Lesões medulares resultam em uma perda irreversível da função abaixo do sítio da lesão. Esses comprometimentos são permanentes e ocorrem devido à perda de neurônios localmente e também dos tratos axonais ascendentes e descendentes da medula espinal. Na tentativa de criar um ambiente favorável à regeneração dos axônios lesionados, células da glia embainhante olfatória (GEO) vêm sendo transplantadas como estratégia de tratamento em animais submetidos a diferentes modelos experimentais de lesões medulares. Entretanto, um consenso sobre o potencial terapêutico desse tipo de transplante celular ainda precisa ser estabelecido. O objetivo do presente trabalho foi verificar a eficácia do transplante de lâmina própria (LP) olfatória (que possui células da GEO) e de LP respiratória (desprovido de células da GEO), quando implantadas imediatamente, 2 ou 4 semanas após a realização da transecção da medula espinal. Doze semanas após a realização dos implantes, os animais que receberam LP olfatória e respiratória apresentaram uma melhora sutil na função motora dos membros posteriores. Além disso, o transplante de LP olfatória quando realizado imediatamente após a lesão reduziu a hiperatividade do reflexo de retirada, enquanto o implante desse tipo de tecido 4 semanas pós-lesão produziu uma discreta depressão dependente de frequência do reflexo de Hoffman (um análogo elétrico do reflexo monossináptico de estiramento). Nas diferentes janelas terapêuticas utilizadas, o transplante de ambos os tipos de LP produziu resultados comparáveis em relação à preservação do tecido medular, brotamento de neuritos e regeneração de fibras mielínicas no local da lesão, indicando que o tempo decorrido antes da realização dos transplantes não parece limitar os efeitos regenerativos. Todavia, as fibras mielínicas observadas no sítio da transecção nos animais que receberam LP olfatória 2 e 4 semanas pós-lesão possuíam menor área, diâmetro e espessura da bainha de mielina quando comparados aos animais que receberam LP respiratória nesses mesmos períodos. O transplante imediato de LP olfatória e respiratória também favoreceu o restabelecimento das conexões entre as fibras axonais lesionadas com núcleos do tronco encefálico e até mesmo com a região do córtex somatossensorial, como indicado pela presença de neurônios nessas regiões marcados positivamente com um marcador axonal retrógrado. Um número maior de fibras positivas para 5-HT foi observado no coto proximal dos grupos transplantados com ambos os tipos de LP em comparação às regiões da lesão e do coto caudal. Fibras positivas para CGRP estavam presentes em número considerável no local da lesão. A recuperação locomotora e a regeneração axonal no local da lesão foram limitadas e comparáveis entre os grupos transplantados nos diferentes tempos com LP olfatória e respiratória, sugerindo que esses resultados não estão exclusivamente relacionados à presença de células da GEO nos enxertos utilizados. Um melhor entendimento sobre o potencial restaurativo desse tipo de transplante é necessário a fim de justificar a aplicação dessa terapia em humanos. / Spinal cord injury (SCI) results in an irreversible loss of function below the injury site. These permanent disabilities occur due to local neuronal death and loss of ascending and descending axons in the spinal cord. In attempt to create a favorable environment for the re-growth of injured axons, olfactory ensheathing cells (OECs) have been transplanted as a treatment strategy in animals submitted to different experimental models of SCI. However, a consensus on the efficacy of this cellular transplantation has yet to be reached. The main focus of the present study was explore the efficacy of olfactory lamina propria (OLP, graft containing OECs) or respiratory lamina propria (RLP, graft without OECs) when transplanted immediately, 2-week or 4-week after spinal cord transection. After 12 weeks of transplantation, animals with OLP and RLP grafts showed a subtle hindlimb motor improvement. Furthermore, the transplantation of OLP when performed immediately after injury reduced the withdrawal reflex over-responsiveness, while the implantation of this tissue 4 weeks post-injury produced a discrete frequency-dependent habituation of the Hoffman reflex (the electrical analogue of the classic tendon jerk reflex). In all therapeutic windows used, both lamina propria grafts produced comparable results for tissue sparing, fibers sprouting and re-growth of myelinated fibers at the lesion site, indicating that delayed transplantation approach does not seem to limit the regenerative effects. However, the myelinated fibers observed at the transection site of animals that received OLP 2 or 4 weeks after injury had a smaller myelinated fiber area, diameter and myelin sheath thickness when compared to those animals transplanted with RLP grafts in the same periods. The immediate transplantation of OLP and RLP also foster limited supraspinal axonal re-connection as shown by the presence of neurons stained by retrograde tracing in brainstem nuclei and in the somatosensory cortex. A larger number of 5-HT positive axons were found in the cranial stump of both lamina propria groups compared to the lesion and caudal regions. CGRP positive axons were present in considerable numbers at the SCI site. The locomotor recovery and axon reparative effects were limited and similar between groups transplanted at different times with OLP and RLP, suggesting that these results could not be exclusively related to OECs. In conclusion, a greater understanding of the restorative potential of these tissue grafts is necessary to strengthen the rationale for application of this treatment in humans.

