Dans cette étude, nous avons isolé et évalué le potentiel probiotique et l’effet barrière de nouvelles souches de bactéries lactiques contre l’entérite nécrotique du poulet de chair; une infection qui cause des lésions intestinales, mais aussi qui diminue le poids des oiseaux et entrainant dans certains cas leur mort. Le recours aux antibiotiques pour prévenir cette infection, mais d’une comme facteurs de croissance est prohibé depuis 2006 en Europe, par le règlement 1831/2003/CE. Ainsi, le développement de stratégies alternatives aux antibiotiques reste un objectif louable sur les plans scientifique, industriel et sociétal. Ainsi, nous avons procédé à l’isolement et évaluation de nouvelles souches de bactéries lactiques, plus particulièrement de lactobacilles, comme flores probiotiques et potentiellement protectrices contre l’entérite nécrotique. Les bactéries lactiques sont capables de produire plusieurs molécules antagonistes comme l’acide lactique, ou encore les acides gras et phénylactique, le peroxyde d’hydrogène, le diacétyle et les bactériocines. Outre cet arsenal, les bactéries lactiques bénéficient du double statut GRAS/QPS (innocuité et sécurité des souches), et sont pour autant utilisables dans divers secteurs de la biotechnologie et de l’agroalimentaire. Les bactéries lactiques sont capables de former des biofilms et d’exercer de nombreuses fonctions biologiques de grande importante, les rendant ainsi comme microorganismes de choix pour des applications probiotiques. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effets barrière et probiotique de nouvelles souches de bactéries lactiques appartenant au genre Lactobacillus, et plus particulièrement aux espèces Lactobacillus reuteri et Lb. salivarius. Ces souches ont été isolées de caeca de poulets sains élevés dans la région des Hauts-de-France. Les résultats que nous avons obtenus ont permis de mettre en évidence les activités antagonistes de ces nouvelles souches, notamment contre Clostridium perfringens; la bactérie qui est responsable de l’entérite nécrotique. Cet antagonisme est d’abord mis en évidence in vitro sur un milieu gélosé. Il est attribué à la production d’acide lactique, comme principale molécule antagoniste. Les propriétés d’agrégation, d’adhésion et de formation de biofilms de ces nouvelles souches et leur résistance aux conditions gastro-intestinales de poulets reconstituées ont également été étudiées et établies dans le cadre de cette thèse. Les souches que nous avons nouvellement isolées et sélectionnées se sont avérées être non-hémolytiques. Par ailleurs, les propriétés de résistance au procédé de lyophilisation, à la conservation ainsi que la viabilité aux conditions d’administration aux animaux ont été également élucidées. Ces critères technologiques nous ont permis d’établir la faisabilité de les produire à l’échelle avant une possible commercialisation. Les génomes des souches ayant donné des activités les plus intéressantes sur le plan de l’antagonisme et qualification probiotique ont été séquencés. Il faut noter que la validation de ces activités et plus particulièrement de l’effet anti-C. perfringens a été réalisée avec succès in vivo sur des modèles de poulets. / Here, we propose the use as probiotic novel lactic acid bacteria (LAB), mainly lactobacilli for their anti-Clostridium perfringens properties. This Gram-positive, spore-forming and harmful bacterium is responsible for necrotic enteritis in broilers. This infection is characterized by severe intestinal lesions, bird weight loss and ultimately bird death. The use of antibiotics to prevent necrotic enteritis or just as growth promotors has been banned in Europe since 2006 based on the EU regulation 1831/2003/CE. Antibiotics replacement in the animal production is expected to drive fruitful and intensive projects. In this frame, we have successfully isolated novel lactobacilli strains endowed with anti-C. perfringens activity and additional probiotic features. LAB are recognized as GRAS/QPS organisms and can offer advantages for industrial applications. In this study, LAB strains were isolated from healthy chicken caeca. These LABs, mainly those belonging to Lactobacillus reuteri and Lb. salivarius species have revealed highly capabilities to inhibit in vitro C. perfringens through lactic acid production. Besides lactic acid production, these novel strains were able to form biofilms and display high aggregation and adhesion scores. These non-hemolytic strains were also studied for their resistance to simulated gastro-intestinal conditions. Technological properties as resistance to freeze-drying process, conservation and viability were determined and allowed to shape and predict scale production of these novel LAB strains. Genomes of Lactobacilli with relevant fulfilling antagonistic activities and probiotic grade were sequenced and analyzed. To conclude this study, in vivo assays were successfully tested in challenged birds. Interestingly and remarkably, these strains allowed birds to gain weight and avoid lesions caused ascribed to C. perfringens.

