Este trabalho foi conduzido com o objetivo de gerar dados de resistência a agentes antimicrobianos de Salmonella Enteritidis (SE) isoladas de amostras clínicas e do ambiente criatório de aves, nos anos de 1999, 2000 e 2001, de cortes de frango, no ano de 1996, ambos na região Sul, bem como de carcaças de frango, nos anos de 2004 e 2005, na região Nordeste, detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas das cepas que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e fagotipá-las. Realizou-se também a ribotipagem de 28 cepas de SE isoladas de carcaças resfriadas de frango no ano de 2004, na região Sudeste. Cento e dezesete cepas de SE foram submeitdos foram submetidas a testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos e os resultados indicaram que 84,6% (99/117) das cepas de Salmonella Enteritidis apresentaram resistência a um ou mais agentes antimicrobianos, sendo que o maior percentual está entre as cepas isoladas de carcaças resfriadas de frango, 100% (17/17), seguidas pelas isoladas de cortes de frango, 85,7% (18/21) e das de amostras clínicas e de ambiente criatório de aves, 81% (64/79). Cepas com diferentes níveis de resistência foram encontradas para ampicilina (0,8%), canamicina (1,7%), ciprofloxacina (1,7%), enrofloxacina (10,2%), gentamicina (14,5%), estreptomicina (16,2%), ácido nalidíxico (35,9%), nitrofurantoína (47%) e tetracicilna (59%). Nenhuma das 117 cepas de Salmonella Enteritidis foi resistente ao cloranfenicol, norfloxacina e polimixina B. Dentre as 99 amostras de SE que apresentaram resistência, 66,6% (66), foram resistentes a dois ou mais agentes antimicrobianos. Trinta e três cepas (33,3%), foram resistentes somente a um agente antimicrobiano, 16 a tetraciclina, 12 a nitrofurantoína, três ao ácido nalidíxico, uma a estreptomicina e uma a gentamicina. Para detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas, 42 cepas de SE que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico foram submetidas a reação em cadeia da polimerase e sequenciamento. Das 42 cepas, 30 (71,4%) apresentaram algum tipo de mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas. As alterações gênicas ocorreram nos aminoácidos dos codons Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) ou Asp-87 (62%). As mutações continham alterações de Gly para Asp (n: 1) no codon 81, Asp para Asn (n: 1) no codon 82, Ser para Phe (n: 9) no codon 83 e Asp para Tyr (n: 9) ou Asn (n: 9) no codon 87. Uma amostra apresentou uma inclusão do aminoácido prolina entre os codons 56 e 57. A fagotipificação de 116 cepas de SE apresentou que 68,9% (80/116) pertencem ao fagotipo (FT) 4, 15,5% (18/116) ao FT 4a, 12,2% (14/116) ao FT 1, 0,9% (1/116) ao FT6, 0,9% (1/116) ao FT 6a, 0,9% (1/116) ao FT 7 e 0,9% (1/116) ao FT 7a. Quando leva-se em consideração a origem dos isolados, observamos que nas SE isoladas de amostras clínicas e ambientais criatório de aves, 56,4% pertencem ao FT 4, 21,8% ao FT 4a, 17,9% ao FT 1, 1,3% ao FT 6, 1,3% ao FT 6a e 1,3% ao FT 7a. Nas amostras isoladas de carne cortes de frango, o FT 4 predomina com 95,2% (20/21) e 4,8% (1/21), pertencem ao FT 7. Nos isolados de carcaças resfriadas de frango 94,1% são do FT 4 e 5,9% (1/17) do FT 4a. A caracterização por ribotipagem foi realizada utilizando-se o RiboPrinter® system (DuPont), e apresentou quatro diferentes ribotipos, sendo que o mais comum foi o 25-S-1 (82,1%), seguido pelo 29-S-5 (10,7%) e 28-S-5 e 38-S-3 com 3,5% cada um. Baseados nos dados do presente estudo, conclui-se que: houve uma elevada percentagem de cepas de Salmonella Enteritidis resistente a um ou mais agentes antimicrobianos, indicando que levantamentos contínuos são necessários na indústria avícola e que existe a necessidade de um uso responsável dos agentes antimicrobianos, baseado na compreensão da ecologia da resistência, da transmissão da bactéria resistente e de genes de resistência, da relação entre o uso do antibiótico e aumento da resistência e de um conhecimento de intervenções efetivas; Que assim como em outros