Lesões medulares resultam em uma perda irreversível da função abaixo do sítio da lesão. Esses comprometimentos são permanentes e ocorrem devido à perda de neurônios localmente e também dos tratos axonais ascendentes e descendentes da medula espinal. Na tentativa de criar um ambiente favorável à regeneração dos axônios lesionados, células da glia embainhante olfatória (GEO) vêm sendo transplantadas como estratégia de tratamento em animais submetidos a diferentes modelos experimentais de lesões medulares. Entretanto, um consenso sobre o potencial terapêutico desse tipo de transplante celular ainda precisa ser estabelecido. O objetivo do presente trabalho foi verificar a eficácia do transplante de lâmina própria (LP) olfatória (que possui células da GEO) e de LP respiratória (desprovido de células da GEO), quando implantadas imediatamente, 2 ou 4 semanas após a realização da transecção da medula espinal. Doze semanas após a realização dos implantes, os animais que receberam LP olfatória e respiratória apresentaram uma melhora sutil na função motora dos membros posteriores. Além disso, o transplante de LP olfatória quando realizado imediatamente após a lesão reduziu a hiperatividade do reflexo de retirada, enquanto o implante desse tipo de tecido 4 semanas pós-lesão produziu uma discreta depressão dependente de frequência do reflexo de Hoffman (um análogo elétrico do reflexo monossináptico de estiramento). Nas diferentes janelas terapêuticas utilizadas, o transplante de ambos os tipos de LP produziu resultados comparáveis em relação à preservação do tecido medular, brotamento de neuritos e regeneração de fibras mielínicas no local da lesão, indicando que o tempo decorrido antes da realização dos transplantes não parece limitar os efeitos regenerativos. Todavia, as fibras mielínicas observadas no sítio da transecção nos animais que receberam LP olfatória 2 e 4 semanas pós-lesão possuíam menor área, diâmetro e espessura da bainha de mielina quando comparados aos animais que receberam LP respiratória nesses mesmos períodos. O transplante imediato de LP olfatória e respiratória também favoreceu o restabelecimento das conexões entre as fibras axonais lesionadas com núcleos do tronco encefálico e até mesmo com a região do córtex somatossensorial, como indicado pela presença de neurônios nessas regiões marcados positivamente com um marcador axonal retrógrado. Um número maior de fibras positivas para 5-HT foi observado no coto proximal dos grupos transplantados com ambos os tipos de LP em comparação às regiões da lesão e do coto caudal. Fibras positivas para CGRP estavam presentes em número considerável no local da lesão. A recuperação locomotora e a regeneração axonal no local da lesão foram limitadas e comparáveis entre os grupos transplantados nos diferentes tempos com LP olfatória e respiratória, sugerindo que esses resultados não estão exclusivamente relacionados à presença de células da GEO nos enxertos utilizados. Um melhor entendimento sobre o potencial restaurativo desse tipo de transplante é necessário a fim de justificar a aplicação dessa terapia em humanos. / Spinal cord injury (SCI) results in an irreversible loss of function below the injury site. These permanent disabilities occur due to local neuronal death and loss of ascending and descending axons in the spinal cord. In attempt to create a favorable environment for the re-growth of injured axons, olfactory ensheathing cells (OECs) have been transplanted as a treatment strategy in animals submitted to different experimental models of SCI. However, a consensus on the efficacy of this cellular transplantation has yet to be reached. The main focus of the present study was explore the efficacy of olfactory lamina propria (OLP, graft containing OECs) or respiratory lamina propria (RLP, graft without OECs) when transplanted immediately, 2-week or 4-week after spinal cord transection. After 12 weeks of transplantation, animals with OLP and RLP grafts showed a subtle hindlimb motor improvement. Furthermore, the transplantation of OLP when performed immediately after injury reduced the withdrawal reflex over-responsiveness, while the implantation of this tissue 4 weeks post-injury produced a discrete frequency-dependent habituation of the Hoffman reflex (the electrical analogue of the classic tendon jerk reflex). In all therapeutic windows used, both lamina propria grafts produced comparable results for tissue sparing, fibers sprouting and re-growth of myelinated fibers at the lesion site, indicating that delayed transplantation approach does not seem to limit the regenerative effects. However, the myelinated fibers observed at the transection site of animals that received OLP 2 or 4 weeks after injury had a smaller myelinated fiber area, diameter and myelin sheath thickness when compared to those animals transplanted with RLP grafts in the same periods. The immediate transplantation of OLP and RLP also foster limited supraspinal axonal re-connection as shown by the presence of neurons stained by retrograde tracing in brainstem nuclei and in the somatosensory cortex. A larger number of 5-HT positive axons were found in the cranial stump of both lamina propria groups compared to the lesion and caudal regions. CGRP positive axons were present in considerable numbers at the SCI site. The locomotor recovery and axon reparative effects were limited and similar between groups transplanted at different times with OLP and RLP, suggesting that these results could not be exclusively related to OECs. In conclusion, a greater understanding of the restorative potential of these tissue grafts is necessary to strengthen the rationale for application of this treatment in humans.

