Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1094.pdf: 1192329 bytes, checksum: 6de19a879e61a0e431805f61ab3dfb21 (MD5) Previous issue date: 2005-09-19 / Universidade Federal de Sao Carlos / In the last 10 years the insect cell Drosophila melanogaster Schneider S2 has been increasingly used for studies of proteins recombinants. However, there is a lack of studies that involved parameters related to the use of the insect cell Drosophila melanogaster in bioprocess. The aim of this work was to study the factors physiologies important in the cultures of the insect cells Drosophila melanogaster S2 (S2) and recombinant S2 (rS2), through cultures in Schott flask, serum free medium at 28°C. There were performed experiments with the purpose of monitoring the viability cellular of insect cells by the methods of exclusion of Trypan blue and of fluorescent dyes. Both methods used in the experiments to monitor the viability of the cultures of the cells S2 and rS2 were shown reliable for the identification of the percentage of viable cells. The studies revealed that growth of S2 and rS2 cells was not limited by the total consumption of amino acids and glucose. In the experiments utilizing the rS2 cells to verify the influence of the age of the inoculum and concentration of the inoculum, it was verified that both parameters did not have influence in the growth specific rate. Experiments done in Schott flask of 250 mL with a working of 50 mL, in which were monitored the concentration of dissolved oxygen (DO) in the broths of cultivation of the cells S2 and rS2. The results demonstrated that the cultivation reaches the stationary phase with very low level of dissolved oxygen, whit DO being a limiting factor of the growth of the cells. The specific oxygen consumption rate (QO2) demonstrates an accentuated decrease in the exponential phase of growth, except for stationary phase. The excess of oxygen in the initial phase of the cultivation was harmful to the growth of the cells. However, in the experiments done in Schott flask 100 mL with a working volume of 20 mL, QO2 of the cells rS2, revealed 10 to 15 times smaller than these performed in the Schott flask of 250 mL. The experiments done in Schott flask of 100 mL with different agitations demonstrated that for low agitation the transfer of oxygen should be a limiting factor in the cellular growth. The cellular viability for all of the experiments performed in different agitations stayed between 95 and 99% of viable cells indicating that the cells were in good physiologic state. / Nos últimos 10 anos a célula de inseto Drosophila melanogaster Schneider S2 tem se destacado nos estudos de proteínas recombinantes. Entretanto, encontra-se na literatura pouco estudo dos parâmetros relacionado ao uso da célula de inseto Drosophila melanogaster em bioprocessos. O presente trabalho foram avaliados fatores fisiológicos importantes no do cultivo das células de inseto Drosophila melanogaster S2 (S2) e recombinante S2 (rS2) através de cultivos em frasco Schott e meio livre de soro a 28°C. Realizaram-se experimentos nos quais foi acompanhada a viabilidade celular das células de insetos pelos métodos de exclusão de corante azul de Tripan e de corantes fluorescentes. Ambos os métodos utilizados nos experimentos para acompanhar a viabilidade do cultivo das células S2 e rS2 se mostraram confiáveis para identificação da porcentagem de células viáveis. Os estudos demonstraram que o crescimento das células S2 e rS2 não foram limitados pelo consumo total de aminoácidos e glicose. Nos experimentos utilizando as células rS2 para verificar a influência da idade e concentração do inóculo, verificou-se que ambos os parâmetros não tem influência na velocidade específica de crescimento máxima. Foram realizados experimentos em frasco Schott de 250 mL com volume de trabalho de 50 mL, nos quais foram monitoradas as concentrações de oxigênio dissolvido (OD) nos caldos de cultivo das células S2 e rS2. Os resultados demonstraram que o cultivo atingiu a fase estacionária com nível muito baixo de oxigênio dissolvido. Sendo este um fator limitante do crescimento das células. A velocidade específica de respiração celular (QO2) demonstrou um decréscimo acentuado na fase exponencial de crescimento exceto para fase estacionária. O excesso de oxigênio na fase inicial do cultivo foi prejudicial para o crescimento das células. Entretanto, nos experimentos realizados em frasco Schott de 100 mL com volume de trabalho de 20 mL, QO2 das células rS2 apresentou-se 10 a 15 vezes menor que realizados no frasco Schott de 250 mL. Os experimentos realizados em frasco Schott de 100mL com diferentes agitações demonstraram que para baixa agitação, a transferência de oxigênio deve ser um fator limitante no crescimento celular. A viabilidade celular para todos os experimentos realizados em diferentes agitações se manteve entre 95 e 99% de células viáveis, indicando que as células estavam em bom estado fisiológico.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAC.pdf: 1100634 bytes, checksum: a59508afe52240474931f49ecbfe180d (MD5) Previous issue date: 2007-03-12 / Universidade Federal de Sao Carlos / In biochemical processes, shear rate ( γ&) in the system is an important variable on design and operation of bioreactors. Shear can result in damage to the cells and the microorganisms, taking to the viability loss and even to the cellular breaking and the microbial death. In the present work was proposed a methodology to quantify average shear rate ( av γ & ) in stirred bioreactor with a 4 L working volume, through volumetric oxygen transfer coefficient (kLa), varying the operating conditions, as the impeller rotational speed (N: 600, 700, 800, 900 and 1000 rpm) and the specific air flow rate (Φar: 0.50 and 1.00 vvm). Five different glycerol solutions and distilled water were utilized as Newtonian fluids and six different xantham gum solutions were utilized as non-Newtonian fluids. Dynamic viscosity (µ) of the glycerol solutions and rheological parameters (K, n) for the xantham gum solutions, were determined at 28ºC from rheograms using a digital concentric-cylinders rheometer. Based on the obtained results, a correlation for average shear rate ( av γ & ) as function of the impeller rotational speed (N), rheological parameters (K, n) and volumetric oxygen transfer coefficient (kLa) was proposed. The correlation obtained