trabalhos amostras de S. Enteritidis resistentes ao ácido nalidíxico, isoladas no Brasil, também apresentam mutação no gene gyrA, da região determinante de resistência a quinolonas; Que o FT 4 foi o predominante e que entre as cepas de S. Enteritidis isoladas de aves e de seu ambiente criatório existe uma maior diversidade de fagotipos quando comparada as isoladas de carcaças de frango; E que ao avaliarmos os dados gerados pela ribotipagem observamos um baixo grau de diversidade gênica entre as cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas no presente estudo. / This work aimed to evaluate the antimicrobial resistance of Salmonella Enteritidis (SE) isolated from clinical and environmental poultry samples, during the years of 1999, 2000 and 2001, broiler chicken parts, in 1996, both in Southern Brazil, broiler chicken carcasses, during the years 2004 and 2005, in Northeastern Brazil, detect mutations in the gyrA gene from nalidixic acid resistant and identify their phage type. Also, 28 SE strains isolated during the year 2004 in Southeastern Brazil were characterized by ribotyping. The antimicrobial resistance test was performed using the disk diffusion method on Mueller-Hinton Agar. The results indicated that 84.6% (99/117) of SE strains were resistant to at least one of the antimicrobial agents tested. Resistance at different levels was found to ampicillin (0.8%), kanamycin (1.7%), cyprofloxacin (1.7%), enrofloxacin (10.2%), gentamycin (14.5%), streptomycin (16.2%), nalidixic acid (35.9%), nitrofurantoin (47%), and tetracycline (59%). None of the SE strains were resistant to chloramphenicol, norfloxacin and polimyxin B. Among the 99 SE strains showing resistance, 66.6% (66) presented multiple resistance, to two or more antimicrobial agents. Thirty-three strains (33.3%) were resistant to only one of the antimicrobial agents, 16 to tetracycline, 12 to nitrofurantoin, 3 to nalidixic acid, 1 to gentamycin, and 1 to streptomycin. Fourty-two nalidixic acid resistant strains were submited to PCR and sequencing to detect gyrA mutation genes. Thirty SE strains (71.4%) showed at least one mutation in gyrA genes of quinolone resistance determining region (QRDR), in the codons corrosponding to Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) or Asp-87 (62%). These mutants contained a change from Gly to Asp (n: 1) at codon 81, Asp to Asn (n: 1) at codon 82, Ser to Phe (n: 9) at codon 83 and Asp to Tyr (n: 9) or Asn (n: 9) at codon 87. In one sample there was a Pro inclusion between the 56 and 57 codons. The phage typing of 116 SE isolates showed that 68.9% (80/116) belonged to the phage type (PT) 4, 15.5% (18/116) to the PT 4a, 12.2% (14/116) to the PT 1, 0.9% (1/116) to the PT 6, 0.9% (1/116) to the PT 6a, 0.9% (1/116) to the PT 7, and 0.9% (1/116) to the PT 7a. The ribotyping characterization was done using RiboPrinter® system (DuPont), and showed four different ribotypes. The most common ribotype was 25-S-1 (82.1%). The other ribotypes were 29-S-5 (10.7%), 38-S-3 (3.6%) and 28-S-5 (3.6%). In conclusion, the antimicrobial resistance levels presented here suggest a high occurrence of Salmonella Enteritidis strains resistant to at least one antimicrobial agent, indicating the need for continuous surveillance in the poultry industry, and the need for responsible use of antimicrobial agents in food animals, based on a understanding of the ecology of resistance, the transmission of both bacteria and resistance genes, the relationship between antimicrobial agents use and resistance amplification, and the knowledge of effective interventions. S. Enteritidis nalidixic acid resistant strains isolated in Southern and Northeastern Brazil showed mutation in the gyrA gene of QRDR. Phage type 4 was the most common isolated and among S. Enteritidis strains isolated from clinical and environmental poultry samples there were a higher phagetype diversity when compared with broiler chicken carcasses. The S. Enteritidis strains that were ribotyping showed a lower degree of genetic diversity.