Les métalloproteases matricielles (MMPs) appartiennent à une famille d'endopéptidases dépendantes du zinc, présentent sous forme secrétée ou membranaire (MT-MMP) et qui jouent un rôle fondamental dans la signalisation cellulaire. L'activité des MMPs est régulée par leur inhibiteurs endogènes, les inhibiteurs tissulaires des MMPs (TIMPs). Le système MMP/TIMP régule les interactions cellule-cellule et cellule-matrice extra cellulaire et module la motilité cellulaire par clivage protéolytique des composants de la matrice extra cellulaire aussi bien lors de processus physiologiques que dans des situations pathologiques.Dans un premier temps, nous avons mis en évidence le rôle de TIMP-1 dans la modulation de la croissance neuritique et la morphologie neuronale, via l'inhibition de MMP-2 et non de MMP-9. souches de la muqueuse olfactive (OE-MSCs). Nous montrons dans cette étude que les gélatinases MMP-2 et MMP-9 ainsi que la MMP membranaire MT1-MMP, sont impliquées dans la migration des OE-MSCs. Nous montrons également que les gélatinases sont probablement impliquées dans les propriétés neurotrophiques des OE-MSCs et des cellules engainantes olfactives.L'ensemble de ces résultats apporte de nouveaux éléments fondamentaux, dans la compréhension du rôle du système MMP/TIMP dans les processus post-lésionnels qui ont lieu au sein du système nerveux central. / The matrix metalloproteinases (MMPs) belong to a growing family of Zn2+-dependent endopeptidases, secreted or membrane-bound (MT-MMP), which play a fundamental role in the cell signalling. The activity of the MMPs is regulated by their endogenous inhibitors, the tissue inhibitors of MMPs (TIMPs). The MMP / TIMP system regulates the cell-cell and cell-extracellular matrix interactions and modulates the cellular motility through the cleavage of protein components of the extracellular matrix, as well during physiological and pathological conditions.Our results suggest that TIMP-1 is implicated in the modulation of the neurite outgrowth and morphology of cortical neurons through the inhibition at least in part, of MMP-2 and not MMP-9. Afterward, we study of the system MMP / TIMP in the migration of the stem cells of olfactory ectomesenchymal stem cells (OE-MSCs). We show that gelatinases MMP-2 and MMP-9 as well as MT1-MMP, are involved in OE-MSCs migration. We also show that gelatinases are probably involved in neurotrophic properties of the OE-MSCs and olfactory ensheathing cells.Altogether, these results provide new evidences on the role of MMP/TIMP system in central nervous system post-lesional processes.