for the average shear rate ( av γ & ) showed appropriate to estimate av γ & , because the estimated values approximated of others values described in literature for another correlations. In a second stage, four cultivations of Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 was realized in a stirred bioreactor, aerated 0.50 vvm and agitated in 700, 800, 900 and 1000 rpm. Process variable values, as consistency index (K), flow index (n), cellular concentration (Cx), glicerol concentration (CGlic) and 2 CO n& produced ag of the cultivations were evaluated. It was observed that the consistency index (K), flow index (n) and cellular concentration (Cx) varied due to shear conditions imposed to the cultivations. Finally, based on experimental literature results, average shear rate ( av γ & ) was determined in function of the time for cultivation of S. clavuligerus in stirred bioreactor for 600, 800 and 1000 rpm and specific air flow rate (Φar) of 0.50 vvm, using the proposed methodology, the obtained values were more consistent, because the experimental values of kLa were obtained by gaseous balance. / Em processos bioquímicos, a velocidade de cisalhamento ( γ &) no meio reacional é uma importante variável no projeto e operação de biorreatores. O cisalhamento pode resultar em dano às células e aos microrganismos, levando à perda de viabilidade e até mesmo ao rompimento celular e à morte microbiana. No presente trabalho propôs-se uma metodologia para quantificar a velocidade de cisalhamento média ( γ &m) em biorreator convencional tipo tanque agitado e aerado com 4 litros de volume útil, através do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa), variando-se as condições de operação, no caso freqüência de rotação do impelidor (N: 600, 700, 800, 900 e 1000 rpm) e vazão específica de alimentação de ar (Φar: 0,50 e 1,00 vvm). Utilizaramse cinco diferentes soluções de glicerol e água destilada como fluidos Newtonianos, e seis diferentes soluções de goma xantana como fluidos não-Newtonianos. As viscosidades dinâmicas (µ) para as soluções de glicerol e as constantes reológicas (K e n) para as soluções de goma xantana foram obtidas a 28ºC em reômetro de cilindros concêntricos a partir de reogramas. Com base nos resultados obtidos, propôs-se uma correlação para a velocidade de cisalhamento média ( γ &m) em função da freqüência de rotação do impelidor (N), das propriedades reológicas dos fluidos (K e n) e do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa). A correlação obtida para a velocidade de cisalhamento média ( γ &m) mostrou-se adequada para estimativas de γ &m, pois os valores estimados aproximaram-se de outros estimados por diferentes correlações propostas na literatura. Numa segunda etapa, realizaram-se quatro cultivos com Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 em biorreator convencional tipo tanque agitado e aerado a 0,50 vvm e agitado em 700, 800, 900 e 1000 rpm. Valores de variáveis do processo como o índice de consistência (K), índice de comportamento de escoamento (n), concentração celular (Cx), concentração de glicerol (CGlic) e quantidade de dióxido de carbono produzido ( 2 CO n& ) foram obtidos ao longo dos cultivos. Observou-se que o índice de consistência (K), índice de comportamento de escoamento (n) e a concentração celular (Cx) sofreram variações decorrentes das condições de cisalhamento impostas aos cultivos. Por fim, com base em resultados experimentais de literatura, determinou-se a velocidade de cisalhamento média ( γ &m) em função do tempo para cultivos de S. clavuligerus em biorreator convencional, a 600, 800 e 1000 rpm e vazão específica de alimentação de ar de 0,50 vvm, empregando-se a metodologia proposta, os resultados obtidos foram mais consistentes, pois se utilizou valores experimentais de kLa obtidos pelo balanço gasoso.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissRTO.pdf: 1502599 bytes, checksum: 74b4b7145b86c0fed8e0b1327b8aaea1 (MD5) Previous issue date: 2006-12-20 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin G acylase (PGA) is an enzyme of major impact in human health for catalyzing the deacilation of the penicillin G, to yield 6-aminopenicillanic acid (6- APA), key intermediate in the semi-synthetic antibiotics production. Several microorganisms produce PGA, but Bacillus megaterium is capable of secreting it to the medium. PGA from B. megaterium has been studied in DEQ-UFSCar. Xanthomonas campestris presents in your DNA the genetic sequence that codify acylase penicillin and tests with a strain of this microorganism from Departamento de Genética e Evolução da UFSCar showed PGA extracellular production. Studies in PGA production were initiated with the microorganism stored in DEQ-UFSCar. At the same time, strains of X. campestris from Coleção de Culturas Tropical (CCT) and Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) were tested. However, assays with these strains showed little cellular growth and no enzymatic activity. The microorganism reactivated was send to Fundação André Toselo for identification. The result showed that the microorganism was Bacillus megaterium. Therefore, at the same time that realized adaptations tries with the new strain of X. campestris, studies of production operational conditions of PGA were performed with strain of Bacillus megaterium, in shaking flasks and bioreactor, as well the enzyme characterization Germination/ propagation of B. megaterium experiments, at 30°C, carried out in shaking flasks showed that the growth time of microorganism in the inoculum step was 24 hours and maximum specific growth rate was µmáx = 0.33h-1. Assays in shaking flasks were carried out in shaker at 30ºC and 300 rpm intend to determine the most adequate pH for the enzyme production in both, microorganism propagation phase and enzyme production phase The results showed that the best pHs among the tested ones were pH 8.0 and 7.0, for the propagation and production phases, respectively, with 355 IU/L. The culture medium with preferentially consumed amino acids 20,0 g/L, potassium phenylacetate 3,5 g/L, solution with differents salts 0,22 g/L and cheese whey 20,0 g/L was the more efficient in PGA production, carried out maximum cellular growth and enzymatic activity, 4,59 g/L and 592UI/L, respectively, in 36 hours. Assays in a 2-L bioreactor, with production medium in the presence of amino acids preferably