo de produção de PRP por apresentar menor custo com boa produtividade. Já o estudo da composição do meio de cultura através da analise estatística dos resultados do DCCR mostraram que a melhor composição do meio de cultivo (MMC) consistia em S de 5 g/L, EL de 5,5 g/L e G de 15,25 g/L. Valores de DO540nm de 8,4 e de produção volumétrica de polissacarídeo de 410 mg PRP/L foram alcançados em experimentos de validação na condição MMC realizados em shaker. Para o ensaio de validação da condição MMC em reator, a concentração de biomassa de 3,0 g MS/L e a produção de polissacarídeo capsular de 600 mg PRP/L foram observadas. Valores semelhantes foram obtidos em experimentos de validação realizados em shaker e biorreator na condição CPC, mostrando que tanto a condição CPC como a MMC pertencem a região de ótimo. A analise dos parâmetros de qualidade mostrou que o tempo de cultivo influencia fortemente no tamanho da molécula do polissacarídeo, sendo que quanto maior o tempo de cultivo, menor a sua massa molecular. A analise por microscopia eletrônica de transmissão (MET) das células de H. influenzae mostrou a predominância de células com morfologia arredondada na sexta hora de cultivo, enquanto que, na décima segunda hora de cultivo, as células apresentaram morfologia mais alongada e exibiram a presença de inclusões citoplasmáticas na forma de grânulos, possivelmente devido ao acumulo de algum material de reserva. Diante dos resultados obtidos, a nova composição de meio resultou em maior crescimento celular e produção de polissacarídeo capsular, com metade das concentrações das fontes de nitrogênio (peptona de soja e extrato de levedura), o que reduz o custo de produção. Os cultivos que resultaram em maior produção e produtividade foram o CDAVC (1600 mg PRP/L e 88 mg PRP/L.h) e o CDAVE+P (1800 mg PRP/L e 129 mg PRP/L.h), sendo que este ultimo (CDAVE+P) atingiu produtividade 30 % maior que o melhor resultado ate então descrito na literatura (90 mg PRP/L.h). No entanto, o cultivo CDAVC apresentou maior viabilidade do ponto de vista econômico e de execução e passível de escalonamento.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3187.pdf: 3659896 bytes, checksum: 975ac91a3eb67a4347c326de8f22bf8e (MD5) Previous issue date: 2010-03-31 / Universidade Federal de Minas Gerais / This master's thesis project aims at studying the dynamic optimization of the operation of a bench scale (up to 5L) automated, agitated and aerated bioreactor, where the semi-continuous cultivation of recombinant Pichia pastoris is run. This yeast was cloned using the PGK1 promoter, which precludes the use of methanol as inducer, expressing constitutively the enzyme penicillin G Acylase (PGA) from Bacillus megaterium. While the group of molecular biology of DEQUFSCar is working on cloning the PGA, d P. pastoris expressing the enzyme - amylase from Bacillus subtilis was cultivated. This clone, provided by prof. Fernando Torres, UnB, uses the same construction and, therefore, its kinetics of growth and production should be very similar to the PGA s. Cultivation of recombinant Pichia pastoris was performed in flasks (skaker) using standard culture medium, aiming at obtaining kinetic data, which are the starting point for the escalation to a benchtop bioreactor. Following that, tests were performed in a 5L bioreactor in batch and fed batch operation modes. With the bioreactor data , kinetic parameters of growth, to be further used in the simulations, were estimated, using a hybrid algorithm (which combines the global method Simulated Annealing, with the local one Levenberg- Marquardt). This algorithm, is implemented in Matlab and available in the software library of Ladabio (Laboratory of Development and Automation of Bioprocesses ). From these data, models of microbial growth and of production were developed, following a classic approach (unstructured, non-segregated). Computer simulations using different feeding strategies and employing these models allowed mapping the dynamics of the system. From this information, optimal control strategies were proposed to define optimal feeding profiles. Cellular concentrations of 5.4 g/L (dry weight) were reached in shaker (20h of cultivation, when glucose is exhausted), expressing 218 U/mL of -amylase, compared to 11.4 g/L (dry weight) that were achieved in cultures in a bioreactor in batch simple (10h of cultivation, when glucose is exhausted), expressing 156 U/mL of -amylase In fed-batch cultures, cell concentrations of up to 45 g/L were achieved, expressing up to 260 U/mL of - amylase, with a productivity of 5.2 U/mL/ h. In fed-batch cultures of P. pastoris expressing PGA, cell concentrations of up to 35 g/L were achieved. Enzyme activity was not detected in the culture broth due to the effect of glycosylation. Immunodetection reaction confirmed the expression of the recombinant enzyme. Four specific growth rate equations were adjusted, with different types of inhibition by one product, detected