Ziel dieser Arbeit war es, die intrinsische Innervation durch das enterische Nervensystem in den funktionell unterschiedlichen Vormagenbereichen Pansen, Haube und Schlundrinne beim Saug- und Mastlamm zu charakterisieren. Im ersten Teil der Arbeit wurden grundsätzliche Innervationsmerkmale wie die neurochemischen Kodierung der myenterischen Neurone ermittelt. Im zweiten Teil wurde beim Sauglamm untersucht, ob an der Innervation der Vormagenmuskulatur myenterische Neurone mit spezifischer neurochemischer Kodierung beteiligt sind. Beiden Fragestellungen wurde durch die Untersuchung von kultivierten Gewebeproben aus Pansen, Haube und Schlundrinne nachgegangen. Zur Identifizierung der Muskelneurone wurde in Verbindung mit der Gewebekultur eine retrograde Tracingmethode mit dem Fluoreszenzfarbstoff 1,1`-Didodecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat (DiI) angewandt. Zur Bestimmung der neurochemischen Kodierung wurden die Neurone auf ihre Immunreaktivität für Cholinazetyltransferase (ChAT), Stickstoffmonoxidsynthase (NOS), Substanz P (SP) und Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP) untersucht. Mit Hilfe dieses Ansatzes konnten die Populationen ChAT/SP, ChAT/-, NOS/VIP und NOS/- ermittelt werden. Die prozentualen Anteile der einzelnen Populationen wiesen dabei sowohl lokalisations- als auch altersabhängige Unterschiede auf. Während im Pansen und in der Haube des Sauglammes die meisten Neurone eine cholinerge Kodierung besaßen (Pansen: ChAT/SP 63% der Gesamtneuronenpopulation, ChAT/- 19%, NOS/VIP 17%, NOS/- <1%; Haube: ChAT/SP 64%, ChAT/- 24%, NOS/VIP 10%, NOS/- <1%), war in der Schlundrinne des Sauglammes die größte Population nitrerg (NOS/VIP 45%, NOS/- 17%, ChAT/SP 25%, ChAT/- 13%). In diesem Bereich des Vormagens traten die stärksten altersabhängigen Veränderungen der Populationsgrößen auf. So wies in der Schlundrinne des Mastlammes die Population NOS/VIP einen Anteil von 83% auf. Die Populationen ChAT/SP und ChAT/- waren nicht mehr nachweisbar. Eine moderate Zunahme der nitrergen Population war altersabhängig auch im Retikulorumen des Mastlammes feststellbar (Pansen: ChAT/SP 61%, ChAT/- 13%, NOS/VIP 24%, NOS/- <1%; Haube: ChAT/SP 62%, ChAT/- 21%, NOS/VIP 17%, NOS/- <1%). Die Applikation des Farbstoffs DiI auf die Vormagenmuskulatur (retrogrades Tracing) führte in allen drei untersuchten Kompartimenten zur Markierung von Muskelneuronen. Im Pansen besaßen die DiI-markierten Neurone hauptsächlich die Kodierungen ChAT/SP und NOS/VIP. In der Zirkulär- und in der Longitudinalmuskulatur waren 65% der Muskelneurone cholinerg und 35% waren nitrerg. Auch in der Haube wurden beide Muskelschichten vorwiegend durch Neurone der Population ChAT/SP innerviert (Zirkulärmuskelschicht: ChAT/SP 66%, NOS/VIP 18%; Längsmuskelschicht: ChAT/SP 63%, NOS/VIP 30%). Anders als im Pansen projizierte in der Haube ein größerer Anteil der rein cholinergen Neurone zur Muskulatur (Haube: Zirkulärmuskelschicht: 16%, Längsmuskelschicht: 7%; Pansen: 2% bzw. 5%). Sowohl im Pansen als auch in der Haube waren die markierten Muskelneurone beider Muskelschichten zu etwa gleichen Anteilen oral und aboral von der Applikationsstelle lokalisiert. In der Schlundrinne stammten die markierten Muskelneurone aus allen vier Populationen. Der prozentuale Anteil der nitrergen Muskelneurone war hier höher als im Retikulorumen (beide Muskelschichten: NOS/VIP 39%, NOS/- 17%, ChAT/SP 26%, ChAT/- 9%). Die meisten Muskelneurone waren aboral der Applikationsstelle lokalisiert und besaßen daher eine aszendierende Projektionsrichtung. Eine Polarität der aszendierenden und deszendierenden Projektionen konnte dabei in keinem der drei Kompartimente nachgewiesen werden. Es konnte somit gezeigt werden, dass im Vormagen myenterische Neurone unterschiedlicher neurochemischer Kodierungen existieren, die auch zur Innervation der glatten Muskulatur beitragen. Die prozentualen Anteile der einzelnen Populationen sind dabei von der Lokalisation und dem Alter und somit auch von der Funktion der einzelnen Vormagenkompartimente abhängig. Die altersabhängig veränderten Innervationsmuster weisen auf die Fähigkeit der enterischen Nerven hin, sich an die physiologischen Besonderheiten des Wiederkäuervormagens anzupassen. Sie spiegeln somit die neuronale Plastizität wieder.