consumed 10.0 g/L, cheese whey 20.0 g/L, solution of salts 0.22 g/L and inducer potassium phenylacetate 3.5 g/L, indicated that the addition of nutrients during the fermentation is a efficient strategy, providing enzyme production increase. In the study of the influence of oxygen dissolved, carried out in bioreactor too, maximum enzymatic activity was 451 IU/L with 10% of saturation. Moreover, the maximum enzyme production was observed in the bioreactor and not in shaking flasks, like in all experiments until this. In the stage of characterization of the penicillin G acylase from Bacillus megaterium, optimum values of temperature and pH were, 47°C and 8.0, respectively. The Michaelis Menten model fitted resulting in estimated Km and Vmáx parameters values of 1.51 mM and 1.1*10-3 mmol/min*IU, respectively. The activation energy estimated was 27.12 KJ/mol.The results showed that PGA from Bacillus megaterium deactivate completely after 45 minutes of incubation at 60°C and 90 minutes in pH 11.0. / Penicilina G acilase (PGA) é das enzimas de maior impacto na saúde humana, pois catalisa a desacilação de penicilinas naturais, principalmente a penicilina G, para a obtenção do ácido 6-aminopenicilânico (6-APA), composto chave na produção de antibióticos β-lactâmicos. Ela é produzida por diferentes microrganismos, dentre os quais Bacillus megaterium, um dos poucos que secreta a enzima. A produção de PGA por esse microrganismo vem sendo estudada há tempos no DEQ-UFSCar. Xanthomonas campestris possui em seu DNA a seqüência genética que codifica PGA e teste preliminar de cultivo de linhagem desse microrganismo doada pelo Departamento de Genética e Evolução da UFSCar mostrou produção extracelular de PGA. Foi iniciado, por isso, meses depois, estudos de produção de PGA por X.campestris, reativando-se cultura do microrganismo que estava armazenada no DEQ-UFSCar. Em paralelo, foram obtidas e testadas outras linhagens desse microrganismo, procedentes da Coleção de Culturas Tropical (CCT) e do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR). Cultivos dessas novas linhagens de X. campestris mostraram crescimento celular pequeno, sem produção de PGA. Comparando-se essas novas linhagens com o microrganismo que se vinha trabalhando pode-se verificar então que este não era X. campestris. O microrganismo foi a seguir enviado para identificação na Fundação André Toselo. O laudo dessa Instituição mostrou que o microrganismo que vinha sendo cultivado era Bacillus megaterium de Bary 1884AL (ATCC 35985). Esse resultado já era esperado, pois havia muitas semelhanças entre as duas culturas. Contudo, havia também algumas diferenças, que motivaram o envio para identificação criteriosa do microrganismo produtor de PGA. Assim, ao mesmo tempo em que foram realizadas tentativas de adaptação das novas linhagens de X. campestris visando produção de PGA, foram investigadas diferentes condições operacionais de produção da enzima com o microrganismo identificado como B. megaterium, tanto em câmara rotativa shaker como em biorreator, bem como a caracterização da enzima produzida. Ensaios de germinação/propagação de Bacillus megaterium, a 30oC, realizados em shaker , mostraram que o microrganismo atinge fase estacionária em 24 horas, com velocidade máxima específica de crescimento µmáx = 0,33h-1. O pH inicial onde se obtém a maior atividade de PGA é 8,0 para o meio de crescimento (propagação) e pH 7,0 para o meio de produção. Cultivos a diferentes temperaturas mostraram que 30ºC é a temperatura ótima tanto para o crescimento do microrganismo quanto para produção da enzima. O meio de cultivo composto por aminoácidos consumidos preferencialmente pelo microrganismo - 20 g/L, fenilacetato de potássio - 3,5 g/L, solução com diferentes sais 0,22 g/L, e soro de queijo-20,0 g/L mostrou ser o mais eficiente na produção da PGA, atingindo máxima concentração celular e atividade enzimática, 4,59 g/L e 592 UI/L, respectivamente, em 36 horas de cultivo, com pHs para os meios de crescimento e produção iguais a 8,0 e 7,0, respectivamente, e temperatura controlada em 30°C. Cultivos do microrganismo em biorreator de 2 L mostraram que a adição de nutrientes na forma de pulsos é estratégia eficiente, proporcionando aumento nos níveis de produção da enzima. Estudo da influência de oxigênio dissolvido na produção de PGA mostrou que manutenção de 10% de saturação durante todo o cultivo conduz à máxima atividade enzimática, 451 UI/L. Essa deve ser realmente a condição ótima para oxigênio, pois pela primeira vez se obteve maior atividade enzimática no biorreator e não no ensaio em shaker , sempre realizado em paralelo para padronização do estudo. Resultados obtidos na caracterização da enzima confirmaram os valores já obtidos anteriormente para PGA de B. megaterium: temperatura e pH ótimos foram 47°C e 8,0, respectivamente; parâmetros cinéticos obtidos por ajuste do modelo de Michaelis-Menten a dados de velocidades iniciais de hidrólise de penicilina G catalisada por PGA, a 370C, foram: Vmáx 1,1*10-3 mmol/min*UI e Km 1,51 mM; meia-vida da enzima a 60°C é de 10 minutos, com inativação completa após 45 minutos de exposição. Quanto à estabilidade alcalina, verificou-se a completa desnaturação de PGA após 90 minutos de incubação a pH 11,0, com tempo de meia vida de 1 minuto.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2710.pdf: 4294730 bytes, checksum: d0fe5cecb9df30a9763959023ef77038 (MD5) Previous issue date: 2009-09-01 / Universidade Federal de Sao Carlos / The cephamycin C is a natural cephalosporin produced by Streptomyces clavuligerus, of great importance in the pharmaceutical industry; it is a β-lactam antibiotic that acts as an inhibitor of the cellular wall synthesis. Besides some activity against Gram-negative bacteria, the cephamycin C is resistant to the action of β-lactamase enzymes responsible for the resistance to penicillin. The information available in the literature, on the stages of the industrial production process of cephamycin C is scarcely found, studying the production process and the antibiotic separation is essential to provide technology to the production section. The present study aimed to develop alternative protocols to isolate and purify composites produced by Streptomyces clavuligerus DSM 738, such as the cephamycin C and penicillin, which present antibacterial activity. The sequence of purification stages proposed in this