Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2000. / Includes bibliographical references (leaves 102-114). Also available online through Digital Dissertations.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-11T12:22:59Z No. of bitstreams: 1 Karla Graziela. Avaliação enzimática...pdf: 7967639 bytes, checksum: aadcd19e00e6ff487dba2f6a89822b03 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-11T12:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karla Graziela. Avaliação enzimática...pdf: 7967639 bytes, checksum: aadcd19e00e6ff487dba2f6a89822b03 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Entamoeba histolytica, o agente etiológico da amebíase, constitui a segunda maior causa de morte por protozooses, sendo considerado um grave problema de saúde pública, particularmente em países em desenvolvimento. A morte celular induzida por este parasito entérico é dependente de contato e mediada por proteínas específicas, as quais modulam diversos eventos fisiológicos no hospedeiro. Dentre os mecanismos reguladores de tais respostas está a desfosforilação de grupos fosfotirosil de proteínas, através da atuação de proteína tirosina fosfatases (PTPases), tanto expressas na superfície celular como secretados pelo trofozoíto. Alguns estudos demonstram uma rápida diminuição nos níveis de fosforilação de resíduos tirosina em proteínas de células-alvo após o contato com E. histolytica. Estas PTPases têm sido descritas como tendo importante papel na patogênese da amebíase. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil de atividade fosfatásica em diferentes cepas de E. histolytica, assim como caracterizar a sua sensibilidade a conhecidos inibidores de proteína tirosina fosfatases, e os efeitos destes moduladores em mecanismos envolvidos na patogênese, a exemplo de fagocitose e efeito citopático. Inicialmente, a sensibilidade aos moduladores da via de sinalização celular em trofozoítos de E. histolytica (cepas ICB – 452, ICB – CSP e HM1:IMSS) foi caracterizada através de avaliação da proliferação celular, onde inóculos de parasitos foram incubados em presença ou ausência de inibidores de PTPases. Dentre os moduladores testados, o derivado de vanádio bisperoxo (1, 10 - fenantrolina) oxovanadato de potássio (bpVphen) e o óxido de fenilarsina (PAO) demonstraram efetiva capacidade antiproliferativa. Estas células apresentaram uma maior sensibilidade ao PAO em comparação ao bpV(phen), com valores de IC50 para a cepa HM1:IMSS de 0,9 μM e 38,4 μM, respectivamente. A análise bioquímica revelou que há uma maior atividade secretória e ectofosfatásica na linhagem HM1:IMSS (24,48 nM p-NP/40 min./3 x 106 células e 297 nM p-NP/40 min./2 x 105 células, respectivamente), e uma redução desta atividade foi detectada na presença dos derivados de vanádio na superfície do parasito (31,3 nM p-NP/40 min./2 x 105 células). O mesmo não foi observado após a adição de PAO. A análise da eritrofagocitose e da destruição da monocamada de células epiteliais da linhagem MDCK, importantes marcadores de virulência neste patógeno, demonstrou significativa redução destes processos em trofozoítos tratados com os inibidores ortovanadato de sódio (OVS) e o bpV(phen), indicando a participação de PTPases nos mesmos. Estas mesmas alterações foram observadas após o tratamento do parasito com PAO, porém dados ultraestruturais de citoquímica enzimática não indicam a redução da atividade fosfatásica por este composto. Estes dados foram confirmados após a avaliação da atividade das frações purificadas de homogenatos solubilizados de trofozoítos de E. histolytica, onde detectou-se a redução dos níveis de atividade enzimática após a adição de vanadato e seus derivados à reação, o que não pôde ser observado após o acréscimo de PAO. Os resultados obtidos indicam que PTPases estão diretamente envolvidas em importantes funções celulares exercidas por trofozoítos de Entamoeba histolytica. Ademais, novos estudos que visem à elucidação dos possíveis modos de ação do composto PAO neste patógeno poderiam contribuir, consideravelmente, com o entendimento da biologia do parasito e, consequentemente, dos mecanismos patogênicos da amebíase. / The microaerophilic protozoan Giardia lamblia inhabits the upper small intestine mucosa of vertebrate hosts, where it is exposed to different concentrations of oxygen. Despite the fermentative metabolism, Giardia trophozoites consume O2 and produce oxygen free radicals and therefore mechanism for detoxification are required. Devoid of glutathione, Giardia express high concentrations of cystein-rich proteins (CRP, also known as variable surface protein or VSP), as an antioxidant defense. This mechanism involves redox cycling for maintenance of a reduced intracellular environment and protection from oxidative stress. In this regard, substances that interfere in the antioxidant response of this