Derzeit fehlen detaillierte Informationen über die Beteiligung submuköser Neuronen an der Regulation der epithelialen Barriere im proximalen Colon des Schweines. Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war, die neurochemische Kodierung des inneren und äußeren submukösen Plexus (ISMP und ASMP) in diesem Darmabschnitt zu untersuchen. Dies bezeichnet deren Eigenschaft, entsprechend ihrer jeweiligen Funktion, eine individuelle Kombination von mehreren Neurotransmittern zu exprimieren. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurde die Anzahl von Neuronen ermittelt, welche Acetylcholin (Detektion via Cholin-Acetyl-Transferase (ChAT)), Stickstoffmonoxid ((NO) Detektion via neuronaler Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS)), Neuropeptid Y (NPY), Somatostatin (SOM), Substanz P (SP) und vasoaktives intestinales Polypeptid (VIP) freisetzen können. Das zweite Ziel war es, ein Modellsystem zu entwickeln, in dem man die Wirkung der freigesetzten Neurotransmitter auf die Darmepithelzellen untersuchen kann. Hierzu wurde ein Protokoll zur in vitro-Kultivierung porziner Colon-Epithelzellen (CEZ) etabliert, welche die strukturellen Eigenschaften des polarisierten Colonepithels in vivo aufweisen. Als Parameter für die Barrierefunktion der CEZ diente der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER). Weiterhin wurde die Proliferationsaktivität der CEZ unter Neurotransmitter-Einfluss mittels Bromodesoxyuridin-ELISA bestimmt. Die Untersuchungen zur neurochemischen Kodierung offenbarten deutliche Unterschiede zwischen den beiden submukösen Plexūs. Während im ISMP überwiegend cholinerge und SP-positive Neurone zu finden waren, konnte im ASMP für jeden untersuchten Neurotransmitter mindestens ein Neuron pro Ganglion detektiert werden. Primäre CEZ konnten mittels Dispase bei 4°C isoliert und in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (4,5 g/L Glukose, 10 % Kälberserum) kultiviert werden. Der epitheliale Charakter der kultivierten Zellen konnte immunhistochemisch anhand der Expression des Tight junction-assoziierten Proteins Zonula occludens 1 und Epithelzell-typischen Cytokeratinen verifiziert werden. Die strukturelle und funktionelle Polarisierung der kultivierten CEZ war mittels Elektronen- und konfokal-mikroskopischen Aufnahmen als auch transepithelialen Potentialmessungen nachweisbar. NPY, SOM, SP und VIP übten keinen langfristigen Einfluss auf TEER und Proliferationsaktivität der CEZ aus. Im Gegensatz dazu steigerte der cholinerge Agonist Carbachol (CA) deutlich den TEER und hemmte leicht die Proliferationsaktivität der CEZ im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Der Effekt war jedoch nicht eindeutig konzentrationsabhängig. Der muskarinerge Rezeptorantagonist Atropin verhinderte nicht nur die CA-induzierten Effekte, sondern reduzierte selbst signifikant den TEER-Werte der CEZ. Dies weist auf eine autokrine Regulation der CEZ durch endogenes Acetylcholin hin. Die Applikation niedrigerer Konzentrationen des NO-Donors Sodium-Nitroprussid (SNP) erhöhte den TEER der CEZ gegenüber der unbehandelten Kontrolle, während höhere SNP-Dosen den TEER senkten. Es wurden klare Indizien für die Beteiligung cholinerger ISMP-Neurone an der Kontrolle mukosaler Prozesse in vivo gefunden. NO scheint ebenfalls einen Effekt auf die epithelialen Barriere, zu haben, allerdings sind submuköse Neuronen als direkte Quelle unwahrscheinlich.:I. Inhaltsverzeichnis 1 II. Abkürzungen xi 1. Einleitung 1 1.1. Aufbau der epithelialen Barriere im Colon 2 1.2. Tight Junctions (TJs) 4 1.3. Der transepitheliale elektrische Widerstand als Parameter der epithelialen Integrität 7 1.4. Bau und Struktur des Enterischen Nervensystems (ENS) 10 1.5. Neurochemische Kodierung 13 1.6. Funktionen des ENS 17 1.7. Das ENS als möglicher Regulator epithelialer Funktionen 18 2. Zielstellung 23 3. Material und Methoden 25 3.1. Versuchstiere und Organentnahme 25 3.2. Versuchsabschnitt: Analyse der neurochemischen Kodierung im submukösen Plexus des porzinen proximalen Colons 25 3.2.1. Gewebekultur 25 3.2.2. Gewebepräparation 26 3.2.3. Immunhistochemie 26 3.2.4. Spezifität der Antikörper 28 3.2.5. NADPH-Diaphorase-Färbung 28 3.2.6. Bestimmung der neuronalen Dichte 29 3.2.7. Bestimmung der absoluten Häufigkeiten immunreaktiver Neurone 29 3.2.8. Analyse der neurochemischen Kodierung 29 3.2.9. Gefrierschnitte 31 3.2.10. Statistische Auswertung 32 3.3. Versuchsabschnitt: Einfluss submuköser Neurotransmitter auf den TEER und die Proliferation im porzinen Colonepithel 33 3.3.1. Etablierung einer primären Colon-Epithelzellkultur 33 3.3.1.1. Isolation von Colonepithelzellen mit Dispase II 33 3.3.1.2. Zellkulturmedien 34 3.3.1.3. Aussaat 35 3.3.1.4. Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) 35 3.3.1.5. Potentialmessungen 37 3.3.1.6. Proliferationsassay 38 3.3.1.7. Immunhistochemische Färbungen von kultivierten Colonepithelzellen 38 3.3.1.8. Mikroskopische Analyse der Präparate 40 3.3.1.9. Beurteilung der ZO-1/Fibronektin-Konfluenz 40 3.3.1.10. Konfokal-Mikroskopie 40 3.3.1.11. Rasterelektronenmikroskopie (REM) 40 3.3.1.12. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 40 3.3.2. Untersuchung des Einflusses von enterischen Neurotransmittern auf den TEER und die Proliferation primär kultivierter, porziner Colonepithelzellen 41 3.3.2.1. Einfluss enterischer Neurotransmitter auf den TEER kultivierter CEZ 41 3.3.2.2. Einfluss enterischer Neurotransmitter auf die Proliferation von kultivierten CEZ 42 3.3.2.3. Molekularbiologische Analyse 42 3.3.2.4. Darstellung der Ergebnisse und Statistische Auswertung 44 4. Ergebnisse 47 4.1. Analyse der neurochemischen Kodierung im submukösen Plexus des porzinen proximalen Colons 47 4.1.1. Neuronale Dichte und allgemeine Struktur der submukösen Plexūs im porzinen Colon 47 4.1.2. Absolute Anzahl immunreaktiver Neurone im submukösen Plexus des porzinen Colons 48 4.1.3. Neurochemisch identifizierte Subpopulationen im ISMP 53 4.1.4. Neurochemisch identifizierte Subpopulationen im ASMP 56 4.1.5. Projektionen neuronaler Fasern 57 4.1.6. Zusammenfassung der Ergebnisse des ersten Versuchsabschnittes 62 4.2. Einfluss submuköser Neurotransmitter auf den TEER und die Proliferation im porzinen Colon 63 4.2.1. Etablierung und Charakterisierung einer primären Colon-Epithelzellkultur 63 4.2.1.1. Zellkulturmedien 63 4.2.1.2. Modulierbarkeit des TEER 69 4.2.1.2. Epithelialer Charakter der kultivierten CEZ 71 4.2.1.3. Korrelation von TEER und CEZ- bzw. Fibroblasten-Konfluenz 73 4.2.1.4. Polarisierung der kultivierte CEZ 76 4.2.2. Untersuchung des Einflusses von enterischen Neurotransmittern auf den TEER und die Proliferation von primär kultivierten, porzinen Colonepithelzellen 82 4.2.2.1. Einfluss enterischer Neurotransmitter auf den TEER kultivierter CEZ 82 4.2.2.2. Einfluss enterischer Neurotransmitter auf die Proliferation von kultivierten CEZ 86 4.2.2.3. Modulation des Carbachol-Effektes auf den TEER und die Proliferation von kultivierten CEZ 88 4.2.2.4. Molekularbiologische Analyse 91 5. Diskussion 93 5.1. Analyse der neurochemischen Kodierung im submukösen Plexus des porzinen proximalen Colons 93 5.1.1. Methodische Aspekte 93 5.1.2. Allgemeine Struktur und neuronale Dichte der submukösen Plexūs im porzinen Colon 94 5.1.3. Neurochemische Kodierung im ISMP des porzinen Colons 96 5.1.3.1. ACh/ChAT im ISMP 97 5.1.3.2. SP im ISMP 97 5.1.3.3. nNOS im ISMP 98 5.1.3.4. VIP im ISMP 99 5.1.3.5. SOM im ISMP 100 5.1.3.6. NPY im ISMP 101 5.1.4. Neurochemische Kodierung im ASMP des porzinen Colons 101 5.1.4.1. ACh/ChAT und SP im ASMP 102 5.1.4.2. nNOS im ASMP 103 5.1.4.3. VIP im ASMP 104 5.1.4.4. SOM im ASMP 104 5.1.4.5. NPY im ASMP 105 5.1.5. Nicht identifizierte Neurone 105 5.1.6. Vergleich zur Situation im humanen Colon 106 5.2. Einfluss submuköser Neurotransmitter auf den TEER und die Proliferation im porzinen Colon 109 5.2.1. Etablierung einer primären Colon-Epithelzellkultur 109 5.2.1.1. Isolationsmethoden und Zellkulturmedien 109 5.2.1.2. Epithelialer Charakter der kultivierten CEZ 115 5.2.2. Untersuchung des Einflusses enterischer Neurotransmitter auf den TEER und die Proliferation von primär kultivierten porzinen Colonepithelzellen 117 5.2.2.1. TEER unbehandelter Zellen 117 5.2.2.2. Carbachol-Effekte 118 5.2.2.2.1. Einfluss von Carbachol auf den TEER-Wert 118 5.2.2.2.2. Einfluss von Carbachol auf die Proliferation 122 5.2.2.3. NO-Effekte 123 5.2.2.3.1. Einfluss von SNP auf den TEER-Wert 123 5.2.2.3.2. TEER-Anstieg unter niedrigen SNP-Konzentrationen 124 5.2.2.3.3. TEER-Senkung unter höheren SNP-Konzentrationen 126 5.2.2.3.4. Einfluss von SNP auf die Proliferation 130 5.2.2.3.5. Quelle für NO in vivo 130 5.2.2.4. Effekte von NPY, Substanz P, Somatostatin und VIP 133 6. Zusammenfassung 139 7. Summary 145 8. Literaturverzeichnis 151 9. Selbstständigkeitserklärung 167 10. Wissenschaftlicher Werdegang 169 12. Danksagung 175

Die Stamm- und Vorläuferzellen, im Weiteren als Progenitoren bezeichnet, des humanen Darms treten seit einigen Jahrzehnten immer stärker in den Fokus der Forschung. Mit der Entdeckung von Progenitorzellen im zentralen Nervensystem in den 60er Jahren des 20. Jahrhunderts kamen auch Bestrebungen auf, im peripheren Nervensystem nach Progenitoren zu suchen. Bald darauf, zu Beginn des 21. Jahrhunderts, wurden Sie entdeckt. Diese Population von Zellen bietet eine vielversprechende Möglichkeit, aus adultem Darmgewebe Progenitorzellen zu isolieren und diese therapeutisch, bei einer Vielzahl gastroenterologischer Erkrankungen, autolog einzusetzen. Derzeit werden auch andere mögliche Stamm- und Vorläuferzellen evaluiert. Die vorliegende Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zur Charakterisierung humaner, enterischer, neuraler Progenitorzellen. Dies ist essentiell für eine mögliche, klinische Translation. Es gelang, die in vitro Kulturbedingungen der isolierten, humanen Zellen durch Wachstumsfaktorenzugabe und Supplemente zu verbessern und ermöglicht so auch ein besseres Verständnis der in vivo-Situation. Weiterhin wurde das sich verändernde enterische Nervensystem des humanen Darms, in verschiedenen Altersstufen, spezifisch isoliert und analysiert. Es konnten neuartige Befunde zum Verlust von neuronalen Zellen im Allgemeinen und der charakteristische Verlust von NOS-Neuronen im Speziellen erhoben werden. Erstmals beobachtet wurde die Erhöhung der Genexpression für Gliazellen im gealterten ENS. Die gewonnen Erkenntnisse wurden weiterhin in einer in vivo-Transplantationsstudie angewendet. In ein Mausmodell mit einem chemisch geschädigten Darmnerensystem wurden postnatale, humane Progenitoren eingebracht und es gelang der Beweis einer verbesserten Funktionalität durch Integration von neugebildeten Neuronen, Glia und Muskelzellen.