work consisted of: 1) Microfiltration of the broth for the separating cells and insoluble solids; 2) Ultrafiltration for the separation of high molecular weight sub products, such as proteins and enzymes; 3) Use of adsorption process with non ionic resin for the broth clarification; and 4) Finally, the hipotese this work, the adsorption process by ionic exchange, for the separation of composites with antibacterial activity, such as cephamycin C and Penicillin N. On the other hand, cephamycin C is not available in the market, being restricted to the industries that possess the production technology. The biological method of choice for the bacteriological activity test was the Escherichia coli ESS bacteria against all β-lactams. RMN-1H analysis showed that the use of the microfiltration and ultrafiltration are essential as first purification stages. The second purification stage with non ionic resin (Amberlite XAD-4) showed to be efficient on retaining pigments, finally, with this clarified broth, it was possible to separate two major and well defined fractions with antibacterial activity, by the use of an anion exchange resin (QXL of Amershan), utilizing NaCl and CH3COONa as mobile phase. Analysis by RMN-1H showed that the first fraction can represent a cephalosporin molecule, such as cephamycin C, among others compounds. / A cefamicina C é uma cefalosporina natural produzida por Streptomyces clavuligerus de grande importância na indústria farmacêutica, esta é um antibiótico beta-lactâmico que atua como um inibidor da síntese da parede celular. Além de possuir atividade contra bactérias Gram-negativas, a cefamicina C é resistente à ação de enzimas beta-lactamases responsáveis pela resistência à ação das penicilinas. Tendo em vista as restritas informações na literatura sobre as etapas do processo industrial de produção da cefamicina C, torna-se indispensável o estudo dos processos de produção e separação deste antibiótico para que seja possível disponibilizar sua tecnologia ao setor produtivo. O presente trabalho buscou desenvolver protocolos alternativos para isolar e purificar compostos que apresentam atividade antibacteriana produzidos por Streptomyces clavuligerus DSM 738 como a cefamicina C e penicilinas. A seqüência de etapas de purificação utilizadas nesta dissertação constou de: 1) Microfiltração do caldo para a separação de células e sólidos insolúveis; 2) Ultrafiltração para a separação de subprodutos de alto peso molecular, como proteínas e enzimas; 3) Utilização de processo de adsorção com resina não iônica para clarificação do caldo e finalmente a hipótese de trabalho desta dissertação foi de aplicar um processo de adsorção por troca iônica para a separação de compostos com atividade antibacteriana, os quais podem ser a Cefamicina C e a Penicilina N. Cabe ressaltar que a cefamicina C não está disponível no mercado, sendo restrita às indústrias que detém a tecnologia de produção. Se utilizou o metodo biologico teste de atividade bacteriológica com a bactéria Escherichia coli ESS comtra beta-lactâmicos totais. Analises realizada por RMN mostram que a utilização da microfiltração e ultrafiltração são fundamentais como etapas iniciais de purificação. A segunda etapa de purificação com resina não iônica (Amberlite XAD-4) mostrou sua eficiência na retenção de pigmentos, e por fim, com este caldo clarificado, foi possível separar duas frações majoritárias e bem definidas com atividade antibacteriana, através da utilização da resina de troca aniônica (QXL da Amershan), utilizando como eluentes NaCl e CH3COONa. As análises realizadas por RMN- 1H mostraram que a primeira fração pode representar a molécula de uma cefalosporina, tal como é a cefamicina C, dentre outros compostos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2994.pdf: 558156 bytes, checksum: e1e70a4f064f373ef5d3879f5a261ad8 (MD5) Previous issue date: 2010-03-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / The production of enzymes β-lactamases by pathogenic bacteria is the most common mechanism of resistance to β-lactam antibiotics. The β-lactamases catalyze the hydrolysis of β-lactam ring, splitting the amide bond, as a result, the antibiotics become ineffective. Clavulanic acid (CA) is a secondary metabolite β-lactam produced during the fermentation of Streptomyces clavuligerus and has a potent inhibitory activity of β-lactamases. Like other β-lactam compounds, CA is chemically unstable under high temperature conditions. The decomposition of the AC during the bacterial fermentation reduces its concentration in the broth which results in low yields of the process. In this study the production of CA was evaluated in batch processes and batch with glycerol pulses at different temperature conditions in shaker operated at 250 rpm and pH 6.8. Initially, three batch cultures containing glycerol as carbon source were performed at temperatures of 30, 25 and 20ºC. Batch cultivation at 30°C was considered as a control run. Then, other three batch tests were performed with reduction of temperature of 30°C for 25 or 20°C after the exhaustion of glycerol in the broth culture. Added, also were performed four cultures with reduction of temperature associated with feeding of glycerol (1, 2, 3 and 4 pulses of glycerol), resulting in twelve cultures. In general, the production of CA increased with decreasing temperature and feeding of glycerol was beneficial for CA production. For all experiments under low temperatures, the maximum production (CCA-max) and productivity in CC (PCA-max in mg.L-1.h-1) were higher than the control run. In addition, a significant increase product (CA) yield coefficient in relation to the glycerol consumption (YCA/G, mg.g-1) reaching 59.3 mg.g-1 for the batch culture at 20°C, while for the control run was obtained 10.2 mg.g-1. The CCA-max obtained was 1115.6 mg L-1 in cultivation with temperature reduction from 30 to 25°C and three pulses of glycerol, which represented about 7 times the yield on the run control culture at 30°C. The CA degradation in fermentation broth at temperatures of 30, 25 and 20ºC was also evaluated in this study. Values of constant degradation of CA (kdCA) were obtained in different cultivation times. The highest kdCA value in the broth was obtained at 30°C, 0.01306 h-1, and values for 25 and 20ºC were statistically similar, 0.00303 and 0.00173 h-1. The higher rate of production of CA (rCA) of 10.9 mg.L-1.h-1 was observed at 25°C. The results obtained demonstrate the potential application of temperature manipulation during S. clavuligerus fermentation for the optimization of CA production process. / A produção de enzimas β-lactamases por bactérias patogênicas é o mecanismo de resistência mais comum aos antibióticos β-lactâmicos. As β-lactamases catalisam a hidrólise do anel β-lactâmico, rompendo a ligação amida o que leva à perda da atividade antimicrobiana do antibiótico. O ácido clavulânico (AC) é um metabólito secundário β- lactâmico produzido durante a fermentação de Streptomyces clavuligerus e possui uma potente atividade inibitória de β-lactamases. Como outros compostos β-lactâmicos, AC é quimicamente instável sob condições elevadas temperaturas. A decomposição do AC durante a fermentação bacteriana reduz sua concentração no caldo o que se traduz em baixos rendimentos do processo. No presente trabalho foi avaliada a produção de AC em processos em batelada e batelada com pulsos de glicerol em diferentes condições de temperatura em mesa incubadora rotativa operados a 250 rpm e pH 6,8. Inicialmente, três cultivos em batelada, contendo glicerol como fonte de carbono, foram conduzidos em temperaturas de 30, 25 e 20ºC, onde a 30ºC foi considerado ensaio controle. Em seguida, outros três ensaios em batelada foram realizados com redução de temperatura de 30ºC para 25 ou 20ºC após a exaustão de glicerol no caldo de cultivo. Também foram realizados quatro cultivos com redução de temperatura associado com alimentação de glicerol (1, 2, 3 e 4 pulsos de glicerol), totalizando doze cultivos. Em geral, a produção de AC aumentou com o decréscimo de temperatura e a alimentação de glicerol foi benéfica para a produção. Para todos os cultivos em quaisquer condições de baixas temperaturas, a produção máxima de AC e produtividades em AC (PAC-máx em mg.L-1.h-1) observadas foram superiores àquelas obtidas no cultivo controle. Além disso, houve um aumento significativo do rendimento AC por glicerol (YAC/G, mg.g-1) chegando a 59,3 mg.g-1 no cultivo em batelada a 20ºC, enquanto que para o controle foi observado um rendimento de 10,2 mg.g-1. A concentração máxima de AC obtida foi de 1115,6 mg.L-1 para o cultivo com redução de temperatura de 30 para 25ºC e três pulsos de glicerol o que representou cerca de 7 vezes a produção obtida no cultivo controle em batelada a 30ºC. A degradação de AC em caldo de fermentação nas temperaturas de 30, 25 e 20ºC também foi avaliada neste estudo. Valores de constantes de degradação de AC relativas ao modelo de degradação de primeira ordem (kdAC) foram obtidos em diferentes tempos de cultivo. O maior valor de kdAC foi encontrado a 30ºC (0,01306 h-1) e os valores para 25 e 20ºC foram estatisticamente semelhantes (0,00303 e 0,00173 h-1). A maior velocidade de produção de AC (rAC) de 10,9 mg.L-1.h-1 foi observada a 25ºC.Estes resultados demonstram o potencial de aplicação da manipulação da temperatura durante a fermentação de S. clavuligerus para a otimização do processo de produção de AC.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissGMCS.pdf: 2717580 bytes, checksum: ff4f01b1bf27d70757eb37ee1960edef (MD5) Previous issue date: 2004-06-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / Disintegrins are proteins present in the poison of serpents that have been calling the pharmaceutical industry attention due to their capacity to prevent the progression of cancerous cells. A receiving key-protein called integrin addresses the formation of new blood vessels instructing the tumor cells to increase and spread. The disintegrin acts as an inhibitor that blocks this interaction. In order to produce substantial amounts of disintegrin in industrial scale, its expression in CHO-K1 cells was carried out by cloning the characteristic DNA extracted from the poison producing glands of the serpent Agkistrodon contortrix laticinctus. Usually CHO-K1 cells are cultivated in medium containing bovine fetal serum. However, its presence in the cultivation medium hinders the stages of detection, extraction and purification of the protein of interest. The objective of this work was to study the CHOZMD cell growth and the desintegrin production in serum free medium, as well as to develope a methodology for the detection and quantification of the disintegrin present in the medium. The cultivations were carried in culture bottles of 25cm2, 75cm2 and 150cm2 and later in spinner flask with a volume of 500mL, incubated with an amount of CO2 controlled in 10% v/v, pH between 7.0 to 7.4, a temperature of 37 °C, under agitation conditions. The cells were cultivated in the presence of the microcarrrier Pronectin F which enables the attainment of high cell concentration. The culture media DMEM and CHO-S-SFM II were used in the cultivations by means of a gradual adaptation process for a serum free medium, through the reduction of DMEM+serum proportion at each change, until that it was totally replaced by the serum free medium. The cells were maintained in 100% serum free medium during 6h with the withdrawal of 250 ml after 3 h and of the remaining volume after 6h of cultivation. For the detection of the disintegrin, the samples were initially filtered in Milipore filter, then concentrated in ultra filter Amicon and finally centrifuged in membranes Centriprep and Centricon. The disintegrin, protein of ~70kDa, present in the treated samples was detected using Bio Dot equipment with nitrocelulose membrane incubated with specific antibodies. The samples were applied in ion exchange column and the fractions obtained applied in nitrocelulose membrane. In the cultivations carried out in serum free medium with the microcarrier Pronectin F a maximum cell concentration of 1.74.106 cel.ml-1 was reached, which is slightly inferior to the value reached in the cultivations in medium containing serum (2.7.106 cel.mL-1). However, concerning product formation, the immunodetecion results revealed the presence of the disintegrin in the cultivations carried out with serum free medium. Cultivations carried out in spinner flask, with a volume of 200mL and using microcarrier Citodex 1 and medium supplemented with 1% hemolymph (v/v) presented maximum cell concentration of 2.6.106 cel.mL-1. The detection method developed was effective in the identification of the target protein in the samples from the cultivation medium