Résumé: Introduction : Le rotavirus est la principale cause de gastro-entérite aiguë (GEA) chez les tout-petits à travers le monde. En 2011, le vaccin antirotavirus monovalent (RV1) a été introduit dans le programme de vaccination universel du Québec afin de réduire la morbidité reliée à la gastro-entérite à rotavirus (GERV). Ce mémoire avait pour objectif de décrire les taux d’hospitalisation pour GEA et GERV avant et après l’implantation du programme chez les jeunes enfants estriens (étude d’impact) ainsi que la couverture vaccinale et d’évaluer l’efficacité vaccinale (EV) du RV1 (étude d’efficacité). Méthode : Le jumelage d’une banque de données hospitalières avec le registre régional de vaccination a permis d’extraire une cohorte d’enfants nés au Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke (CHUS), vivant en Estrie et âgés de moins de cinq ans durant la période d’étude de juin 2004 à mai 2014 (n = 37 757). Cette cohorte a été suivie de façon rétrospective afin d’examiner les taux annuels d’hospitalisation pour GEA et GERV des années pré- (2004/2005-2010/2011) et post-implantation (2011/2012-2013/2014), globalement et selon diverses caractéristiques socioéconomiques. De plus, l’EV du RV1 a été calculée à l’aide de trois cohortes d’enfants : (1) les enfants vaccinés nés en 2011-2013 (n = 5 033), (2) les enfants non vaccinés nés en 2011-2013 (n = 1 239) et (3) les enfants non vaccinés nés en 2008-2010 (n = 6 436). Résultats : Le taux d’hospitalisation pour GEA a évolué de 81/10 000 enfants de moins de cinq ans en période pré-implantation à 46/10 000 en période post-implantation (réduction relative = 43 %, p < 0,001). Suite à l’implantation du programme, la couverture vaccinale a rapidement augmenté pour atteindre 81 %. Malgré une couverture vaccinale similaire parmi les différents groupes, les plus faibles réductions relatives ont été observées chez les groupes défavorisés. L’EV ajustée pour une série complète était de 62 % (intervalle de confiance [IC] 95 % : 37-77 %) et de 94 % (IC 95 % : 52-99 %) contre les hospitalisations pour GEA et GERV, respectivement. Les enfants vivant dans des quartiers ayant une proportion élevée de familles à faible revenu avaient une EV plus faible contre les hospitalisations pour GEA (30 % contre 78 %, p = 0,027). Conclusion : Trois ans après son introduction dans le programme universel, le RV1 a réduit de façon significative les gastro-entérites sévères chez les jeunes enfants estriens. Ce vaccin est très efficace pour prévenir les hospitalisations pour GERV, particulièrement chez les groupes plus aisés. D’autres études en contexte similaire sont nécessaires pour déterminer les facteurs reliés à une plus faible EV chez les groupes vulnérables. / Abstract: Introduction: Rotavirus is the main cause of acute gastroenteritis (AGE) among young children worldwide. In 2011, the monovalent rotavirus vaccine (RV1) was introduced into the Quebec universal immunization program to reduce morbidity related to rotavirus gastroenteritis (RVGE). This thesis aimed to examine AGE and RVGE hospitalization rates before and after implementation of the program in young children from the Eastern Townships (impact study) and the vaccine coverage, and to assess vaccine effectiveness (VE) of the RV1 (effectiveness study). Methods: The pairing of a tertiary hospital database with the regional immunization registry allowed to extract a cohort of children born at the Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke (CHUS), living in Eastern Townships and aged less than five years during the study period from June 2004 to May 2014 (n= 37,757). This cohort was retrospectively followed-up to examine AGE and RVGE annual hospitalization rates of pre- (2004/2005-2010/2011) and post-program years (2011/2012-2013/2014), globally and according to several socioeconomic characteristics. Moreover, RV1 VE was calculated using three children cohorts: (1) vaccinated children born in 2011-2013 (n=5,033), (2) unvaccinated children born in 2011-2013 (n=1,239), and (3) unvaccinated children born in 2008-2010 (n=6,436). Results: AGE hospitalization rates evolved from 81/10,000 children aged less than five years in pre-program period to 46/10,000 in post-program period (relative reduction=43%, p<0.001). Following implementation of the program, vaccine coverage rapidly increased to reach 81%. Despite similar vaccine coverage among different groups, lowest relative reductions were observed in disadvantaged groups. Adjusted VE of a complete series was 62% (95% confidence interval [CI]: 37%-77%) and 94% (95% CI: 52%-99%) against AGE and RVGE hospitalizations, respectively. Children living in neighbourhoods with higher rates of low-income families had lower VE against AGE hospitalizations (30% vs. 78%, p=0.027). Conclusion: Three years following its introduction into the universal vaccination program, RV1 significantly reduced severe gastroenteritis in young children in the Eastern Townships. This vaccine was highly effective to prevent RVGE hospitalizations, particularly among the most well-off. Further studies in similar setting are needed to determine factors related to lower VE among vulnerable groups.