Wiederkäuer können entsprechend ihrer Ernährungsgewohnheiten in Rauhfutterfresser, Konzentrat-selektierer und Intermediärtypen eingeteilt werden (HOFMANN 1989). Diese verschiedenen Ernährungstypen spiegeln sich in anatomischen Unterschieden des gesamten Gastrointestinaltraktes, insbesondere jedoch in der Vormagenanatomie wider. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die intrinsische Innervation des Pansens von Wiederkäuern des Rauhfutterfresser- und Intermediärtyps näher zu charakterisieren und mögliche Unterschiede zwischen diesen beiden Ernährungstypen aufzuzeigen. Dafür wurden im ersten Teil der Arbeit die Expression des generellen Neuronenmarkers HuC/D, der Syntheseenzyme Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) und Cholinazetyltransferase (ChAT), sowie der Neuropeptide und der neuronalen Marker Neuropeptid Y (NPY), Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP), Somatostatin (SOM) und Calbindin (Calb) an Häutchenpräparaten (whole mounts) des myenterischen Plexus aus dem Pansen der Rauhfutterfresser Schaf und Rind und der Intermediärtypen Ziege und Damwild immunhistochemisch untersucht. Desweiteren wurden die Parameter Gangliengröße (Neurone/Ganglion), Gangliendichte (Ganglien/cm² Plexusfläche) und Neuronendichte (Neurone/cm² Plexusfläche) der genannten Spezies tierartlich vergleichend erfasst. Beim Rind fanden sich mit 73±6 Neuronen/Ganglion (Mittelwert ± Standardabweichung) signifikant größere Ganglien als bei den kleinen Wiederkäuern Ziege (57±19), Damwild (51±20) und Schaf (45±18). Demgegenüber war die mittlere Gangliendichte beim Rind mit 6±1 Ganglien/cm² Plexusfläche signifikant geringer als bei Schaf (8±2) und Ziege (10±3), die wiederum eine signifikant geringere Gangliendichte als das Damwild mit 15±3 Ganglien/cm² Plexusfläche aufwiesen. Die Neuronendichte war im ventralen Pansensack von Damwild und Ziege (664±194 bzw. 584±295 Neuronen/cm² Plexusfläche) signifikant höher als beim Schaf (289±132). Die Neuronendichte des Rindes lag mit 432±238 Neuronen/cm² Plexusfläche zwischen den Werten der anderen Spezies. Alle untersuchten myenterischen Neurone waren entweder cholinerg oder nitrerg kodiert. Der relative Anteil nitrerger Neurone pro Ganglion war bei der Ziege (44±10 %) signifikant höher als beim Schaf (30±8 %). Dementsprechend war der relative Anteil cholinerger Neurone beim Schaf signifikant höher als bei der Ziege. Neben den Anteilen unterschied sich auch die Verteilung der nitrergen Neurone in den myenterischen Ganglien. Bei Rind und Ziege waren diese in Clustern am Rand der Ganglien angeordnet, während sie bei Schaf und Damwild locker über die Ganglienfläche verteilt erschienen. Mit Hilfe von Kolokalisationsuntersuchungen konnten bei allen untersuchten Spezies folgende Hauptneuronenpopulationen nachgewiesen werden: ChAT/SP>NOS/NPY/VIP>>ChAT/- und NOS/NPY. Dabei war die cholinerge Hauptpopulation ChAT/SP beim Schaf mit 67±7 % aller myenterischen Neurone signifikant stärker ausgeprägt als beim Damwild (58±11 %), während die nitrerge Hauptpopulation NOS/NPY/VIP bei der Ziege mit 40±9 % signifikant stärker als beim Schaf (26±6 %) ausgeprägt war. SOM und Calbindin fanden sich nur in einer sehr geringen Anzahl (vornehmlich cholinerger) Neurone, wobei SOM–positive Somata nur bei Damwild und Schaf nachgewiesen werden konnten. Im myenterischen Plexus von Rind und Ziege fanden sich ausschließlich Somatostatin-positive Nervenfasern. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Reaktionen von Zirkulärmuskelstreifen aus dem ventralen Pansensack von Schaf und Ziege auf Elektrische Feldstimulation nach Zugabe von Atropin bzw. L-NAME (NG-Nitro-L-Arginine Methylester Hydrochlorid), sowie die Reaktionen auf steigende Konzentrationen von Carbachol funktionell untersucht. Bei beiden Spezies führte Atropin zu verminderten, L-NAME zu verstärkten Kontraktionen als Reaktion auf Elektrische Feldstimulationen. Der muskarinerge Agonist Carbachol führte im Schaf- und Ziegenpansen zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der Motilität. Die Ergebnisse der neurochemischen Untersuchungen lassen auf eine stärkere cholinerge (und somit exzitatorische Kontrolle) des Pansens des Rauhfutterfressers Schaf im Vergleich zu Ziege und Damwild (Intermediärtypen) schließen. Die mikrobielle Fermentation grob strukturierten Rauhfutters erfordert starke, mixende Pansenkontraktionen. Es ist zu vermuten, dass ein höherer Anteil cholinerger myenterischer Neurone auch stärkere Pansenkontraktionen ermöglicht. Somit wäre die starke Ausprägung der cholinergen Innervation im Pansen des Rauhfutterfressers Schaf als eine Anpassung an die physikomechanischen Eigenschaften der bevorzugten Nahrungsquelle Gras zu sehen. Allerdings gelang es in der vorliegenden Arbeit nicht, diese Hypothese durch Unterschiede der in-vitro Motilität an ovinen und caprinen Pansenmuskelstreifen zu untermauern. In scheinbarem Widerspruch zu dieser Hypothese stand auch die nur gering ausgeprägte cholinerge Dominanz bei dem untersuchten großen Rauhfutterfresser Rind. Allerdings könnte diese genetisch bedingt sein, da es sich bei den untersuchten Proben um Material von auf hohe Milchleistung (und damit Konzentratverdaulichkeit) gezüchteten Rinderrassen handelte. Auch ein direkter diätetischer Einfluss auf die intrinsische Panseninnervation scheint in diesem Zusammenhang denkbar. Diese Annahme gründet sich auf Untersuchungen an kleinen Labornagern, bei denen die Aufnahme hoher Energiemengen zu einem Verlust enterischer cholinerger Neurone – und somit zu einem relativ höheren Anteil nitrerger Neurone führt. Deshalb sollte bei allen untersuchten Spezies neben einem möglichen genetischen Einfluss auch der Einfluss der Fütterung nicht außer Acht gelassen werden. Klarheit könnte hier neben vergleichenden Untersuchungen an Extensiv- und Hochleistungsrinderrassen auch die Untersuchung des Einflusses von bestimmten Fütterungsregimen auf die enterische Panseninnervation bringen.