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de gerar dados de resistência a agentes antimicrobianos de Salmonella Enteritidis (SE) isoladas de amostras clínicas e do ambiente criatório de aves, nos anos de 1999, 2000 e 2001, de cortes de frango, no ano de 1996, ambos na região Sul, bem como de carcaças de frango, nos anos de 2004 e 2005, na região Nordeste, detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas das cepas que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e fagotipá-las. Realizou-se também a ribotipagem de 28 cepas de SE isoladas de carcaças resfriadas de frango no ano de 2004, na região Sudeste. Cento e dezesete cepas de SE foram submeitdos foram submetidas a testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos e os resultados indicaram que 84,6% (99/117) das cepas de Salmonella Enteritidis apresentaram resistência a um ou mais agentes antimicrobianos, sendo que o maior percentual está entre as cepas isoladas de carcaças resfriadas de frango, 100% (17/17), seguidas pelas isoladas de cortes de frango, 85,7% (18/21) e das de amostras clínicas e de ambiente criatório de aves, 81% (64/79). Cepas com diferentes níveis de resistência foram encontradas para ampicilina (0,8%), canamicina (1,7%), ciprofloxacina (1,7%), enrofloxacina (10,2%), gentamicina (14,5%), estreptomicina (16,2%), ácido nalidíxico (35,9%), nitrofurantoína (47%) e tetracicilna (59%). Nenhuma das 117 cepas de Salmonella Enteritidis foi resistente ao cloranfenicol, norfloxacina e polimixina B. Dentre as 99 amostras de SE que apresentaram resistência, 66,6% (66), foram resistentes a dois ou mais agentes antimicrobianos. Trinta e três cepas (33,3%), foram resistentes somente a um agente antimicrobiano, 16 a tetraciclina, 12 a nitrofurantoína, três ao ácido nalidíxico, uma a estreptomicina e uma a gentamicina. Para detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas, 42 cepas de SE que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico foram submetidas a reação em cadeia da polimerase e sequenciamento. Das 42 cepas, 30 (71,4%) apresentaram algum tipo de mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas. As alterações gênicas ocorreram nos aminoácidos dos codons Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) ou Asp-87 (62%). As mutações continham alterações de Gly para Asp (n: 1) no codon 81, Asp para Asn (n: 1) no codon 82, Ser para Phe (n: 9) no codon 83 e Asp para Tyr (n: 9) ou Asn (n: 9) no codon 87. Uma amostra apresentou uma inclusão do aminoácido prolina entre os codons 56 e 57. A fagotipificação de 116 cepas de SE apresentou que 68,9% (80/116) pertencem ao fagotipo (FT) 4, 15,5% (18/116) ao FT 4a, 12,2% (14/116) ao FT 1, 0,9% (1/116) ao FT6, 0,9% (1/116) ao FT 6a, 0,9% (1/116) ao FT 7 e 0,9% (1/116) ao FT 7a. Quando leva-se em consideração a origem dos isolados, observamos que nas SE isoladas de amostras clínicas e ambientais criatório de aves, 56,4% pertencem ao FT 4, 21,8% ao FT 4a, 17,9% ao FT 1, 1,3% ao FT 6, 1,3% ao FT 6a e 1,3% ao FT 7a. Nas amostras isoladas de carne cortes de frango, o FT 4 predomina com 95,2% (20/21) e 4,8% (1/21), pertencem ao FT 7. Nos isolados de carcaças resfriadas de frango 94,1% são do FT 4 e 5,9% (1/17) do FT 4a. A caracterização por ribotipagem foi realizada utilizando-se o RiboPrinter® system (DuPont), e apresentou quatro diferentes ribotipos, sendo que o mais comum foi o 25-S-1 (82,1%), seguido pelo 29-S-5 (10,7%) e 28-S-5 e 38-S-3 com 3,5% cada um. Baseados nos dados do presente estudo, conclui-se que: houve uma elevada percentagem de cepas de Salmonella Enteritidis resistente a um ou mais agentes antimicrobianos, indicando que levantamentos contínuos são necessários na indústria avícola e que existe a necessidade de um uso responsável dos agentes antimicrobianos, baseado na compreensão da ecologia da resistência, da transmissão da bactéria resistente e de genes de resistência, da relação entre o uso do antibiótico e aumento da resistência e de um conhecimento de intervenções efetivas; Que assim como em outros