Thèse en cotutelle : « Université Laval, Québec, Canada, Philosophiæ doctor (Ph. D.) et Universidad de La Rioja Logrono, Espagne » / Les antibiotiques ont été largement utilisés comme promoteurs de croissance et prophylactiques pour prévenir les maladies dans l'élevage de volailles. En raison de l'urgence de la prévention de la propagation des bactéries multirésistantes, de nombreux gouvernements ont interdit leur utilisation comme facteurs de croissance. Malheureusement, ces mesures ne sont pas universellement appliquées et, comme effet secondaire, l'incidence des infections à Clostridium perfringens associées à l'entérite nécrotique (EN) a augmenté dans les pays où elles ont été interdites. En outre, des C. perfringens résistants apparaissent, mais comme ce microorganisme ne fait pas l'objet de programmes de surveillance, davantage d'informations sont nécessaires pour comprendre pleinement son profil de résistance. Tout cela souligne la nécessité de rechercher et de mettre en œuvre de nouvelles approches pour éviter l'utilisation d'antibiotiques chez les volailles. Les bactéries productrices de bactériocines (BAC+), capables d'inhiber la croissance de C. perfringens, constituent une bonne approche. Les entérocoques se caractérisent par la production de bactériocines (entérocines) et peuvent donc être utilisés à cette fin. Cependant, ces genres contiennent souvent des facteurs de virulence et des mécanismes de résistance aux antibiotiques. Par conséquent, en raison de leur dualité en tant que pathogènes commensaux et opportunistes, une caractérisation plus approfondie de ces bactéries est nécessaire. C'est pourquoi l'utilisation de leurs entérocines pourrait être une approche encore meilleure et plus réaliste. Cette thèse tente de répondre à cette question en développant trois objectifs principaux. Le premier objectif était de caractériser au niveau génomique une collection d'isolats de C. perfringens provenant de volailles touchées par la NE. À cette fin, vingt isolats ont été caractérisés par séquençage du génome entier (WGS) et les données relatives à leur résistome, virulome, plasmidome, gènes de toxines et typage de séquences multilocus ont été analysés. Les résultats ont montré que les gènes tet (associés à la résistance à la tétracycline) étaient les gènes de résistance les plus fréquemment détectés et, fait intéressant, deux isolats portaient le gène erm (T) associé à la résistance à l'érythromycine, qui n'a été signalé que chez d'autres bactéries Gram-positifs. Douze des isolats ont été toxinotypés comme étant de type A et sept comme étant de type G. D'autres facteurs de virulence codant pour des hyaluronases et des sialidases, ainsi que des plasmides, ont été fréquemment détectés. Les types de séquences ont révélé une grande variabilité des isolats et de nouvelles combinaisons alléliques ont été trouvées. Parmi les isolats, C. perfringens MLG7307 présentait des caractéristiques uniques, même en l'absence du gène conservateur colA, ce qui suggère que cet isolat pourrait appartenir à une nouvelle classification. Dans l'ensemble, les résultats obtenus permettent de mieux comprendre les caractéristiques génomiques de C. perfringens et de mieux appréhender ce pathogène. Le deuxième objectif était de cribler et de caractériser les souches d'entérocoques d'origine avicole ayant une activité antimicrobienne contre C. perfringens. À cette fin, une collection de 251 entérocoques provenant de volailles a été criblée pour son activité antimicrobienne contre la collection de C. perfringens et des BAC+ ont été sélectionnées pour effectuer une analyse WGS en termes de profil de résistance aux antimicrobiens, de virulence, de plasmidome et de typage de séquences multilocus. Selon les résultats obtenus, des entérocoques potentiellement inoffensifs ont été sélectionnés pour tester la survie digestive dans les conditions de la volaille. Parmi tous les entérocoques, E. faecium X2893 et X2906 étaient les candidats les plus prometteurs pour des études ultérieures en tant que cultures protectrices pour l'élevage de volailles. Les deux souches appartiennent au type de séquence ST722, portent les gènes codant pour l'entérocine A et l'entérocine B, n'ont pas de gènes de résistance acquis, ne portent pas de plasmides, portent le gène acm impliqué dans la colonisation de l'hôte et ont montré des taux de survie élevés dans des conditions digestives in vitro chez la volaille. Ils sont donc de bons candidats pour être utilisés comme cultures protectrices dans des études à venir. Le dernier objectif était de produire et de purifier des entérocines ayant une activité contre la collection de C. perfringens et d'autres bactéries pathogènes pour la volaille. Les entérocines A, B, P, SEK4 et L50 ont été obtenues par synthèse peptidique en phase solide assistée par micro-ondes et leur activité antimicrobienne a été évaluée contre la collection de C. perfringens et d'autres bactéries pertinentes. Des combinaisons de ces entérocines, en fonction de leurs mécanismes d'action, ont été évaluées pour obtenir une synergie. Les résultats ont montré que les deux peptides de L50 étaient les plus actifs contre C. perfringens, L50A étant plus actif. Ces peptides ont également montré le spectre le plus large, étant actifs même contre Campylobacter coli ATCC 33559 et Pseudomonas aeruginosa ATCC 27855. Toutes les combinaisons testées ont montré une synergie ou une synergie partielle. Cette étude renforce l'idée d'utiliser les entérocines seules et en combinaisons synergiques pour inhiber la croissance de C. perfringens et d'autres agents pathogènes comme une alternative prometteuse aux antibiotiques dans le secteur de la volaille. En conclusion, l'utilisation d'entérocoques BAC+, et en particulier de leurs entérocines, représente une alternative très intéressante aux antibiotiques dans le secteur de la volaille. D'autres perspectives sur ce sujet pourraient inclure l'optimisation de la production d'entérocines et des études plus détaillées (toxicité, dégradation enzymatique, etc.), afin de s'assurer que leur utilisation est sûre. Les prochaines étapes pourraient également inclure des modèles d'infection in vivo afin d'évaluer leur efficacité