containing hemolymph. Preliminary tests demonstrated loss of protein might be related to gradual degradation in cultivation medium or retention in ion exchange column. / Desintegrinas são proteínas presentes no veneno de serpentes que têm despertado interesse da indústria farmacêutica por sua capacidade de impedir a progressão de células cancerígenas. Uma proteína-chave receptora chamada integrina direciona a formação de novos vasos sangüíneos instruindo as células do tumor a crescerem e se espalharem. A desintegrina atua como um inibidor que bloqueia essa interação. Para que quantidades substanciais de desintegrina possam ser produzidas em escala industrial, realizou-se a expressão da mesma em células CHO-K1, produzidas por clonagem do ADN característico retirado das glândulas produtoras do veneno da serpente Agkistrodon contortrix laticinctus. Normalmente as células CHO-K1 são cultivadas em meio contendo soro fetal bovino. No entanto, a presença do mesmo no meio de cultivo dificulta as etapas de detecção, extração e purificação da proteína de interesse. O objetivo deste trabalho foi estudar o crescimento de células CHO-K1 e a produção da desintegrina em meio livre de soro, assim como desenvolver uma metodologia para a detecção e quantificação da desintegrina presente no meio. Os cultivos foram realizados em garrafas de cultura de 25cm2, 75cm2 e 150cm2 e posteriormente em frasco spinner com um volume de 500mL, incubados em estufa com uma quantidade de CO2 controlada em 10% v/v, pH entre 7,0 a 7,4, a uma temperatura de 37 °C em condições de agitação brandas. As células foram cultivadas na presença do microcarrregador sólido Pronectin F, que possibilita a obtenção de uma alta concentração de células. Os meios de cultura DMEM e CHO-S-SFM II foram utilizados nos cultivos por um processo de adaptação gradual para um meio livre de soro, reduzindo-se a proporção de meio com soro a cada troca, até que fosse totalmente substituído para o meio livre de soro. As células foram mantidas em meio 100% livre de soro durante 6 h com a retirada de 250 ml após 3 h e o restante após 6 h de cultivo. Para a detecção da desintegrina, as amostras foram primeiramente filtradas em filtro Millipore e o filtrado concentrado em ultrafiltro Amicon e centrifugadas em membranas Centriprep e Centricon. A desintegrina, proteína de ~70KDa presente nas amostras tratadas, foi detectada utilizando-se equipamento Bio Dot em membrana de nitrocelulose incubada com anticorpos específicos. As amostras foram aplicadas em coluna de troca iônica e as frações obtidas aplicadas em membrana de nitrocelulose. Nos cultivos realizados em meio livre de soro com o microcarregador Pronectin F foi atingida uma concentração celular máxima de 1,74.106 cel.ml-1, a qual é ligeiramente inferior ao valor alcançado nos cultivos em meio contendo soro (2,7.106 cel.mL-1). Entretanto no que se refere à formação do produto o resultado na membrana de nitrocelulose evidencia a presença da desintegrina no meio de cultivo livre de soro. Cultivos realizados em meio suplementado com 1% v/v de hemolinfa apresentaram concentração celular máxima de 2,6. 106 cel.mL-1 em frasco Spinner, com um volume de 200mL e utilizando microcarregador Citodex 1. O método de detecção desenvolvido foi efetivo na identificação da proteína de interesse nas amostras retiradas do cultivo em meio contendo hemolinfa. Testes preliminares demonstraram que a proteína pode estar degradando gradativamente em meio de cultivo ou ficando retida na coluna de troca iônica.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3733.pdf: 1383162 bytes, checksum: e1c286f4bef0637b79f5464cfaacaf2e (MD5) Previous issue date: 2011-07-29 / Universidade Federal de Sao Carlos / In Brazil, sugarcane bagasse stands out as an abundant and available source of lignocellulosic material in sugar mills. It has structural features that make it a possible inducer for cellulase production by microorganisms. Since sugarcane bagasse is a promising material both as an inducer of cellulases and as a feedstock for second generation ethanol, the development of innovative fermentation processes for the production of cellulases in industrial scale is necessary in order increase the viability of the enzymatic hydrolysis of this material. In this way, the purpose of this study was the development of an unconventional process for cellulase production using an Aspergillus niger strain. The process has the purpose of sugarcane bagasse utilisation as substrate for the production of an inoculum with first step of preparation in solid-state fermentation (SSF), besides its use as an inducer for the synthesis of cellulases by submerged fermentation (SF) in the presence of solids, operating in triphasic systems. With this aim, the effect of carbon source used, glucose (10 g.L-1 and 20 g.L-1) and lactose (10 g.L-1) and the type of inoculum preparation (conventional or inoculum first step in SSF) were evaluated in shaken flasks cultures. The best production of endoglucanase (CMCase) obtained in shaken flasks was 1052 ± 34 IU L-1, after 72 h in cultures and prepared with the inoculum with solid state fermentation as first step with solid medium supplemented with 10 g.L-1 of glucose. These results were validated in a pneumatic bioreactor of 5.0 L at different pH values (5.0 and 6.0). The best results obtained in terms of volumetric productivity were 57±13 U.L-1.h-1 of endoglucanase, 327±17 UL-1.h-1 of xylanase and 10±1 UL-1.h-1 of filter paper activity (Fpase) in cultures with pH 5.0 and unconventional inoculum. It can be stated that the production of cellulases in the presence of sugarcane bagasse with large particle size (1 to 2 mm) is a viable and promissing alternative. The unconventional inoculum proposed as the object of study, with first step in SSF, was superior to conventional inoculum, since when applied to fermentation systems resulted in 3-fold superior enzymatic productivity of CMCase. It can be stated either that studies with pH values that favor cellulases syntesis instead of proteases can increase significantly the volumetric productivity. / No Brasil, o bagaço de cana-de-açúcar se destaca como sendo uma fonte de material lignocelulósico abundante e disponível nas usinas sucroalcooleiras, além de possuir características estruturais que o classificam como bom indutor para produção de celulases por microrganismos. Sendo o bagaço de cana um