trabalhos amostras de S. Enteritidis resistentes ao ácido nalidíxico, isoladas no Brasil, também apresentam mutação no gene gyrA, da região determinante de resistência a quinolonas; Que o FT 4 foi o predominante e que entre as cepas de S. Enteritidis isoladas de aves e de seu ambiente criatório existe uma maior diversidade de fagotipos quando comparada as isoladas de carcaças de frango; E que ao avaliarmos os dados gerados pela ribotipagem observamos um baixo grau de diversidade gênica entre as cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas no presente estudo. / This work aimed to evaluate the antimicrobial resistance of Salmonella Enteritidis (SE) isolated from clinical and environmental poultry samples, during the years of 1999, 2000 and 2001, broiler chicken parts, in 1996, both in Southern Brazil, broiler chicken carcasses, during the years 2004 and 2005, in Northeastern Brazil, detect mutations in the gyrA gene from nalidixic acid resistant and identify their phage type. Also, 28 SE strains isolated during the year 2004 in Southeastern Brazil were characterized by ribotyping. The antimicrobial resistance test was performed using the disk diffusion method on Mueller-Hinton Agar. The results indicated that 84.6% (99/117) of SE strains were resistant to at least one of the antimicrobial agents tested. Resistance at different levels was found to ampicillin (0.8%), kanamycin (1.7%), cyprofloxacin (1.7%), enrofloxacin (10.2%), gentamycin (14.5%), streptomycin (16.2%), nalidixic acid (35.9%), nitrofurantoin (47%), and tetracycline (59%). None of the SE strains were resistant to chloramphenicol, norfloxacin and polimyxin B. Among the 99 SE strains showing resistance, 66.6% (66) presented multiple resistance, to two or more antimicrobial agents. Thirty-three strains (33.3%) were resistant to only one of the antimicrobial agents, 16 to tetracycline, 12 to nitrofurantoin, 3 to nalidixic acid, 1 to gentamycin, and 1 to streptomycin. Fourty-two nalidixic acid resistant strains were submited to PCR and sequencing to detect gyrA mutation genes. Thirty SE strains (71.4%) showed at least one mutation in gyrA genes of quinolone resistance determining region (QRDR), in the codons corrosponding to Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) or Asp-87 (62%). These mutants contained a change from Gly to Asp (n: 1) at codon 81, Asp to Asn (n: 1) at codon 82, Ser to Phe (n: 9) at codon 83 and Asp to Tyr (n: 9) or Asn (n: 9) at codon 87. In one sample there was a Pro inclusion between the 56 and 57 codons. The phage typing of 116 SE isolates showed that 68.9% (80/116) belonged to the phage type (PT) 4, 15.5% (18/116) to the PT 4a, 12.2% (14/116) to the PT 1, 0.9% (1/116) to the PT 6, 0.9% (1/116) to the PT 6a, 0.9% (1/116) to the PT 7, and 0.9% (1/116) to the PT 7a. The ribotyping characterization was done using RiboPrinter® system (DuPont), and showed four different ribotypes. The most common ribotype was 25-S-1 (82.1%). The other ribotypes were 29-S-5 (10.7%), 38-S-3 (3.6%) and 28-S-5 (3.6%). In conclusion, the antimicrobial resistance levels presented here suggest a high occurrence of Salmonella Enteritidis strains resistant to at least one antimicrobial agent, indicating the need for continuous surveillance in the poultry industry, and the need for responsible use of antimicrobial agents in food animals, based on a understanding of the ecology of resistance, the transmission of both bacteria and resistance genes, the relationship between antimicrobial agents use and resistance amplification, and the knowledge of effective interventions. S. Enteritidis nalidixic acid resistant strains isolated in Southern and Northeastern Brazil showed mutation in the gyrA gene of QRDR. Phage type 4 was the most common isolated and among S. Enteritidis strains isolated from clinical and environmental poultry samples there were a higher phagetype diversity when compared with broiler chicken carcasses. The S. Enteritidis strains that were ribotyping showed a lower degree of genetic diversity.