Lorsque le système nerveux central des mammifères est lésé, un ensemble de réactions secondaires impliquant l’inflammation et une gliose réactive conduit à la formation d’une cicatrice gliale qui inhibe la régénération axonale. Dans le cas d’une lésion de la moelle épinière l’absence de réparation efficace des réseaux axonaux lésés peut conduire à la paraplégie ou à la tétraplégie. Aujourd’hui on estime à plus de 2,5 millions le nombre d’individus dans le monde souffrant de ces handicaps et il n’existe à ce jour aucun traitement validé pour améliorer la situation des patients. Cependant, certaines approches de thérapie moléculaire, cellulaire, et de réadaptation semblent toutefois prometteuses sur modèle animal. La dégradation des chondroitines sulfates protéoglycanes (CSPGs), principales protéines inhibitrices de la cicatrice gliale, par clivage des coeurs protéiques et ou des chaînes latérales glycosaminoglycanes favorise la régénération axonale et entraîne une récupération fonctionnelle. Des études ont montré que la métalloprotéase matricielle MMP‐2 est capable de dégrader le coeur protéique de ces CSPGs. Par ailleurs, les cellules engainantes de la muqueuse olfactive (CEOs) occupent une place privilégiée parmi les types cellulaires proposés dans la thérapie cellulaire en favorisant la croissance axonale et la récupérationfonctionnelle après lésion de la moelle épinière. Cependant, les mécanismes qui sous‐tendent les propriétés régénératrices des CEOs restent essentiellement inconnus. Dans notre Thèse, nous présentons nos travaux en trois parties. Dans la première, nous montrons in vitro que : i) les CEOs en culture primaire secrètent des taux élevés de MMP‐2, au moins en partie active ; ii) les gélatinases MMP‐2 et MMP‐9 présentent une sécrétion vésiculaire golgi‐dépendante; iii) la distribution des vésicules contenant les MMPs est liée à celle du cytosquelette et des moteurs moléculaires qui participent probablement à une sécrétion focalisée de ces molécules en fonction d’interactions entre le milieu extracellulaire et le cytosquelette ; iv) les MMPs peuvent avoir une distribution nucléaire dans les CEOs ; v) MMP‐2 jouerait un rôle dans la migration des CEOs, un processus important dans leurs capacités à réparer le tissu nerveux. Dans la seconde partie de notre thèse, nous avons développé un modèle de cicatrice gliale in vitro et nous montrons que : i) la migration des cellules astrocytaires de la cicatrice gliale in vitro est sensible aux effets des inhibiteurs des MMPs, contrairement aux cellules microgliales ; ii) les CEOs lèvent l’inhibition de croissance axonale due aux cellules astro‐microgiales ; iii) le potentiel des CEOs à créer un environnement permissif à la croissance axonale serait lié aux gélatinases sécrétées par ces cellules, en particulier MMP‐2. Dans la troisième partie de notre Thèse, nous avons évalué in vivo si MMP‐2 contribuait aux effets bénéfiques des CEOs. Nous montrons pour la première fois, dans un model animal d’hémisection de la moelle épinière, et en utilisant des approches anatomiques, électrophysiologiques et d’analyse de la locomotion, qu’une administration chronique de MMP‐2 recombinante : i) augmente le nombre et le diamètre des axones du coté distal du site de lésion ; ii) restaure la réponse évoquée du reflexe‐H distal au site de lésion ; iii) améliore la réponse respiratoire à la fatigue musculaire induite électriquement et, iv) le plus important, améliore la récupération de la locomotion. L’ensemble de notre travail suggère que MMP‐2 sécrétée par les CEOs jouerait un rôle important des les propriétés bénéfiques de ces cellules lorsqu’elles sont transplantées dans des sites de lésions de la ME, et que cette MMP présente un réel potentiel thérapeutique qui reste à explorer. / When the mammalian central nervous system is injured, a set of secondary reactions involving inflammation and reactive gliosis leads to the formation of a glial scar that inhibits axonal regeneration. In the case of a spinal cord lesion, the lack of effective repair of injured axonal networks can lead to paraplegia or quadriplegia. Today it is estimated that more than 2.5 million people are suffering from these handicaps worldwide, and there is as yet no validated treatment to improve the situation of patients. However, based on animal models, some molecular, cellular, and rehabilitation therapy approaches seem promising. Degradation of chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), the main inhibitory protein of the glial scar, by cleavage of either the protein core or side chains glycosaminoglycans, promotes axonal regeneration and leads to functional recovery. Studies have shown that the matrix metalloproteinase MMP-2 is capable of degrading the core protein of the CSPG. In addition, olfactory mucosa ensheathing cells (OECs) represent the most promising cell type for promoting axonal growth and functional recovery after spinal cord injury. However, the mechanisms underlying the regenerative properties of OECs remain essentially unknown. Here, we present our work in 2 parts. First, we show in vitro that: i) OECs in primary culture secrete high levels of active MMP-2; ii) both gelatinases, MMP-2 and MMP-9, have a vesicular Golgi-dependent secretion; iii) the distribution of vesicles containing the MMPs is linked to cytoskeleton and molecular motors distribution, which are probably involved in focused secretion of these molecules; iv) MMPs may have a nuclear distribution in OECs; v) MMP-2 plays a role in the migration of EOCs, an important process in their ability to repair nerve tissue. In the second part of my work, we evaluated whether the MMP-2 contributed to the beneficial effects of EOCs. We used an in vivo approach and we show for the first time, in an animal model of hemisection of the spinal cord, and using anatomical, electrophysiological analysis of locomotion approaches, that a chronic administration of recombinant MMP-2: i) increases the number and diameter of axons in the distal side of the site of injury; ii) restores the response-evoked H-reflex distal to the lesion site, iii) enhances the respiratory response to electrically-induced muscle fatigue, and iv) most importantly, improves the recovery of locomotion. All our work suggests that MMP-2, secreted by the EOCs, plays an important role in the recovery properties of these cells, when transplanted into spinal cord lesions, and that this MMP has a real therapeutic potential that remains to be explored.