material promissor tanto como indutor das celulases quanto como substrato na cadeia de produção do etanol de 2a geração, o desenvolvimento de processos de fermentação inovadores para a produção de celulases em escala industrial é necessário a fim de viabilizar a hidrólise enzimática deste material. Para esta finalidade, a proposta deste trabalho foi o desenvolvimento de um processo não-convencional para produção de celulases utilizando uma cepa de Aspergillus niger. O processo consistiu na proposta de utilização do bagaço de cana como substrato para a produção de um inóculo com etapa inicial em fermentação no estado sólido (FES), além de sua utilização como indutor para a síntese de celulases por fermentação submersa (FS) na presença de sólidos, operando-se sistemas trifásicos. Para tal, avaliou-se em cultivos em frascos agitados o efeito da fonte de carbono utilizada, glicose (10 g.L-1 e 20 g.L-1) e lactose (10 g.L-1), e o tipo de preparo de inóculo (convencional ou inóculo com etapa inicial em FES). A maior produção de endoglucanase (CMCase) obtida em frascos agitados foi de 1052±34 U.L-1, obtida após 72 h nos cultivos preparados com o inóculo com fase inicial no estado sólido e em meios suplementados com 10 g.L-1 de glicose. Tais resultados foram validados em biorreator pneumático de 5,0 L, em diferentes valores de pH (5,0 e 6,0). Os melhores resultados de produtividades obtidos foram de 57±13 U.L-1.h-1 de endoglucanase, 327±17 U.L-1.h-1 de xilanase e 10±1 U.L-1.h-1 de celulases totais (FPase) em cultivos com pH 5,0 e inóculo nãoconvencional. Pode-se afirmar que a produção de celulases na presença de bagaço de cana de alta granulometria (1 a 2 mm) em biorreator pneumático do tipo coluna de bolhas é uma alternativa viável e promissora e que o inóculo não-convencional proposto como objeto de estudo, com etapa inicial em FES, foi superior ao inóculo convencional, uma vez que quando aplicado em sistemas fermentativos resultou na obtenção de produtividade enzimática de endoglucanase cerca de 3 vezes superior. Pode-se afirmar ainda que valores de pH que favoreçam a síntese de celulases em vez de proteases podem resultar em ganhos significativos de produtividade volumétrica.

Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-09T16:06:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bastos_ReinaldoGaspar_D.pdf: 5701398 bytes, checksum: ea21a329b956587a06c56820ffbe5b4e (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O cultivo em estado sólido tem merecido expressiva atenção nos últimos anos pelas vantagens oferecidas principalmente nos processos que envolvem fungos filamentosos. Entretanto, o interesse pelos fenômenos de transferência de massa e pelo desempenho de biorreatores é objeto de estudos mais recentes, motivado pelo escalonamento dos processos. Nesse contexto, o presente trabalho tem como objetivo estudar a transferência de oxigênio no processo de produção de proteínas alergênicas obtidas da biomassa de Drechslera (Helminthosporium) monoceras por cultivo em estado sólido em colunas de leito fixo com farelo de trigo e espuma de poliuretano. Os resultados indicam que vazões de ar da ordem de 1L/min e 30mm de altura de leito de partículas mantêm a umidade inicial do meio sólido praticamente constante para farelo de trigo. Essas condições asseguram os melhores valores de KLas, além de minimizar a compactação do leito, permitir o crescimento na fase aérea e assegurar a ausência de água livre durante o processo. O cultivo em espuma de poliuretano apresenta produção de proteínas superior aos ensaios com farelo de trigo devido à manutenção das propriedades físicas da matriz sólida inerte. Foram identificadas proteínas na faixa de 15 a 139kDa para ensaios em farelo de trigo e 11 a 244kDa sobre espuma de poliuretano, sendo que as frações indicadas como mais alergênicas 14,4, 36 e 60kDa foram encontradas para os dois tipos de suportes. Estes resultados mostram que condições selecionadas de vazão de ar, altura de leito e suporte sólido preservam a ausência de água livre no cultivo em estado sólido, aumentando a produção das proteínas alergênicas e facilitando o controle do processo / Abstract: In recent years, a resurgence of interest in solid-state cultivation has been observed due to its numerous advantages, mainly concerning the growth of filamentous fungi. However, studies on the oxygen transfer and performance of bioreactors are still scarce. The main difficulties faced by process scale-up are the control of parameters and limiting oxygen transfer. The aim of thisresearch was to study the oxygen transfer for the production of allergenic proteins from the biomass of Drechslera (Helminthosporium) monoceras cultured on wheat bran and polyurethane foam. Results indicated that flow rates about 1L/min and 30mm of bed height lead to the best values of overall oxygen transfer coefficient (KLa) on wheat bran, showing no substrate bed packing and formation of aerial hyphae, maintaining the characteristics of solid state cultivation. Evaluation of polyurethane foam showed high protein production, without changing the physical properties of support. SDS-Page assays identified proteins from crude extract in an approximate range of 15 to 139kDa and 11to 244kDa for polyurethane foam and for wheat bran, respectively. The pool of proteins obtained includes the molecular masses, identified in previous works, as the most allergenic fractions (14,4, 36 and 60kDa) These results show that selected conditions of air-flow rate, bed height and solid support preserve the absence of free water in solid state cultivation, increasing the production of allergenic proteins and facilitating the control of the process / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientadores : Everson Alves Miranda, Zivko L. Nikolov / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-01T15:51:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Azzoni_AdrianoRodrigues_D.pdf: 7397163 bytes, checksum: 205f126ad771bb30d977324c656157fe (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A expressão em plantas transgênicas é potencialmente uma das formas mais econômicas de produção em larga escala de peptídeos e proteínas de emprego farmacêutico. Dentre as vantagens estão a capacidade de estocagem da biomolécula por longo período em sementes, o baixo custo de produção e escalonamento (basta aumentar a área plantada) e o pequeno risco