As salmonelas causadoras do Paratifo Aviário, principalmente a Salmonella Enteritidis (SE), têm estado entre as principais causas de toxinfecção alimentar em humanos, causando grandes prejuízos ao setor produtivo. A busca de uma medida única e definitiva para o controle do Paratifo Aviário tem levado a frustração dos esforços empregados, em função das características dos agentes e da infecção provocada. Portanto, ganha força a estratégia de utilizar-se um conjunto de medidas que objetivem a redução gradativa da pressão infectiva em um sistema de produção, levando à melhora crescente do grau de contaminação dos produtos disponibilizados aos consumidores. O objetivo desta tese é fornecer à indústria avícola um conjunto de meios práticos para o controle do Paratifo Aviário e, conseqüentemente, para a produção de alimentos mais seguros ao consumo humano. Para tanto, foram conduzidos quatro estudos, sendo que três estudos foram dedicados ao aumento de resistência das aves à infecção por SE e o quarto estuda a redução do número desta bactéria na ave no período de pré-abate. Em um experimento avaliou-se a imunização das aves com uma bacterina de SE, objetivando o aumento da resistência à infecção por SE em matrizes de frango de corte. Três semanas após o início do desafio, não foram detectadas diferenças entre os grupos testados nos números de SE recuperadas do ceco e no número de cecos e fígados infectados por este agente. Esta conclusão, embora verdadeira para as condições experimentais usadas, necessita de experimentações adicionais em condições de criação tradicional para ser referendada. A Vacinação Maternal e o uso de Probiótico, como medidas para aumentar a resistência inicial de pintos de corte, foram estudados em 3 experimentos. O uso de Probiótico causou uma redução no número de ufc de SE nos cecos de até 1,45 log10. A maior redução, ocorrida no Experimento III, demonstra a importância da antecipação do uso do Probiótico em relação ao início do desafio. Não se verificou nenhum efeito da Vacinação Maternal no número de cecos positivos ou no número de ufc de SE no ceco. Em quatro experimentos foram investigados os efeitos da pulverização da cepa 9R de Salmonella Gallinarum (SG-9R) em pintos de corte de um dia de idade sobre a infecção provocada artificialmente por SE. A aplicação da SG-9R em pintos de um dia apresenta potencial para auxiliar no controle da infecção por SE. Em que pese essa conclusão, estudos adicionais são necessários para verificar a magnitude da efetividade desta medida, bem como determinar a probabilidade de reversão de patogenicidade da SG-9R. Em três experimentos estudou-se a administração de água acidificada no pré abate de frangos de corte. Esta administração nas 24 horas que precedem o carregamento para o abate levou a uma redução de 99% no número de salmonelas no inglúvio dos frangos. Esta medida não é ideal, já que não evita a doença nas aves e, também, não garante a produção de alimentos integralmente livre de Salmonella. Porém, pode tornar-se uma importante ferramenta para redução da contaminação no abate dos lotes de frangos positivos para enfermidade. / Salmonellae that cause paratyphoid infection, mainly the Salmonella Enteritidis (SE), are among the main causes of foodborne diseases in humans, representing great loss for the poultry industry. The search for a unique and decisive control means has been frustrated due to the bacterial characteristics and the resulting infection. So, it becomes important the strategic use of a group of means that gradually reduce the infection pressure over the production system, taken to an increasing improvement of the contamination level of the final products offered to the consumers. The thesis goal is to offer to the poultry industry a group of feasible means to control the paratyphoid infection and, corollary, to produce safer food to human beings. Therefore, four studies were conducted. Three of them were dedicated to the increase of bird resistence to the SE infection and one to the reduction of Salmonella contamination level of the broilers at the pre slaughter period. The increase resistance of broiler breeders due to immunization with a SE bacterin was evaluated through an experiment. Three weeks after the challenge no differences were detected on the number of SE infected livers and ceca among the tested groups. This conclusion, although true under these conditions, needs further experiments under actual production systems to be corroborated. The maternal vaccination and the use of probiotics as means to increase the initial resistance of broiler chickens to SE infection were accessed through three experiments. The probiotics reduced the number of SE colony forming units (CFU) in the ceca up to 1.45 Log10. The greatest reduction occurred at Experiment III, indicating the importance of the administration of the probiotic being prior to the challenge. No effect of maternal vaccination on the number of ceca positive to SE or the number of SE CFU recovered from the ceca. The effect of spraying day old chickens with Salmonella Gallinarum strain 9R (SG- 9R) on SE infection due to artificial challenge was accessed through four experiments. The application of SG-9R to day old chickens has a potential to help in the control of SE infection. In spite of this conclusion, further studies are needed to access the size of the effect, as well to determinate the probability of pathogenicity reversion of SG-9R. Three experiments were done to study the effect of administration of acidified water to the broilers at the pre slaughter period on the presence of SE in the crop. The use of acidified water starting 24 hours before the initial loading of broilers to the slaughter plant caused a reduction of 99% on the number of SE taken from the crop. This is not an ideal approach, since it does not avoid the presence of SE in the broiler and, also, does not warrant the production of food free of Salmonella. Although it can be a important tool to the contamination reduction of broiler flocks positive to Salmonella.