protozoan could comprise a powerful chemotherapeutic strategy for Giardia lamblia infection. Here, we analyzed the effects of DETC, a superoxide dismutase (SOD) inhibitor, on parasite proliferation, thiol expression, lipid peroxidation, free radicals detection and cell architecture. DETC inhibited parasite proliferation at levels similar to metronidazole and induced peroxidation of membrane, possibly by the increase of reactive species.Ultrastructural alteration were also observed. Since this protozoan is devoid of SOD, here present data indicate SOD-independ DETC effects. Thiol groups detection with the fluorescent probe o-phthaldialdehyde (OPA). Cells treated with DETC displayed washed out cytoplasm and structures indicative of autophagy. The peripheral vesicles also had an increased volume, presumably caused by homophilic fusion. Taken together these data indicate that DETC enhance the oxidative stress in Giardia trophozoites by reacting with thiol groups.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5024_1.pdf: 448901 bytes, checksum: 4d971b7e87c950e13777aa7be6ce24c9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / Vários relatos da literatura revelam ser a prevalência de Entamoeba dispar maior do que Entamoeba histolytica nos indivíduos que vivem no Nordeste brasileiro, a partir de estudos utilizando Enzyme Linked Immnosorbent Assay (ELISA), imunodifusão em gel e zimodemos. Este trabalho consistiu em determinar a prevalência dessas formas de amebas mediante o uso de detecção imunocoprológica de antígeno específico para E. histolytica e Reaction Chain Polimerase (PCR) do DNA genômico extraído de trofozoitos cultivados de amostras de fezes. A presença de amebas tetranucleadas foi investigada em 1437 amostras de fezes de indivíduos vivendo em Macaparana, cidade da zona da mata norte de Pernambuco; em 346 amostras de escolares com idades de 3 a 14 anos morando em uma favela do Recife e em 109 amostras de imunodeprimidos (104 HIV positivos e 05 transplantados) atendidos no Hospital das Clínicas da UFPE (2002 e 2003). Dessas amostras, 59 (4.1%) e 45 (13%) foram positivas para aquelas coletadas das populações de Macaparana e das crianças do Recife, respectivamente, enquanto que nenhuma foi positiva para as obtidas dos imunodeprimidos. Todas as amostras foram negativas para a presença de adesina galactose específica de E. histolytica, inclusive as amostras dos pacientes imunosuprimidos. As amostras com amebas tetranucleadas cultivadas em meio de Robinson foram positivas para trofozoítos em 31 daquelas coletadas das populações de Macaparana e 21 das de Recife. A partir da amplificação por PCR de seqüências espécie-específicas de DNA genômico, extraído desses trofozoítos, foi possível identificar E. dispar em 23 e 19 amostras dos habitantes de Macaparana e das crianças do Recife, respectivamente, enquanto que nenhuma amplificação foi observada para E. histolytica. As demais amostras (08 e 02 paraMacaparana e Recife, respectivamente) foram negativas para ambas as espécies. Estes resultados corroboram aqueles previamente descritos que mostravam a prevalência de E. dispar (ameba não patogênica) nestas populações. Ademais, validam o emprego do kit imunocoprológico como alternativa a PCR na identificação de E. dispar e E. histolytica. Finalmente, o polimorfismo genético das cepas de E. dispar das amostras coletadas da população de Macaparana e de crianças do Recife foi investigado com o uso de marcadores moleculares específicos para E. dispar, Dsp1/Dsp2 e Dsp5/Dsp6. Das 42 amostras analisadas, 39 amplificaram os loci 1-2 e 5-6. O dendrograma resultante desta análise revelou uma alta variabilidade entre os isolados para esta região. Entretanto, uma comparação entre as freqüências dos produtos de amplificação para as duas localidades, através de teste de Qui-quadrado, mostrou que a incidência de uma banda obtida do locus 5-6, foi significativamente diferente entre Recife e Macaparana, evidenciando a potencialidade desta técnica para abordar questões relativas à distribuição geográfica

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Today's development of novel vaccines stresses the need for edible vaccines that are inexpensive, easily administered and capable of being stored and transported without refrigeration. Without these characteristics, developing countries find it difficult to adopt vaccination as the central strategy for preventing their most devastating diseases. A promising approach is the production of vaccines in plants we commonly consume. Two major obstacles have been encountered in developing vaccines in plants. First, the expression level of foreign antigens tends to be low and second, co-expression of an adjuvant may be required to facilitate an appropriate immune response. Ricin, a plant toxin that survives the human digestive process, has been proven to