at significant levels by liquid chromatography highperformance, but not yet identified. This metabolite was added as an inhibitor in kinetic models, using the peak areas, normalized as a pseudoconcentration. The best fit to the experimental data were the Monod kinetic model with non-competitive inhibition. Typical values obtained for the maximum specific growth and glucose/ cell conversion factor in bioreactor were max=0,24 h-1 and YX/S = 0,48. Algorithm for optimal control in open loop was developed and successfully implemented, providing a robust profiles of great power, whose validation is proposed as a continuation of this work. / Este mestrado se propoe a estudar a otimizacao dinamica de biorreator automatizado, tipo tanque agitado e aerado, em escala de bancada (ate 5L), onde se processa o cultivo semi-continuo de Pichia pastoris recombinante. Essa levedura foi clonada pelo grupo do prof. Fernando Torres, da UnB, utilizando o promotor PGK1, que dispensa a utilizacao de metanol como indutor, expressando constitutivamente a enzima -amilase de Bacillus subtilis. Durante a execucao deste mestrado, a enzima penicilina G acilase (PGA) de Bacillus megaterium esta sendo clonada pelo grupo de biologia molecular do DEQ-UFSCar usando a mesma construcao e, portanto, a cinetica de crescimento e producao da PGA heterologa devera ser muito semelhante as da -amilase, utilizada como estudo de caso para otimizacao do bioprocesso. Cultivos de Pichia pastoris recombinante foram realizados em frascos agitados, utilizando meio de cultivo padrao, objetivando o levantamento de dados cineticos, ponto de partida para o escalonamento em biorreator de bancada. Posteriormente, foram realizados ensaios em biorreator de 5L, em batelada e batelada alimentada. Com os dados obtidos nos cultivos em biorreator, e utilizando algoritmo hibrido para estimativa de parametros (que combina o metodo global Simulated Annealing, com o local de Levenberg-Marquardt), implementado em MatLab e disponivel no LaDABio (Laboratorio de Desenvolvimento e Automacao de Bioprocessos), foram ajustados parametros cineticos de crescimento, para serem utilizados nas simulacoes dos cultivos em biorreator. A partir dai, foi desenvolvido modelo de crescimento microbiano e de producao, utilizando um enfoque classico (modelo nao-estruturado, nao-segregado) para descrever o sistema. Com isso, torna-se possivel realizar simulacoes em computador usando diferentes estrategias de alimentacao, para mapear a dinamica do sistema. A seguir, foram desenvolvidos algoritmos de controle otimo em malha aberta para definicao de estrategias de alimentacao. Concentracoes celulares de 5,4 g/L (massa seca) foram alcancadas em cultivos em camara rotatoria (20h de cultivo, quando se esgota a glicose), expressando 218 U/mL de -amilase, comparado com 11,4 g/L(massa seca) que foram atingidos em cultivos em biorreator em bateladas simples (10h de cultivo, quando se esgota a glicose), expressando 156 U/mL de -amilase. Em cultivos em batelada alimentada concentracoes celulares de ate 45 g/L foram atingidas, expressando ate 260 U/mL de -amilase, com uma produtividade de 5,2 U/mL/h. Em cultivo em batelada alimentada de P. pastoris expressando PGA, concentracoes celulares de ate 35 g/L foram atingidas. Nao foi detectada atividade enzimatica no caldo de cultivo devido ao efeito da glicosilacao. Reacao de imunodeteccao confirmou a expressao da enzima recombinante. Foram ajustadas quatro equacoes de velocidade especifica de crescimento, com diferentes tipos de inibicao por um produto, detectado em niveis importantes por cromatografia liquida de alto desempenho, mas ainda nao identificado. Esse metabolito foi inserido como inibidor nos modelos cineticos, utilizando as areas dos picos, normalizadas, como uma pseudoconcentracao. Os melhores ajustes aos dados experimentais foram com modelo cinetico de Monod com inibicao nao-competitiva. Valores tipicos obtidos para a velocidade especifica maxima de crescimento e de fator de conversao glicose/celula em biorreator foram max = 0,24 h-1 e YX/S = 0,48. Algoritmo de controle otimo em malha aberta foi desenvolvido e implementado com sucesso, prevendo de forma robusta perfis otimos de alimentacao, cuja validacao fica proposta como continuidade deste trabalho.