Salmonella enterica sorovar (S.) Enteritidis é uma das principais bactérias envolvidas em surtos de infecção alimentar em humanos decorrentes do consumo de produtos de origem animal. Nas investigações epidemiológicas, a subtipificação fenotípica e genotípica permitem verificar diferenças ou similaridades entre linhagens, as quais podem indicar sua origem, auxiliando os programas de controle e prevenção do patógeno. No presente trabalho, foram analisados os padrões de resistência a antimicrobianos, fagotipificação, macrorestrição de DNA seguida de eletroforese em campo pulsado (PFGE) e polimorfismo de comprimento do fragmento amplificado utilizando uma única enzima de restrição (SEAFLP) de 107 linhagens de S. Enteritidis, sendo 53 isoladas de aves e seus produtos (carcaças, carne, vísceras e ambiente) e uma de origem suína. Foram ainda analisadas 29 linhagens isoladas de alimentos e 14 isoladas de humanos envolvidos em surtos de salmonelose notificados no Rio Grande do Sul, uma amostra de referência (ATCC 13076), além de 9 linhagens isoladas na Europa e África. Na comparação entre amostras isoladas de aves e de surtos de salmonelose, as linhagens de origem avícola foram significativamente mais resistentes a antimicrobianos do que as isoladas de humanos e, embora não tenha sido encontrada relação entre os genótipos de PFGE e os padrões de resistência, a associação de ambas as técnicas possibilitou uma melhor caracterização de S. Enteritidis, podendo ser úteis como marcadores epidemiológicos. Por outro lado, SE-AFLP agrupou a maioria das linhagens de S. Enteritidis num padrão principal. Paralelamente, na comparação de técnicas genotípicas com base em PCR, SE-AFLP apresentou maior capacidade de discriminação, embora inferior à verificada pela fagotipificação e perfil de resistência a antimicrobianos. Assim, foi recomendado que esta técnica deve ser utilizada em associação com outras metodologias na tipificação de S. Enteritidis. Posteriormente, na caracterização do conjunto de linhagens de S. Enteritidis, foram identificados 13 diferentes padrões de resistência a antimicrobianos, além de 12 padrões de PFGE e 3 de SE-AFLP. As técnicas genotípicas demonstraram que existe um genótipo predominante de S. Enteritidis no Rio Grande do Sul, o qual está presente em aves e produtos relacionados, além de alimentos e humanos envolvidos em surtos de salmonelose, sugerindo que estas linhagens possam derivar de uma fonte comum, tendo provável relação clonal. Embora havendo um genótipo predominante de S. Enteritidis, a associação das técnicas propostas possibilitou a melhor caracterização do patógeno. / Salmonella enterica subsp. enterica (S.) serovar Enteritidis is one of the main pathogens involved in food-borne diseases worldwide. Subtyping is crucial to differentiate strains, as well to study its origin and major infection route, which can direct preventive and control measures in epidemiological investigations of food-related salmonellosis. In order to investigate phenotypic and genotypic characterization in S. Enteritidis, the aim of this study was analyze the antimicrobial resistance, phage types, pulsed-field gel elecrophoresis (PFGE) and single-enzyme amplified-fragment length polymorphism (SEAFLP patterns of 107 S. Enteritidis strains isolated from poultry (53 isolates from carcass, meat, viscera and environmental swab) and one from swine. We also analyzed 29 strains from food and 14 from humans involved in salmonellosis outbreaks in Rio Grande do Sul, one reference strain (ATCC 13076) and 9 strains isolated from African and European countries. Resistance rates found in poultry-related strains were significantly higher than that observed in strains isolated from humans. Since identical PFGE profiles were identified in antimicrobial resistant and susceptible strains, it was not possible to find relationship between the PFGE genotypes and the antimicrobial resistance patterns found. However, both approaches were able to improve S. Enteritidis characterization. On the other hand, SE-AFLP clustered most of the S. Enteritidis strains in a major pattern. In a comparison between based-PCR approaches, SE-AFLP showed a higher discriminatory power, although it was lower than that displayed by antimicrobial resistance and phage type patterns. Thus, SE-AFLP might be used associated to other approaches for S. Enteritidis characterization. In contrast, 13 different antimicrobial resistance patterns, 12 PFGE genotypes and 3 SE-AFLP genotypes were identified in the S. Enteritidis strains. Genotypic approaches showed that the strains isolated from poultry, poultry-related products, food and humans involved in salmonelosis outbreaks shared a major pattern. These results suggest that the strains have a close relationship and the association of the different approaches improved S. Enteritidis characterization.