Ziel dieser Arbeit war es, die intrinsische Innervation durch das enterische Nervensystem in den funktionell unterschiedlichen Vormagenbereichen Pansen, Haube und Schlundrinne beim Saug- und Mastlamm zu charakterisieren. Im ersten Teil der Arbeit wurden grundsätzliche Innervationsmerkmale wie die neurochemischen Kodierung der myenterischen Neurone ermittelt. Im zweiten Teil wurde beim Sauglamm untersucht, ob an der Innervation der Vormagenmuskulatur myenterische Neurone mit spezifischer neurochemischer Kodierung beteiligt sind. Beiden Fragestellungen wurde durch die Untersuchung von kultivierten Gewebeproben aus Pansen, Haube und Schlundrinne nachgegangen. Zur Identifizierung der Muskelneurone wurde in Verbindung mit der Gewebekultur eine retrograde Tracingmethode mit dem Fluoreszenzfarbstoff 1,1`-Didodecyl-3,3,3'',3''-Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat (DiI) angewandt. Zur Bestimmung der neurochemischen Kodierung wurden die Neurone auf ihre Immunreaktivität für Cholinazetyltransferase (ChAT), Stickstoffmonoxidsynthase (NOS), Substanz P (SP) und Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP) untersucht. Mit Hilfe dieses Ansatzes konnten die Populationen ChAT/SP, ChAT/-, NOS/VIP und NOS/- ermittelt werden. Die prozentualen Anteile der einzelnen Populationen wiesen dabei sowohl lokalisations- als auch altersabhängige Unterschiede auf. Während im Pansen und in der Haube des Sauglammes die meisten Neurone eine cholinerge Kodierung besaßen (Pansen: ChAT/SP 63% der Gesamtneuronenpopulation, ChAT/- 19%, NOS/VIP 17%, NOS/- <1%; Haube: ChAT/SP 64%, ChAT/- 24%, NOS/VIP 10%, NOS/- <1%), war in der Schlundrinne des Sauglammes die größte Population nitrerg (NOS/VIP 45%, NOS/- 17%, ChAT/SP 25%, ChAT/- 13%). In diesem Bereich des Vormagens traten die stärksten altersabhängigen Veränderungen der Populationsgrößen auf. So wies in der Schlundrinne des Mastlammes die Population NOS/VIP einen Anteil von 83% auf. Die Populationen ChAT/SP und ChAT/- waren nicht mehr nachweisbar. Eine moderate Zunahme der nitrergen Population war altersabhängig auch im Retikulorumen des Mastlammes feststellbar (Pansen: ChAT/SP 61%, ChAT/- 13%, NOS/VIP 24%, NOS/- <1%; Haube: ChAT/SP 62%, ChAT/- 21%, NOS/VIP 17%, NOS/- <1%). Die Applikation des Farbstoffs DiI auf die Vormagenmuskulatur (retrogrades Tracing) führte in allen drei untersuchten Kompartimenten zur Markierung von Muskelneuronen. Im Pansen besaßen die DiI-markierten Neurone hauptsächlich die Kodierungen ChAT/SP und NOS/VIP. In der Zirkulär- und in der Longitudinalmuskulatur waren 65% der Muskelneurone cholinerg und 35% waren nitrerg. Auch in der Haube wurden beide Muskelschichten vorwiegend durch Neurone der Population ChAT/SP innerviert (Zirkulärmuskelschicht: ChAT/SP 66%, NOS/VIP 18%; Längsmuskelschicht: ChAT/SP 63%, NOS/VIP 30%). Anders als im Pansen projizierte in der Haube ein größerer Anteil der rein cholinergen Neurone zur Muskulatur (Haube: Zirkulärmuskelschicht: 16%, Längsmuskelschicht: 7%; Pansen: 2% bzw. 5%). Sowohl im Pansen als auch in der Haube waren die markierten Muskelneurone beider Muskelschichten zu etwa gleichen Anteilen oral und aboral von der Applikationsstelle lokalisiert. In der Schlundrinne stammten die markierten Muskelneurone aus allen vier Populationen. Der prozentuale Anteil der nitrergen Muskelneurone war hier höher als im Retikulorumen (beide Muskelschichten: NOS/VIP 39%, NOS/- 17%, ChAT/SP 26%, ChAT/- 9%). Die meisten Muskelneurone waren aboral der Applikationsstelle lokalisiert und besaßen daher eine aszendierende Projektionsrichtung. Eine Polarität der aszendierenden und deszendierenden Projektionen konnte dabei in keinem der drei Kompartimente nachgewiesen werden. Es konnte somit gezeigt werden, dass im Vormagen myenterische Neurone unterschiedlicher neurochemischer Kodierungen existieren, die auch zur Innervation der glatten Muskulatur beitragen. Die prozentualen Anteile der einzelnen Populationen sind dabei von der Lokalisation und dem Alter und somit auch von der Funktion der einzelnen Vormagenkompartimente abhängig. Die altersabhängig veränderten Innervationsmuster weisen auf die Fähigkeit der enterischen Nerven hin, sich an die physiologischen Besonderheiten des Wiederkäuervormagens anzupassen. Sie spiegeln somit die neuronale Plastizität wieder.