dans la prévention de l'infection par C. perfringens. / Antibiotics have been widely used in therapeutic, prophylaxis and growth promotion in poultry farming. Due to the urgency of preventing the spread of multi-drug resistant bacteria, many governments have banned the use of antibiotics for growth promotion and are calling for a general reduction of these agents in food production, requiring alternatives to preserve human and animal health. Clostridium perfringens infections associated with necrotic enteritis (NE) are one of the major threats of the poultry sector. Antibiotic resistance in C. perfringens is emerging, but as this microorganism is not subject to surveillance programmes, more information is needed to fully understand its antibiotic resistance profile. All this underlines the need to deepen in the control of NE associated to C. perfringens in the poultry sector reducing the use of antibiotics. Bacteriocin-producing (BAC+) bacteria, capable of inhibiting the growth of C. perfringens provide a good approach. Enterococci are characterized by the production of bacteriocins (enterocins) and can therefore be used for this purpose. However, these genera often contain virulence factors and antibiotic resistance mechanisms. Hence, due to their duality as commensal and opportunistic pathogen, a deep characterisation of these BAC+ enterococci is required. For this reason, the use of their enterocins instead could be an even better and more realistic approach. This thesis attempts to address this issue through the development of three main objectives. The first objective was to characterise at the genomic level a collection of C. perfringens isolates from poultry affected by NE. To this end, twenty isolates were characterised by whole genome sequencing (WGS) and data on their resistome, virulome, plasmidome, toxin genes and multilocus sequence typing were analysed. The results showed that the tet genes (associated with tetracycline resistance) were the most common resistance genes detected and, interestingly, two isolates carried the erm(T) gene associated with erythromycin resistance, which has only been reported in other Gram-positive bacteria. Twelve of the isolates were toxinotyped as type A and seven as type G. Other virulence factors encoding hyaluronases and sialidases and plasmids, were frequently detected. Identified sequence types revealed a high variability of the isolates and new allelic combinations were found. Among the isolates, C. perfringens MLG7307 showed unique characteristics, even lacking the housekeeping gene colA, suggesting that this isolate could belong to a newspecies/variant. Overall, the results obtained provide insights into the genomic characteristics of C. perfringens and a better understanding of this pathogen. The second objective was to screen and characterise for safety enterococcal strains of poultry origin with antimicrobial activity against C. perfringens. To this end, a collection of 251 enterococci from poultry was screened for antimicrobial activity against the C. perfringens collection and BAC+ strains were selected to perform WGS analysis in terms of the resistome, virulence, plasmidome and multilocus sequence typing. According to the results obtained, potentially harmless selected enterococci were also tested for digestive survival under poultry conditions. Among all enterococci, E. faecium X2893 and X2906 were the most promising candidates for further studies as protective cultures for poultry farming. Both strains belong to sequence type ST722, carry the genes encoding enterocin A and enterocin B, have no acquired resistance genes, do not carry plasmids, contain the acm gene involved in host colonisation and showed high survival rates under in vitro poultry digestive conditions. They are therefore good candidates for use as protective cultures in future studies. The last objective was to produce and purify enterocins with activity against the C. perfringens collection and other relevant bacterial poultry pathogens. Enterocins A, B, P, SEK4 and L50 were obtained by microwave- assisted solid-phase peptide synthesis and their antimicrobial activity was evaluated against the C. perfringens collection and other relevant bacteria. Combinations of these enterocins, according to their mechanisms of action, were evaluated to achieve synergy. The results showed that the two peptides from L50 were the most active against C. perfringens, with L50A being more active. These peptides also showed the broadest spectrum, being active even against Gram-negative Campylobacter coli ATCC 33559 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27855. All combinations tested showed synergy or partial synergy. This study strengthens the idea of using enterocins alone and in synergistic combinations to inhibit the growth of C. perfringens and other pathogens as a promising alternative to antibiotics in the poultry sector. In conclusion, the use of BAC+ enterococci, and especially their enterocins, represents a very attractive alternative to antibiotics in the poultry sector. Further perspectives on this topic could include the optimisation of enterocin production and more detailed studied (toxicity, enzymatic degradation, etc), to ensure that their use is safe. Also, next steps can includen vivo infection models to assess their efficacy in preventing C. perfringens infection in poultry production. / Los antibióticos se han utilizado ampliamente en terapéutica, profilaxis y como promotores del crecimiento en producción aviar. Dada la necesidad urgente de prevenir la propagación de bacterias multirresistentes, muchos gobiernos han prohibido su uso como promotores del crecimiento en producción animal, y urgen en la necesidad de reducir de forma general el uso de antibióticos en este sector, requiriendo alternativas para preservar la salud humana y animal. Las infecciones por Clostridium perfringens asociadas con enteritis necrótica (EN) han aumentado en los últimos años en el sector avicola y suponen un gran problema, que exige una vigilancia estrecha. La resistencia a antibióticos esta aumentando en C. perfringens, pero como este microorganismo no está sujeto a programas de