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:08:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leandro Daniel de Paris.pdf: 1546283 bytes, checksum: 247240811bb05711d01415950802a38f (MD5) Previous issue date: 2008-12-16 / Given the potential of Western Paraná region for the production of conventional soybeans, as well as the expansion of organic and transgenic soybeans and the wide availability of biochemical components such as proteins, polysaccharides, lipids, carbohydrates, minerals, vitamins, fiber, lecithin, and others, present in grain, it makes interesting the use as substrates for solid state fermentation (SSF). This process, although not so used industrially as the submerged fermentation (SFm) may be a viable alternative, because it has shown better results in productivity, especially in the cultivation of filamentous fungi and the production of enzymes. The aim of this study was to compare the production of various enzymes using the conventional soybeans, as transgenic and organic substrates by solid state fermentation, using different types of fungi. Were also the characterization of substrates used in fermentation process for the production of the enzymes, evaluation of growth curves of microorganisms and evaluation of optimum conditions for production of enzymes using factorial design. The conventional defatted soybean meal was used as substrate for comparison of enzyme production on raw soybean (grain). Using the fungi Aspergillus niger sp., fermentations were carried out for construction of growth curves of microorganisms and selection of the best conditions for production of the enzyme protease (type of soybean, fermentation of the medium moisture, pH, initial concentration of inoculum, diameter particle of the substrate and time of fermentation). After determining the optimum conditions, the fungi Aspergillus clavatus was used to carry out the fermentation under these conditions, where again the growth curves were constructed in order to compare the enzyme production of different types of fungi. It can by seen a wide variation in the production of different types of enzymes evaluated in this study, the conventional soybean with moisture of 50%, time of 144h of fermentation, concentration of initial inoculum of 4.106 spores/gdw and particle diameter of 0,6 mm the best conditions for production of protease enzyme. The pH of the medium indicated enzymatic activities at different levels, and the highest activities obtained in alkaline medium (pH 9,0). Subsequently, studies were performed to optimize the fermentation medium with the addition of nutrients and pH control, and construction of growth curves of the optimal point using the fungi Aspergillus casiellus, where you can see an increase in the production of protease for fermentation carried out with Aspergillus niger and Aspergillus clavatus. The results of studies showed that the best results were observed in the production of protease, amylase and invertase, and the interesting use of soybean as a substrate to obtain these enzymes by SSF. For the other enzymes, there was a low production using the soybean. / Dado o potencial regional do Oeste do Paraná para a produção de soja convencional, assim como a expansão das sojas orgânica e transgênica e também a ampla disponibilidade de componentes bioquímicos como proteínas, polissacarídeos, lipídios, carboidratos, minerais, vitaminas, fibras, lecitina, dentre outros, presentes no grão, torna-se interessante sua utilização como substratos para a fermentação em estado sólido (FES). Este processo, apesar de não ser tão utilizado industrialmente quanto à fermentação submersa (Fsm), pode ser uma alternativa viável, pois tem apresentado resultados superiores de produtividade, principalmente no cultivo de fungos filamentosos e na produção de enzimas. Assim, o objetivo deste trabalho foi o de comparar a produção de diferentes tipos de enzimas utilizando as sojas convencional, transgênica e orgânica como substratos, por fermentação em estado sólido, utilizando diferentes tipos de fungos. Foram feitas também, a caracterização dos substratos utilizados no processo de fermentação para a produção das enzimas amilase, protease, lipase, celulase e invertase, avaliação das curvas de crescimento dos microrganismos e avaliação das condições ótimas de produção das enzimas utilizando planejamento fatorial. O farelo de soja convencional desengordurado também foi utilizado como substrato, para comparação da produção enzimática em relação à soja bruta (grão). Com a utilização do fungo Aspergillus niger sp., foram realizadas fermentações para construção de curvas de crescimento do microrganismo e seleção das melhores condições de produção da enzima protease (tipo de soja, umidade do meio fermentativo, pH, concentração inicial de inóculo, diâmetro de partícula do substrato e tempo de fermentação). Após a determinação das condições ótimas, o fungo Aspergillus clavatus foi utilizado para a realização da fermentação sob tais condições, onde novamente foram construídas curvas de crescimento, com o intuito de comparar a produção enzimática dos diferentes tipos de fungos. Pode-se observar uma grande variação na produção dos diferentes tipos de enzimas avaliados neste trabalho, sendo a soja convencional com umidade de 50%, tempo de fermentação de 144h, concentração inicial do inóculo de 4.106 esporos/gms e diâmetro de partícula de 0,6 mm as melhores condições para a produção da enzima protease. O pH do meio indicou atividades enzimáticas em diferentes níveis, sendo as maiores atividades obtidas em meio alcalino (pH 9,0). Em seguida, foram realizados estudos de otimização do meio fermentativo com adição de nutrientes e controle de pH, e construção das curvas de crescimento no ponto ótimo utilizando o fungo Aspergillus casiellus, onde pode-se observar um aumento na produção da protease em relação às fermentações realizadas com Aspergillus niger e Aspergillus clavatus. Os resultados obtidos nos estudos mostraram que os melhores resultados foram observados na produção de protease, amilase e invertase, sendo interessante o uso da soja como substrato para a obtenção destas enzimas por FES. Para as demais enzimas, verificou-se uma baixa produção com a utilização da soja.