Die Stamm- und Vorläuferzellen, im Weiteren als Progenitoren bezeichnet, des humanen Darms treten seit einigen Jahrzehnten immer stärker in den Fokus der Forschung. Mit der Entdeckung von Progenitorzellen im zentralen Nervensystem in den 60er Jahren des 20. Jahrhunderts kamen auch Bestrebungen auf, im peripheren Nervensystem nach Progenitoren zu suchen. Bald darauf, zu Beginn des 21. Jahrhunderts, wurden Sie entdeckt. Diese Population von Zellen bietet eine vielversprechende Möglichkeit, aus adultem Darmgewebe Progenitorzellen zu isolieren und diese therapeutisch, bei einer Vielzahl gastroenterologischer Erkrankungen, autolog einzusetzen. Derzeit werden auch andere mögliche Stamm- und Vorläuferzellen evaluiert. Die vorliegende Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zur Charakterisierung humaner, enterischer, neuraler Progenitorzellen. Dies ist essentiell für eine mögliche, klinische Translation. Es gelang, die in vitro Kulturbedingungen der isolierten, humanen Zellen durch Wachstumsfaktorenzugabe und Supplemente zu verbessern und ermöglicht so auch ein besseres Verständnis der in vivo-Situation. Weiterhin wurde das sich verändernde enterische Nervensystem des humanen Darms, in verschiedenen Altersstufen, spezifisch isoliert und analysiert. Es konnten neuartige Befunde zum Verlust von neuronalen Zellen im Allgemeinen und der charakteristische Verlust von NOS-Neuronen im Speziellen erhoben werden. Erstmals beobachtet wurde die Erhöhung der Genexpression für Gliazellen im gealterten ENS. Die gewonnen Erkenntnisse wurden weiterhin in einer in vivo-Transplantationsstudie angewendet. In ein Mausmodell mit einem chemisch geschädigten Darmnerensystem wurden postnatale, humane Progenitoren eingebracht und es gelang der Beweis einer verbesserten Funktionalität durch Integration von neugebildeten Neuronen, Glia und Muskelzellen.

Wiederkäuer können entsprechend ihrer Ernährungsgewohnheiten in Rauhfutterfresser, Konzentrat-selektierer und Intermediärtypen eingeteilt werden (HOFMANN 1989). Diese verschiedenen Ernährungstypen spiegeln sich in anatomischen Unterschieden des gesamten Gastrointestinaltraktes, insbesondere jedoch in der Vormagenanatomie wider. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die intrinsische Innervation des Pansens von Wiederkäuern des Rauhfutterfresser- und Intermediärtyps näher zu charakterisieren und mögliche Unterschiede zwischen diesen beiden Ernährungstypen aufzuzeigen. Dafür wurden im ersten Teil der Arbeit die Expression des generellen Neuronenmarkers HuC/D, der Syntheseenzyme Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) und Cholinazetyltransferase (ChAT), sowie der Neuropeptide und der neuronalen Marker Neuropeptid Y (NPY), Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP), Somatostatin (SOM) und Calbindin (Calb) an Häutchenpräparaten (whole mounts) des myenterischen Plexus aus dem Pansen der Rauhfutterfresser Schaf und Rind und der Intermediärtypen Ziege und Damwild immunhistochemisch untersucht. Desweiteren wurden die Parameter Gangliengröße (Neurone/Ganglion), Gangliendichte (Ganglien/cm² Plexusfläche) und Neuronendichte (Neurone/cm² Plexusfläche) der genannten Spezies tierartlich vergleichend erfasst. Beim Rind fanden sich mit 73±6 Neuronen/Ganglion (Mittelwert ± Standardabweichung) signifikant größere Ganglien als bei den kleinen Wiederkäuern Ziege (57±19), Damwild (51±20) und Schaf (45±18). Demgegenüber war die mittlere Gangliendichte beim Rind mit 6±1 Ganglien/cm² Plexusfläche signifikant geringer als bei Schaf (8±2) und Ziege (10±3), die wiederum eine signifikant geringere Gangliendichte als das Damwild mit 15±3 Ganglien/cm² Plexusfläche aufwiesen. Die Neuronendichte war im ventralen Pansensack von Damwild und Ziege (664±194 bzw. 584±295 Neuronen/cm² Plexusfläche) signifikant höher als beim Schaf (289±132). Die Neuronendichte des Rindes lag mit 432±238 Neuronen/cm² Plexusfläche zwischen den Werten der anderen Spezies. Alle untersuchten myenterischen Neurone waren entweder cholinerg oder nitrerg kodiert. Der relative Anteil nitrerger Neurone pro Ganglion war bei der Ziege (44±10 %) signifikant höher als beim Schaf (30±8 %). Dementsprechend war der relative Anteil cholinerger Neurone beim Schaf signifikant höher als bei der Ziege. Neben den Anteilen unterschied sich auch die Verteilung der nitrergen Neurone in den myenterischen Ganglien. Bei Rind und Ziege waren diese in Clustern am Rand der Ganglien angeordnet, während sie bei Schaf und Damwild locker über die Ganglienfläche verteilt erschienen. Mit Hilfe von Kolokalisationsuntersuchungen konnten bei allen untersuchten Spezies folgende Hauptneuronenpopulationen nachgewiesen werden: ChAT/SP>NOS/NPY/VIP>>ChAT/- und NOS/NPY. Dabei war die cholinerge Hauptpopulation ChAT/SP beim Schaf mit 67±7 % aller myenterischen Neurone signifikant stärker ausgeprägt als beim Damwild (58±11 %), während die nitrerge Hauptpopulation NOS/NPY/VIP bei der Ziege mit 40±9 % signifikant stärker als beim Schaf (26±6 %) ausgeprägt war. SOM und Calbindin fanden sich nur in einer sehr geringen Anzahl (vornehmlich cholinerger) Neurone, wobei SOM–positive Somata nur bei Damwild und Schaf nachgewiesen werden konnten. Im myenterischen Plexus von Rind und Ziege fanden sich ausschließlich Somatostatin-positive Nervenfasern. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Reaktionen von Zirkulärmuskelstreifen aus dem ventralen Pansensack von Schaf und Ziege auf Elektrische Feldstimulation nach Zugabe von Atropin bzw. L-NAME (NG-Nitro-L-Arginine Methylester Hydrochlorid), sowie die Reaktionen auf steigende Konzentrationen von Carbachol funktionell untersucht. Bei beiden Spezies führte Atropin zu verminderten, L-NAME zu verstärkten Kontraktionen als Reaktion auf Elektrische Feldstimulationen. Der muskarinerge Agonist Carbachol führte im Schaf- und Ziegenpansen zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der Motilität. Die Ergebnisse der neurochemischen Untersuchungen lassen auf eine stärkere cholinerge (und somit exzitatorische Kontrolle) des Pansens des Rauhfutterfressers Schaf im Vergleich zu Ziege und Damwild (Intermediärtypen) schließen. Die mikrobielle Fermentation grob strukturierten Rauhfutters erfordert starke, mixende Pansenkontraktionen. Es ist zu vermuten, dass ein höherer Anteil cholinerger myenterischer Neurone auch stärkere Pansenkontraktionen ermöglicht. Somit wäre die starke Ausprägung der cholinergen Innervation im Pansen des Rauhfutterfressers Schaf als eine Anpassung an die physikomechanischen Eigenschaften der bevorzugten Nahrungsquelle Gras zu sehen. Allerdings gelang es in der vorliegenden Arbeit nicht, diese Hypothese durch Unterschiede der in-vitro Motilität an ovinen und caprinen Pansenmuskelstreifen zu untermauern. In scheinbarem Widerspruch zu dieser Hypothese stand auch die nur gering ausgeprägte cholinerge Dominanz bei dem untersuchten großen Rauhfutterfresser Rind. Allerdings könnte diese genetisch bedingt sein, da es sich bei den untersuchten Proben um Material von auf hohe Milchleistung (und damit Konzentratverdaulichkeit) gezüchteten Rinderrassen handelte. Auch ein direkter diätetischer Einfluss auf die intrinsische Panseninnervation scheint in diesem Zusammenhang denkbar. Diese Annahme gründet sich auf Untersuchungen an kleinen Labornagern, bei denen die Aufnahme hoher Energiemengen zu einem Verlust enterischer cholinerger Neurone – und somit zu einem relativ höheren Anteil nitrerger Neurone führt. Deshalb sollte bei allen untersuchten Spezies neben einem möglichen genetischen Einfluss auch der Einfluss der Fütterung nicht außer Acht gelassen werden. Klarheit könnte hier neben vergleichenden Untersuchungen an Extensiv- und Hochleistungsrinderrassen auch die Untersuchung des Einflusses von bestimmten Fütterungsregimen auf die enterische Panseninnervation bringen.

Einleitung: Das kontrollierte Zusammenspiel zwischen glatter Muskulatur und enterischen Nervenzellen ist eine essentielle Voraussetzung für einen auf die Erfordernisse der Verdauungsprozesse angepassten Transport des Chymus im Magen-Darm-Kanal. Obwohl es zahlreiche Untersuchungen zu den einzelnen Komponenten dieses Zusammenspiels gibt, liegen nur wenige Erkenntnisse zur simultanen Steuerung der Zirkulär- (ZM) und Longitudinalmuskulatur (LM) durch nervale Komponenten vor. Aus meiner Diplomarbeit war für diesen Zweck ein neues Messsystem hervorgegangen, das simultane Motilitätsableitungen an den verschiedenen Muskelschichten im Darm ermöglicht. Ziele der Untersuchungen: In der vorliegenden Arbeit sollte das neue Messystem zur funktionellen Charakterisierung intrinsischer nervaler Schaltkreise insbesondere im Hinblick auf die Beteiligung cholinerger und nitrerger enterischer Nervenzellen am porcinen Colon angewendet und evaluiert und mit der bisher verfügbaren, eindimensionalen Messmethode verglichen werden. Tiere, Material und Methoden: Die Untersuchungen erfolgten an Präparationen aus dem distalen Colon 21 adulter Schlachtschweine. Die Präparate bestanden aus ZM und LM und dem dazwischen liegenden myenterischen Plexus. Als Referenzmethode wurde die bisher standardmäßig eingesetzte eindimensionale Messmethode (Apparatur 1) angewendet. Diese beurteilte die Colonmotilität für ZM und LM getrennt voneinander, in je 2 Organbädern je Muskulaturrichtung, an Präparationen mit einer Größe von 1x3 cm. Mit dem neuen Messsystem (Apparatur 2) erfolgten simultane, zweidimensionale Motilitätsmessungen an je drei Messpunkten der ZM bzw. LM im Abstand von 2 cm innerhalb eines größeren Darmpräparates (5x5 cm). In beiden Messapparaturen wurden mittels elektrischer Feldstimulation (EFS) evozierte Nerv-Muskel-Antworten hervorgerufen. Diese EFS-Antworten setzten sich aus einer ON-Kontraktion (während der Stimulation) und einer OFF-Kontraktion (im unmittelbaren Anschluss an die Stimulation) zusammen. In Apparatur 2 erfolgte die EFS lokal an drei verschiedenen Positionen im Präparat. Es wurden in N=15 Versuchsansätzen vergleichende Untersuchungen zwischen Apparatur 1 und 2 zur Spontanmotilität sowie zu den nach EFS erzeugten Nerv-Muskel-Antworten gemacht. Um die Beteiligung intrinsischer cholinerger und nitrerger Komponenten in der Kontrolle der Darmmotilität zu untersuchen, wurden sowohl der Einfluss der cholinergen Antagonisten Atropin und Hexamethonium als auch eine Hemmung der NO- Synthese durch L-NAME (NG Nitro L arginine methylester Hydrochlorid) in je 3 Konzentrationsstufen und N=5 Versuchsansätzen je Hemmstoff erfasst. Für