vigilancia, se necesita más información para conocer a fondo su perfil de resistencia. Todo esto resalta la necesidad de investigar en el control de la EN asociada a C. perfringens, aplicando nuevos enfoques para reducir el uso de antibióticos en producción aviar. Las bacterias productoras de bacteriocinas (BAC+), capaces de inhibir el crecimiento de C. perfringens, suponen un buen enfoque. Los enterococos destacan por la producción de bacteriocinas (enterocinas) y, por tanto, pueden utilizarse con este fin. Sin embargo, con frecuencia los enterococos contienen factores de virulencia y mecanismos de resistencia a los antibióticos. De ahí que, debido a su dualidad como comensales y patógenos oportunistas, sea necesario caracterizarlos exhaustivamente. Así pues, el uso de sus enterocinas podría ser un enfoque aún mejor y más realista. Esta tesis intenta abordar esta problemática mediante el desarrollo de tres objetivos principales. El primer objetivo fue caracterizar a nivel genómico una colección de aislados de C. perfringens procedentes de aves de corral afectadas por NE. Para ello, se caracterizaron veinte cepas mediante secuenciación del genoma completo (WGS) y se analizaron datos sobre su resistoma, viruloma, plasmidoma, genes de toxinas y tipificación molecular. Los resultados mostraron que los genes tet (asociados a la resistencia a la tetraciclina) eran los más frecuentes y fue de interés la detección de dos aislados que portaban el gen erm(T), asociado a la resistencia a la eritromicina, que sólo se ha descrito previamente en otras bacterias Gram-positivas. Doce de los aislados fueron toxinotipados como tipo A y siete como tipo G. También se detectaron con frecuencia otros factores de virulencia que codifican hialuronasas y sialidasas, así como plásmidos. El tipado molecular reveló una gran variabilidad de los aislados, hallándose incluso nuevas combinaciones alélicas. Entre los aislados, C. perfringens MLG 7307 mostró características únicas, careciendo del gen « housekeeping » colA, lo que sugiere que podría pertenecer a una nueva especie/variedad. En su conjunto, los resultados obtenidos permiten conocer mejor las características genómicas de C. perfringens y profundizar en el estudio de este patógeno. El segundo objetivo fue caracterizar los enterococos de origen aviar con actividad antimicrobiana frente a C. perfringens para garantizar su seguridad. Para ello, se examinó la actividad antimicrobiana de una colección de 251 enterococos de origen aviar frente a la colección de C. perfringens y se seleccionaron cepas BAC+ para realizar análisis de secuenciación masiva (WGS) y determinar así su resistoma, viruloma, plasmidoma y realizar la tipificación molecular. Posteriormente, se analizó la supervivencia digestiva en condiciones aviares de los enterococos potencialmente inocuos seleccionados. De entre todos los enterococos, E. faecium X2893 y X2906 fueron los candidatos más prometedores para futuros estudios como cultivos protectores. Ambas cepas pertenecen al linaje ST722, son portadoras de los genes codificantes de la enterocina A y la enterocina B, no tienen genes de resistencia a antibióticos adquiridos, no portan plásmidos, poseen el gen acm implicado en la colonización del hospedador y mostraron elevadas tasas de supervivencia in vitro bajo condiciones digestivas aviares. Por lo tanto, son buenos candidatos para se utilizados como cultivos protectores en estudios posteriores. El último objetivo fue producir y purificar enterocinas con actividad antimicrobiana contra la colección de C. perfringens y otros patógenos relevantes. Las enterocinas A, B, P, SEK4 y L50 se obtuvieron mediante síntesis peptídica en fase sólida asistida por microondas y se evaluó su actividad antimicrobiana frente a la colección de C. perfringens y otros patógenos. Se evaluaron diferentes combinaciones de estas enterocinas, seleccionadas según sus mecanismos de acción, para lograr sinergias. Los resultados mostraron que los dos péptidos de la enterocina L50 eran los más activos contra C. perfringens, siendo L50A el más activo. Estos péptidos también mostraron el espectro más amplio, siendo activos incluso frente a las bacterias Gram-negativas Campylobacter coli ATCC 33559 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27855. Todas las combinaciones estudiadas mostraron sinergia o sinergia parcial. Este estudio consolida la idea de emplear enterocinas solas y en combinaciones sinérgicas para inhibir el crecimiento de C. perfringens y otros patógenos como alternativa prometedora a los antibióticos en el sector avícola. En conclusión, el uso de enterococos BAC+, y especialmente de sus enterocinas, representa una alternativa muy atractiva a los antibióticos en el sector avícola. Entre las perspectivas futuras sobre este tema podrían figurar la optimización de la producción de enterocinas y estudios más detallados (toxicidad, degradación enzimática, etc.), para garantizar que su uso sea seguro. Asimismo, los próximos pasos pueden incluir modelos de infección in vivo para evaluar su eficacia en la prevención de la infección por C. perfringens.

Les gastroentérites aiguës (GEA) représentent un lourd fardeau pour la population pédiatrique. Elles sont responsables d’une mortalité importante, particulièrement chez les enfants de moins de 5 ans dans les pays à faibles revenus, et ont un impact socio-économique non négligeable dans les pays à hauts revenus. La prévalence des différents entéropathogènes potentiellement impliqués dans les GEA varie selon les études, dépendamment de la technique diagnostique utilisée, de la population étudiée – âge des patients, co-morbidités, situation géographique et socio-économique – et du moment où l’étude a été réalisée.Campylobacter est l’un des pathogènes entériques majeurs dans les pays à hauts revenus. Les espèces Campylobacter jejuni et coli sont les plus fréquemment retrouvées par les méthodes de culture sur des milieux sélectifs utilisées en routine dans la plupart des laboratoires de microbiologie. Cependant l’utilisation d’autres méthodes, comme la technique « de filtration » ou les techniques de PCR, permet de mettre en évidence d’autres campylobacters tels que Campylobacter