de contaminação por agentes patogênicos aos humanos. Contudo, existem poucos trabalhos visando a avaliar o potencial das plantas transgênicas do ponto de vista da recuperação e purificação de biomoléculas (RPB) em larga escala. Neste trabalho foi estudada a recuperação e purificação de aprotinina recombinante, um inibidor de proteases utilizado como fármaco, produzida em sementes de milho transgênico. Mais do que desenvolver metodologias de purificação de uma proteína específica, este trabalho objetivou contribuir com novos conhecimentos sobre a utilização da planta de milho como biorreator. Condições de extração visando a maximização da eficiência de extração da aprotinina recombinante e minimização da extração de impurezas foram estudas. Destes estudos, a condição de extração a pH 3,0 e força iônica de 200 mM foi a que se mostrou mais adequada. A aprotinina recombinante, juntamente com um inibidor de tripsina naturalmente encontrado em sementes de milho (inibidor de tripsina do milho - ITM) foi capturada do extrato aquoso da semente através do uso de cromatografia em resina de agarose com tripsina imobilizada. Duas diferentes rotas cromatográficas foram empregadas para a separação entre os inibidores e purificação final da aprotinina: cromatografia em resina agarose-IDA-Cu2+ e cromatografia em resina SP Sepharose. A confirmação da purificação da aprotinina recombinante foi realizada através de seqüenciamento N-terminal, SDS-PAGE e HPLC, sendo que este último método de análise indicou que purezas tão elevadas quanto 97% foram alcançadas. Uma vez que o ITM também foi purificado, o processo aqui estudado tem como vantagem a possibilidade de sua co-produção. Finalmente, os resultados deste trabalho vem corroborar com pesquisas anteriores que indicam o potencial do uso de plantas como biorreatores / Abstract: Expression in transgenic plants is potentially one of the most economical systems for large-scale production of valuable peptide and protein products. Advantages of the use of plants as bioreactors include the low cost of growing a large amount of biomass, easy scale-up (increase of plant acreage), natural storage organs (seeds and tubers), and the reduced risk on propagating human or animal pathogens. However, the downstream processing of recombinant proteins produced in plants has not been extensively studied. In this work, we studied the extraction and purification of recombinant aprotinin, a protease inhibitor used as a therapeutic compound, produced in transgenic com seed. More than just studing the recovery and purification of a recombinant protein, the aim of this work was to add new information about the use of transgenic com as bioreactor. Conditions for extraction from transgenic com meal that maximize aprotinin concentration and its fraction of the total soluble protein in the extract were determined as pH 3.0 and 200 mM NaCI. Aprotinin in this extract, together with a native com trypsin inhibitor (CTI) was captured using a trypsin-agarose column. These two inhibitors were separated by using two different approaches: immobilized metal ion affinity chromatography IMAC (agarose-IDA-Cu2+ resin) and cation-exchange chromatography (SP Sepharose resin). The high purity of the recombinant aprotinin was verified by SDSPAGE and N-terminal sequencing. Reverse phase HPLC analysis of the recombinant aprotinin purified by IMAC suggested a purity as greater as 97%. Since CTI was also purified, the recovery and purification process studied has the advantage of possible CTI coproduction. Finally, the work presented here introduces additional information on the recovery and purification of recombinant proteins produced in plants and corroborates with past research on the potential use of plants as bioreactors / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Utilizou-se um meio de cultivo a base de farinha de mandioca, suplementado com nutrientes, em fermentador agitado (700 rpm) e aerado (10 litros de ar/min), com volume de reação de 10 litros praticamente constante, fração de inóculo de 10% em volume, ph 4,0 e temperatura de 35ºC. Foram realizados ensaios com concentração total de açúcares de 20 g/l e 40 g/l, tanto descontínuos como descontínuos alimentados. Nestes variou-se a vazão mássica de alimentação (fs), o instante de início de alimentação e a condição do xarope de farinha (previamente hidrolisado ou não). Repetições dos ensaios descontínuos indicaram variabilidade de resultados elevada. Não se observou expressivas mudanças no crescimento microbiano, a não ser pelo aumento na velocidade específica nos ensaios descontínuos alimentados a 20 g/l. A síntese de glicoamilase foi sensivelmente aumentada nos ensaios descontínuos alimentados a 20 g/l (produtividade dobrada). A 40 g/l, obteve-se produtividade 26% superior. Os melhores resultados foram obtidos com fs=17,1 gart/h a so=20 g/l e fs=32,2 gart/h a 40 g/l, e obteve-se o pior no ensaio em que se alimentou desde o início de cultivo. A so=20 g/l a repressão se apresenta como principal mecanismo de controle de síntese de glicoamilase, não ocorrendo a mesma a 40 g/l, ensaios nos quais a indução tornou-se muito relevante. / In order to study different processes and the influence of control mechanism on glucoamylase synthesis, several batch and fed-batch runs were made with Aspergillus awamori NRRL 3112. A medium containing cassava flour and nutrients were used in a 10 liters stirred and aerated tank, at pH 4,0 and temperature 35 °C. The batch and fed-batch runs used 20 and 40 g of total reducing sugars (TRS) per liter. In the fed-batch runs, the carbon source feed rate (fs), the feeding start time, and whether the syrup were pre-hydrolyzed or not were varied. Repeated batch runs showed significant variability. Notable changes in cell growth were not observed, unless by the increase of the specific growth rate in the 20 gTRS/l fed-batch runs. The enzyme productivity doubled in the lower sugar concentration fed-batch runs, but increased just 26% in the runs with 40g/l of TRS. The best results were achieved at 20g/l with carbon source feed rate=17,1 gTRS/h and fs=32,2 gTRS/h at 40g/l. The worst noted when the feeding started at the beginning of the run. At 20 gTRS/l, repression showed as the main mechanism control in order to synthesize glucoamylase. On the other hand induction became the relevant factor when 40gTRS/l were offered to microorganism.