die statistische Analyse wurden nichtparametrischen Verfahren verwendet. Für Einstichprobentests wurde der Wilcoxon-Vorzeichenrangtest genutzt und zur Testung nach Unterschieden innerhalb von Gruppen der Test nach Friedman und der Post-hoc Test nach Wilcoxon mit angepasstem Signifikanzniveau für Mehrfachvergleiche nach Bonferroni. Paarweise Vergleiche erfolgten durch den Wilcoxon-Test. Ergebnisse wurden als statistisch signifikant bezeichnet, wenn das Signifikanzniveau (p) < 0,05 war. Ergebnisse: Apparatur 1 und 2 lieferten unter Kontrollbedingungen qualitativ gleichwertige Messergebnisse sowohl für die Spontanmotilität als auch für die EFS-Antworten an ZM und LM. Die Spontanmotilität wurde in beiden Messapparaturen durch die Hemmstoffe kaum beeinflusst. Zwischen den Messmethoden bestanden insbesondere an der LM teils signifikante Unterschiede in der Hemmstoffwirkung. Alle drei Hemmstoffe hatten an der LM in Apparatur 1 einen erregenden Einfluss auf die Spontanmotilität sowie die OFF-Antworten, während mit Apparatur 2 ein hemmender Einfluss festgestellt wurde. Mit Apparatur 2 gelang es, lokal begrenzt im Abstand von 2 cm enterische Neurone durch EFS zu erregen und deren Muskel-Antworten am Ort der Stimulation wie auch an weiter entfernten Messorten oral und anal der Stimulationsstelle zu detektieren. Unter Kontrollbedingungen waren die OFF-Antworten der ZM signifikant vom Ort der Stimulation abhängig. Die OFF-Kontraktionen waren an anal zur Stimulationsstelle gelegenen Messpunkten signifikant niedriger ausgeprägt, während sie oral zum Stimulationsort signifikant stärker waren als am Stimulationsort selbst. Atropin und Hexamethonium führten an der ZM zu einer signifikanten Hemmung der OFF-Antworten, blockierten diese allerdings nicht komplett und waren unabhängig vom Ort der Stimulation. L-NAME demaskierte insbesondere direkt am Stimulationsort signifikant lokal erregende Anteile der EFS-Antworten. Schlussfolgerungen: Die Spontanmotilität unterliegt im porcinen Colon, unabhängig von der Messmethode, kaum cholinergen und nitrergen Einflüssen. Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Messmethoden an der LM unter Hemmstoffeinfluss könnten Folge des Größenunterschiedes zwischen den Darmpräparaten sein und auf unterschiedliche Projektionslängen cholinerger wie auch nitrerger Neurone hinweisen. Acetylcholin ist zwar ein wichtiger, aber nicht der einzige Transmitter aus myenterischen Nervenzellen, der Muskelkontraktionen am porcinen Colon induziert. Nitrerge hemmende Motoneurone haben kurze Projektionslängen (< 2 cm) und die entfernt vom Stimulationsort registrierten EFS-Antworten wurden eher durch nicht-nitrerge Interneurone oder nicht-nitrerge lang projizierende hemmende Motoneurone vermittelt. Cholinerge Interneurone sind an den EFS-Antworten beteiligt und spielen sowohl bei den lokalen als auch bei den weiter vom Stimulationsort entfernt registrierten EFS-Antworten eine Rolle. Es ist mit dieser Arbeit gelungen, neue Erkenntnisse zu cholinergen und nitrergen enterischen Schaltkreisen am porcinen Colon zu gewinnen und eine neue Messmethode für zukünftige Untersuchungen zum Zusammenspiel von ZM und LM zu evaluieren und etablieren. Aufgrund der qualitativen Vergleichbarkeit der Messergebisse zwischen beiden Messapparaturen kann in Folgeuntersuchungen mit Apparatur 2 auf bestehende Befunde aus eindimensionalen Untersuchungen zurückgegriffen werden. Vertiefend können durch die simultanen Motilitätsmessungen an ZM und LM sowohl Ausbreitungsrichtung als auch Zeitunterschiede zwischen den spontanen sowie evozierten Motilitätsmustern beider Muskelschichten bewertet werden.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Funktionen des porcinen Colons 2.2 Aufbau des Colons 2.2.1 Makroskopischer Aufbau 2.2.2 Mikroskopischer Aufbau 2.3 Darmmotilität 2.3.1 Myogene Mechanismen 2.3.2 Gastrointestinale Hormone 2.3.3 Enterisches Nervensystem (ENS) 2.3.4 Extrinsische Steuerung 2.3.5 Motilitätsmuster im Colon verschiedener Tierarten 2.3.6 Spezielle Motilitätsmuster im porcinen Colon 2.4 Untersuchungen der Darmmotilität 2.4.1 Untersuchungen in vivo 2.4.2 Untersuchungen in vitro 2.5 Bedeutung der Befunde für die vorliegende Arbeit 3 Material und Methoden 3.1 Versuchsvorbereitung 3.1.1 Gewinnung des Organmaterials 3.1.2 Gewebeaufbereitung 3.2 Versuchsanordnung 3.2.1 Apparatur: 1: eindimensionale Motilitätsmessung 3.2.2 Apparatur 2: zweidimensionale Motilitätsmessung 3.2.3 Elektrische Feldstimulation (EFS) 3.2.4 Hemmstoffe 3.3 Versuchsdurchführung 3.3.1 Voruntersuchungen 3.3.2 Funktionelle Charakterisierung enterischer Schaltkreise 3.3.3 Datenauswertung und Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Voruntersuchungen 4.1.1 TTX-Sensitivität der EFS-induzierten Muskelantworten 4.1.2 Funktioneller Ausschluss einer direkten EFS-Wirkung außerhalb des Stimulationsortes 4.2 Funktionelle Charakterisierung enterischer Schaltkreise 4.2.1 Spontanmotilität 4.2.2 Nerv-Muskel-Antworten nach elektrischer Feldstimulation 5 Diskussion 5.1 Methodendiskussion 5.2 Diskussion der Messergebnisse von Apparatur 1 und 2 5.2.1 Spontanmotilität 5.2.2 Nerv-Muskel-Antworten nach Elektrischer Feldstimulation 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis Danksagung