concisus dont le rôle dans les GEA est sujet à controverse.Dans ce contexte, l’objectif général de ce travail de thèse est l’amélioration de la prise en charge diagnostique des GEA en pédiatrie à Bruxelles. Cet objectif se détaille en deux sousobjectifs: d’abord une étude de prévalence des entéropathogènes - et potentiels entéropathogènes -, ensuite une amélioration de techniques diagnostiques. Ces éléments sont détaillés ci-dessous.La première partie de ce travail nous a permis de recruter deux groupes de patients :l’un atteint de GEA (185 cas) et l’autre asymptomatique (179 témoins), mais comparables notamment en termes d’âge, de fréquentation de la crèche ou de l’école, de vaccination contre rotavirus, et de traitement par antibiotique. Au vu des techniques diagnostiques utilisées dans notre étude, Campylobacter jejuni-coli était le principal reponsable de GEA dans notre population (14% des cas), suivi de rotavirus (11% des cas). Seules 6 souches de C. concisus ont pu être retrouvées parmi les cas et 4 parmi les contrôles, ceci ne nous permettant pas de tirer de conclusions quant à un éventuel rôle de ce germe.Malgré une couverture vaccinale satisfaisante de plus de 80% parmi les cas et les témoins recrutés, rotavirus reste le deuxième entéropathogène en termes d’importance avec 11% des cas infectés dans la population étudiée. Si le calcul de l’efficacité vaccinale réalisé dans la seconde partie de ce travail n’a pas montré de résultat statistiquement significatif, les enfants de moins de 12 mois comptaient significativement plus de cas de GEA à rotavirus chez les non vaccinés que chez les vaccinés. La couverture vaccinale pourrait donc encore être améliorée afin de mieux couvrir cet âge à risque de GEA compliquée.Le faible nombre de souches de C. concisus retrouvé dans la première partie du travail nous a poussé à tenter d’améliorer la technique de culture dite « de filtration » utilisée au LHUB-ULB pour la mise en évidence des campylobacters, particulièrement des « non jejuni-coli ». En trois étapes, nous avons pu montrer la supériorité de la combinaison comprenant la gélose Columbia contenant 5% de sang de mouton, avec des filtres en polycarbonate comportant des pores de 0,60 μm de diamètre et une mise en culture dans une atmosphère microaérophile enrichie en hydrogène (7%) afin d’obtenir une meilleure sensibilité de la technique de filtration. Ces améliorations ont fait passer C. concisus en première position en termes de fréquence de Campylobacter, devant C. jejuni.Cette proposition de standardisation de la méthode permettra de faciliter la comparaison de futures études sur le sujet et d’augmenter le nombre de souches de C. concisus isolées afin de tester les hypothèses proposées de génotypes potentiellement pathogènes et de facteurs devirulence sur un échantillon plus large de souches.Parmi les techniques diagnostiques actuelles en microbiologie, les méthodes basées sur l’amplification d’acides nucléiques sont passées sur le devant de la scène, attrayantes par leur rapidité de résultats et par leur haut taux de réponse positive. L’une de ces techniques, le Luminex xTAG GPP a pu être testé sur les échantillons des cas et des témoins. Les résultats soulèvent quelques questions concernant l’utilité de cette technique pour la prise en charge clinique des patients au vu des hauts taux de positivité chez cas et témoins impliquant une réserve dans l’interprétation des résultats, particulièrement pour Salmonella. Certains faux négatifs gênent également l’implémentation en routine de ce test :certaines bactéries retrouvées en culture (Shigella, Yersinia, Campylobacter) ne sont pas détectées par le Luminex. Son intérêt est donc faible en clinique dans l’état actuel de la méthode.Ce travail permet de poser des balises pour l’interprétation des tests microbiologiques effectués et d’attirer l’attention des cliniciens sur l’importance de rester critique en ce qui concerne les résutats obtenus :un résultat positif n’indique pas systématiquement que l’entéropathogène détecté est responsable de la clinique présentée et un négatif ne l’absout pas pour autant. Pareillement, les microbiologistes doivent connaître les besoins des cliniciens afin de proposer des tests qui peuvent y répondre, tant en réduisant le délai de réponse qu’en améliorant la pertinence de celle-ci, selon le contexte de la demande :un individu malade, une prise en charge d’épidémie, une étude épidémiologique. Autant de situations où une discussion et une réflexion sont nécessaires afin d’améliorer la prise en charge des patients et d’éliminer les tests inadéquats générant des coûts inutiles pour le patient, l’hôpital et la société. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les lésions radiques aux tissus sains représentent un réel problème de santé publique, puisqu’elles constituent l’un des principaux facteurs limitants des traitements radiothérapeutiques. Les concepts qui entourent leur pathogenèse ont progressivement évolués vers une vision intégrée de la pathogénèse, qui implique l’ensemble des compartiments qui composent le tissu cible. Parmi eux, l’endothélium semble tenir une place centrale dans la séquence d’évènements interdépendants qui conduisent au développement des lésions radiques. Grâce à l’utilisation de nouveaux modèles murins transgéniques, ce travail de thèse fournit la démonstration directe d’un continuum endothélium-dépendant dans l’évolution des lésions intestinales radiques. En effet, la modification du phénotype endothélial grâce à la délétion ciblée du gène SERPINE1, choisi du fait de son rôle clé dans le développement de l’entérite radique, influence différents paramètres du développement de la pathologie. Ainsi, les souris PAI-1 KOendo présentent une meilleure survie, ainsi que des atteintes tissulaires précoces et tardives moins sévères, après irradiation localisée du grêle. En outre, ces animaux présentent une diminution du nombre de cellules intestinales apoptotiques dans les heures qui suivent l’irradiation, de la densité de l’infiltrat de macrophages une semaine après irradiation, ainsi qu’une polarisation différentielle de ces macrophages tout au long du processus physiopathologique. Dans une volonté