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3950.pdf: 2965296 bytes, checksum: 1e00d517bd464f272b8c1a2c9f67ca9c (MD5) Previous issue date: 2011-10-11 / Valée S.A. / Swine erysipelas is among the diseases that causes great economic losses in swine cultures worldwide. The disease is caused by the bacterium Erysipelothrix rhusiopathiae, and the surface protein SpaA is one of its main antigens. Herein, we report studies concerning the development of recombinant vaccines against swine erysipelas based on the SpaA antigen. Protein production for a subunit vaccine formulation was studied in shaken flasks and 5.0 L bioreactors. For this propose, a 1026 bp fragment of the spaA gene was cloned in Escherichia coli cells under the lac promoter control. The recombinant organism (E. coli BL21(DE3) pET28a_spaA) was cultivated in fed batch using complex medium with glycerol as carbon source. Nonconventional induction strategies were evaluated and high protein yield (198 mgprot/gDCW) and productivity values (0.4 gprot/L.h) were reached. The same antigen was cloned for expression and secretion in attenuated Salmonella typhimurium cells to obtain a live bacterial vector for the SpaA antigen. The recombinant lineage was able to express and secrete the SpaA fragment fused to the alpha-hemolysin secretion signal both in vitro and in vivo. High plasmid maintenance was observed in both conditions. The vaccinal vehicle showed to be able to colonize the Peyer patches and to invade the gut epithelial barrier in the inoculated animals. Immunization tests in murine model showed that the recombinant antigen delivered by Salmonella cells inoculated by oral route induced the production of seric IgG antibodies anti-SpaA. According to the literature, these antibodies must be able to promote pathogen opsonization in case of infection, contributing to confer a protective immunity against swine erysipelas to the vaccinated animals. In summary, this work presents contributions to development of subunit vaccines against swine erysipelas, in the form of recombinant protein formulations, or SpaA antigen delivery by attenuated S. typhimurium cells. / A erisipela suína é uma das enfermidades que causam grandes prejuízos na suinocultura em todo o mundo. A doença é causada pela bactéria Erysipelothrix rhusiopathiae, e a proteína de superfície SpaA desse microrganismo é um de seus principais antígenos. Neste trabalho, estudou-se o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra a erisipela suína a partir do antígeno SpaA. Avaliou-se a produção de uma vacina de subunidade composta pelo antígeno recombinante, a qual foi estudada em frascos agitados e em biorretores de bancada de 5,0 L. Para isso, um fragmento de 1026 pb do gene spaA foi clonado em células de Escherichia coli sob controle do promotor lac e o organismo recombinante (E. coli BL21(DE3) pET28a_spaA) foi cultivado em batelada alimentada, utilizando-se meio complexo contendo glicerol como fonte de carbono. Estratégias não convencionais de indução foram avaliadas e altos valores de rendimento (198 mgprot/gDCW) e produtividade (0,4 gprot/L.h) da proteína recombinante foram alcançados. O mesmo antígeno foi clonado em um plasmídeo que possibilita a expressão e secreção da proteína recombinante em Salmonella typhimurium atenuada, a fim de se obter um vetor bacteriano vivo para o antígeno em questão. A linhagem recombinante foi capaz de expressar e secretar o fragmento da proteína SpaA fusionado ao sinal de secreção da alfa-hemolisina tanto in vitro quanto in vivo, apresentando alta taxa de manutenção plasmidial nas duas condições. Além disso, o veículo vacinal se mostrou capaz de colonizar as placas de Peyer e de invadir a barreira epitelial do intestino dos animais inoculados. Ensaios de imunização em modelo murino mostraram que a veiculação do antígeno pelas células de Salmonella inoculadas por via oral induziu a produção de anticorpos IgG séricos anti-SpaA, que de acordo com a literatura, devem ser capazes de promover a opsonização do patógeno em caso de infecção, contribuindo para conferir uma imunidade protetora contra a erisipela suína aos animais vacinados. Em suma, este trabalho apresenta contribuições para o desenvolvimento de vacinas de subunidade contra a erisipela suína na forma de uma vacina de proteína recombinante, ou por veiculação do antígeno SpaA por linhagens atenuadas de S. typhimurium.