stimulate an immune response and could therefore serve as a suitable adjuvant. The long-term goal is to produce a vaccine that protects against the disease entamoebic dysentery. The specific goal of this research was to produce ricin in tobacco as adjuvant for the vaccine. Vectors were constructed that fused the ricin coding sequence to different plant promoters and transgenic tobacco plants were generated by transformation with Agrobacterium tumefaciens. The levels of expression in these transgenic plants were tested using immunoblot assays. Southern blot analysis was performed for the highest expressors of each construct. The enzymatic activity of the tobacco-synthesized ricin was shown using a protein translation inhibition assay. Expression of ricin was also confirmed using transient transformation of hairy root cultures. Future experiments will address the practical use of the tobacco-synthesized ricin as adjuvant, as well as the expression of the ricin B subunit fused to a protective antigen of Entamoeba histolytica in tobacco as edible vaccine. / Master of Science

Os trofozoítos de Entamoeba histolytica após se evadirem de uma complexa resposta imune ao nível da mucosa intestinal, invadem o epitélio, podendo disseminar-se pela circulação portal, atingindo o fígado e outros órgãos. A amebíase hepática é a forma mais comum de amebíase extraintestinal e corresponde a menos de 1% dos casos clínicos de amebíase. A modulação das respostas imunológicas frente à administração de substâncias farmacologicamente ativas em modelos experimentais infectados por diferentes patógenos tem contribuído de maneira importante nas investigações de terapias alternativas para colaborar no tratamento das diferentes doenças parasitárias. A melatonina (N-acetil-5- metoxitriptamina) é uma indolamina cuja síntese ocorre na glândula pineal e em vários locais extrapineais, como, as células do sistema imune, retina, medula óssea, pele, leucócitos, e trato gastrointestinal. É uma molécula pleiotrópica que possui atividades imunoestimulatórias e efeitos pró e anti-inflamatórios. O presente estudo teve como objetivo avaliar um possível efeito imunomodulatório subseqüente à administração oral de melatonina em ratos da linhagem Wistar machos infectados no fígado pela cepa HM1-IMSS de Entamoeba histolytica na fase aguda da amebíase hepática experimental. Foram utilizados vários parâmetros como: dosagens das citocinas IFN-?, IL-4, análise por citometria de fluxo das populações celulares TCD3+, TCD4+, TCD8+, CD45+, CD161+ e produção de óxido nítrico. Através dos resultados obtidos, podemos concluir que a melatonina exerceu seus efeitos imunomodulatórios, ora induzindo uma reposta imune mais eficaz de forma a minimizar os efeitos patogênicos da infecção ao mesmo tempo em que exerceu um papel anti-inflamatório na tentativa de manter a homeostase imunológica do hospedeiro, evitando uma exacerbação dessas respostas que certamente iriam influenciar o grau de patogenicidade desta parasitose. / The trophozoites of Entamoeba histolytica after evade a complex immune response at the intestinal mucosal level, invade the epithelial layer and may spread into the portal circulation reaching the liver and other organs. The amoebic liver abscess (ALA) is the most common form of the extraintestinal amebiasis and is less than 1% of clinical cases of human amoebiasis. The modulation of immune responses by the administration of pharmacological active substances in experimental models infected by different pathogens has contributed in investigations of alternative therapies in order to aid the treatment of various parasitic diseases. Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) is an indolamine whose synthesis occurs in the pineal gland and in several extra-pineal locations such as the immune system cells, retina, bone marrow, skin, leukocytes, and gastrointestinal tract. This molecule has pleiotropic effects with immunoenhancing actions besides pro and anti inflammatory effects. The present study aimed to evaluate a possible immunomodulatory effect following the oral administration of melatonin in male Wistar rats infected with the strain HM1-IMSS of E. histolytica during the acute phase of experimental amebic liver abscess. Several immune parameters were evaluated such as of cytokines IFN-?, IL-4, flow cytometry analysis of cell populations TCD3+, TCD4+, TCD8+, CD45+, CD161+, and nitric oxide production. According to our results, we can conclude that melatonin exerted its immunomodulatory actions, once triggering a more accurate host´s immune response reducing the pathogenic effects from the infection and at the same time, exerting an anti-inflammatory role in the attempt to control host´s immune homeostasis, avoiding an exacerbation of these responses that would certainly influence the degree of pathogenicity of this parasitosis.