de protéger les tissus sains des effets secondaires de la radiothérapie sans entraver le traitement anti-cancéreux, l’intérêt de PAI-1 comme cible thérapeutique laisse peu de place aux doutes. / Radiation-induced injury to healthy tissues is a real public health problem, since they are one of the most limiting factors that restrict efficiency of radiation therapy. Concepts surrounding the development of radiation-induced damage have gradually evolved into a contemporary and integrated view of the pathogenesis, involving all compartments of target tissue. Among them, endothelium seems to be central in the sequence of interrelated events that lead to the development of radiation-induced damage, although there are rare concrete elements that support this concept. By using new transgenic mouse models, this PhD project provides a direct demonstration of an endothelium-dependent continuum in evolution of radiation-induced intestinal damage. Indeed, changes in the endothelial phenotype through targeted deletion of the gene SERPINE1, chosen because of its key role in the development of radiation enteritis, influences various parameters of the development of the disease. Thus, lack of PAI-1 secretion by endothelial cells significantly improves survival of the animals, and limits severity of early and late tissue damage after a localized small bowel irradiation. Furthermore, these mice partially KO for PAI-1 showed a decrease in the number of apoptotic intestinal stem cells in the hours following irradiation, a decrease in the macrophages infiltrate density one week after irradiation, and a change in the polarization of macrophages throughout the pathophysiological process. In an effort to protect healthy tissues from radiation therapy side effects, without hindering the cancer treatment, PAI-1 seems to be an obvious therapeutic target.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Travail en codirection avec M. Frédéric Raymond / Avec la présente augmentation de la résistance aux antibiotiques et l’inquiétude des consommateurs, de nouvelles alternatives sont nécessaires afin de contrôler l’entérite nécrotique (EN), une maladie causant des millions de dollars en pertes économiques pour l’industrie de la volaille mondialement. Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par une bactérie pour tuer ou inhiber la croissance d’autres compétiteurs bactériens. La perfrine est la seule bactériocine reportée associée aux souches pathogènes de Clostridium perfringens, l’agent causal de l’EN. Les objectifs de cette étude étaient de détecter les souches commensales de Clostridium perfringens possédant une activité antimicrobienne contre des souches pathogènes de C. perfringens et d’identifier et caractériser les bactériocines produites. Les souches commensales de C. perfringens ont été sélectionnées à partir de notre banque de souches. L’activité antimicrobienne de ces souches a été testée contre des souches pathogènes de C. perfringens en utilisant la méthode d’inhibition sur gélose. Une souche commensale active démontrant une activité antimicrobienne a été cultivée et ses bactériocines ont été partiellement purifiées grâce à la précipitation au sulfate d’ammonium et par chromatographie (HPLC). À la suite de chaque chromatographie, l’activité antimicrobienne des fractions a été vérifiée en utilisant la méthode décrite précédemment afin de choisir les fractions contenant les bactériocines. La susceptibilité enzymatique, la stabilité à la chaleur et au pH et le poids moléculaire estimé des bactériocines ont été caractérisés. Les bactériocines étudiées étaient sensibles à la protéinase K, thermolabiles, stables à pH entre 4 et 8 et leur poids moléculaire étaient supérieur à 30 kDa. Le génome de la souche CP1676 a été séquencé et des analyses bio-informatiques ont été réalisées. Nous avons trouvé 28 séquences de bactériocines potentielles, mais seulement 4 d’entre elles semblaient être prometteuses. Dans cette étude, des souches commensales de C. perfringens produisant des bactériocines actives contre des souches pathogènes ont été identifiées. Ces bactériocines pourraient devenir une alternative intéressante aux antibiotiques afin de contrôler l’entérite nécrotique, mais davantage d’information est nécessaire. / With the current increase in antimicrobial resistance and consumers’ concern, new alternatives are needed to control necrotic enteritis (NE), a disease that causes billions of dollars in economic losses to the poultry industry worldwide. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by bacteria to kill or inhibit the growth of other bacterial competitors. Perfrin is the only reported bacteriocin associated with pathogenic strains of Clostridium perfringens, the causal agent of NE. The aims of this study were to screen for commensal Clostridium perfringens strains with an antimicrobial activity against C. perfringens pathogenic strains and to identify and characterize the produced bacteriocins. Commensal C. perfringens strains were selected from our bacterial collection. Antimicrobial activity of those selected strains was tested against C. perfringens pathogenic strains using the agar spot test method. An active commensal strain showing antimicrobial activity was cultured and its bacteriocins were partially purified using the ammonium sulfate precipitation method and HPLC. After each chromatography, antimicrobial activity of fractions was tested using the method described above to choose fractions containing bacteriocins. Enzyme susceptibility, heat and pH stability and the estimated molecular weight of the bacteriocins were characterized. The studied bacteriocins were sensitive to proteinase K, thermolabile, stable at pH between 4 and 8 and their molecular weight higher than 30 kDa. CP1676 strain genome was sequenced and bioinformatics were performed. We found 28 potential bacteriocin sequences, but 4 of them seemed to be promising. In this study, commensal C. perfringens strains producing bacteriocins active against pathogenic strains have been identified. These bacteriocins could be an interesting alternative to antibiotics for the control of necrotic enteritis but further data is still needed.

Les épidémies de gastro-entérite aigüe liées à l’eau du robinet demeurent un enjeu de santé publique au 21ème siècle dans les pays développés. La majorité des dispositifs de surveillance mis en place dans les pays se caractérisent par une sous-déclaration. En France, l’amélioration de la surveillance de ces évènements repose sur l’exploitation des données de l’Assurance Maladie. L’objectif de notre travail est de proposer une méthode pour améliorer la sensibilité et la spécificité de la détection des épidémies de gastro-entérite aigüe d’origine hydrique. Trois études ont été menées pour i) évaluer la capacité des données de l’Assurance Maladie à décrire des épidémies de gastro-entérite aigüe d’origine hydrique, ii) adapter une méthode de détection spatio-temporelle en intégrant l’exposition à l’eau du robinet, iii) évaluer les performances de cette méthode. Notre travail a permis de développer une méthode de détection spatio-temporelle des épidémies hydriques en tenant compte des unités géographiques de distribution d’eau avec une bonne sensibilité et une bonne valeur prédictive positive. Les performances de détection sont principalement liées à la taille de l’épidémie. La capacité des données de l’Assurance Maladie à détecter des épidémies d’origine hydrique peut être influencée par les habitudes de recours aux soins, la sensibilisation de la population au risque infectieux d’origine hydrique et le niveau d’agrégation temporel des cas de gastro-entérite aigüe. La finalité de nos travaux de recherche est l’application opérationnelle pour la détection automatisée des épidémies hydriques dans une finalité de prévention et de réduction de leur impact sanitaire. / Waterborne disease outbreaks (WBDO) of acute gastrointestinal illness remain a public health concern in the 21st century in developed countries. Almost all surveillance systems implemented in countries are characterized by underreporting. In France, the improvement of monitoring these events is based on the use of data from the French Health Insurance. The aim of our work was to propose a method to improve the sensitivity and specificity of the detection of WBDO. Three studies were conducted to i) evaluate the ability of French Health Insurance data to describe WBDO ii) apply a method of space-time detection by integrating the exposure to tap water, iii) evaluate the performance of this method. Our work allowed developing a method of space-time detection of WBDO by taking into account geographical units for drinking water networks units with a good sensitivity and positive predictive value. The performances for detection are mainly related to the size of the epidemic. The ability of the data from the French Health Insurance to detect WBDO can be influenced by the health-seeking behavior of people, awareness of the population to the risk of WBDO and the temporal aggregation level of cases of acute gastrointestinal illness. The purpose of our research is to carry out an operational design for the automated detection of WBDO in a purpose of prevention and reduction of health impact.

L’entérite nécrotique aviaire causée par Clostridium perfringens est une maladie économiquement dévastatrice et celle-ci est en émergence dans les troupeaux de poulets de chair éliminant l’usage des antibiotiques. À ce jour, aucune alternative en élevage ne permet de prévenir efficacement la maladie et un contrôle par une stratégie vaccinale serait des plus prisé. Une approche par génomique comparative jumelée à la vaccinologie réverse soustractive et comparative identifiant des protéines bactériennes de surface immunogènes figure parmi les approches méthodologiques des plus prometteuses pour le développement rapide d’un vaccin efficace. Une étude génomique comparative réalisée sur 48 souches de C. perfringens provenant de poulets de chair en santé ou affectés par l’entérite nécrotique a permis d’établir que les génomes analysés étaient composés de 155 700 protéines distinctes, où 13% étaient extracellulaires, 65% cytoplasmiques et 22% membranaires. L’évaluation du pouvoir immunogène de ces protéines à l’aide de l’outil de prédiction VaxiJen v.2.0 a permis d’identifier 4 catégories de scores pour les protéines identifiées, allant de 0,5 (seuil minimal recommandé) à 1,5. Les protéines présentant les scores les plus élevés ont été majoritairement associées à des localisations extracellulaires. La combinaison du score d’immunogénicité et de la localisation cellulaire des protéines analysées a mené à la sélection de 12 protéines candidates vaccinales, la plupart d’entre elles étant de fonction hypothétique. Une description plus approfondie de ces protéines permettra de mieux définir leur fonction, d’évaluer leur potentiel antigénique réel en caractérisant leur interaction avec le système immunitaire de la volaille et ultimement, d’évaluer leur rôle probable dans la pathogénie de l’entérite nécrotique. / Avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens is a disease with a major economical impact, generating losses up to 6 billion dollars for the poultry industry worldwide. This disease appears in broiler chicken flocks that no longer employ the use of antibiotics. To date, no alternative method allows for the efficient prevention of necrotic enteritis (NE) and a control by a vaccinal strategy would be mostly prized. A comparative genomics approach as well as comparative and subtractive reverse vaccinology identifying immunogenic bacterial surface proteins is one of the most promising methodologies for the rapid development of an efficient vaccine. A comparative genomic study was performed on 48 C. perfringens strains isolated from healthy broiler chickens and from broilers affected by necrotic enteritis. From this study, it was established that the genomes analyzed were composed of 155 700 distinct proteins where 13% were predicted to have an extracellular expression, 65% at the cytoplasma level and 22% within the plasma membrane. The evaluation of the immunogenic potential of these proteins was established with the prediction software VaxiJen v2.0 for which a 0.5 threshold score allowed for the identification of four score categories among the identified proteins, from 0.5 to 1.5. For the most part, proteins with the highest scores were associated with an extracellular localisation. The combination of the immunogenicity score and localisation of the analysed proteins led to the selection of 12 vaccinal candidate proteins that were mostly identified as hypothetical. A more in-depth description of these proteins would allow the assessment of their function, the evaluation of their true immunogenic potential by characterizing their interaction with the avian immune system and ultimately, evaluate their probable role in the pathogenesis of necrotic enteritis.