Magíster en Bioquímica en el área de especialización de Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular / Memoria para optar al Título de Bioquímica / El género Salmonella comprende dos especies, S. enterica y S. bongori, que en conjunto agrupan a más de 2.500 serovares. De éstos, los pertenecientes a S. enterica subespecie enterica son responsables de aproximadamente el 99% de los casos de salmonelosis en animales de sangre caliente. A nivel mundial se producen anualmente millones de casos de salmonelosis en el ser humano y miles de muertes, principalmente en países subdesarrollados. En esta tesis se propuso identificar un conjunto de genes requeridos para la colonización sistémica de un hospedero murino por tres serovares de Salmonella: S. Typhi, S. Typhimurium y S. Enteritidis. Este estudio se realizó mediante un análisis masivo de mutantes bajo selección negativa in vivo. La detección de aquellas mutantes con defectos en la colonización sistémica aguda de ratones BALB/c se realizó mediante hibridaciones comparativas utilizando un microarray genómico de Salmonella. El posterior análisis comparativo de las mutantes bajo selección negativa in vivo en los tres serovares, nos permitió identificar que mutantes en 131 genes serían atenuadas in vivo. Dentro de este grupo identificamos genes codificados en islas de patogenicidad conservadas del género Salmonella, genes necesarios para la biosíntesis de purinas y compuestos aromáticos (aro, pur y gua), genes relacionados con la biosíntesis y modificación del LPS (rfa, rfb) y genes que codifican reguladores globales asociados a patogenicidad (phoP, envZ, rpoN, dam y rsd). Otros genes identificados corresponden a los que codifican el sistema transportador de proteínas Twin-Arginine (tatABC), genes que codifican las diferentes subunidades de una NADH deshidrogenasa (genes nuo); un locus que corresponde a un transportador de péptidos del tipo ABC (sapBF). También pudimos detectar que mutantes en genes involucrados en el transporte de solutos se encuentran bajo selección, como trkH que codifica un transportador de potasio. El sistema de transporte Twin-Arginine corresponde a una de las dos vías de translocación de proteínas hacia el espacio periplasmático en bacterias Gram negativo. La participación de este sistema en la patogenicidad de Salmonella se confirmó mediante ensayos de competencia in vivo entre mutantes definidas del operón y la respectiva cepa silvestre en los tres serovares estudiados. El análisis global de mutantes en tres serovares nos permitió determinar un conjunto de genes comunes necesarios para establecer la colonización sistémica aguda en un hospedero murino. Posteriormente, se confirmó la participación del sistema de transporte de proteínas Tat en la patogenicidad de Salmonella. Los resultados de los ensayos de competencia nos permitieron confirmar la predicción obtenida en el análisis de masivo de mutantes bajo selección negativa in vivo. / The Salmonella genus comprises two species: S. bongori and S. enterica, which can be grouped into more than 2,500 serotypes. Serovars within S. enterica subspecies enterica account for ~99% of all salmonellosis in warm-blooded animals. Worldwide, these organisms are responsible for hundreds of millions of salmonellosis cases and hundreds of thousands of deaths, mainly in underdeveloped countries. In this thesis, we aimed to identify a group of genes required for systemic colonization of a murine host by three Salmonella serotypes: S. Typhi, S. Typhimurium and S. Enteritidis. We used a high-throughput microarray-based screening for mutants with defects in systemic colonization of BALB/c mice. Subsequent comparative analysis of mutants under negative selection in vivo allowed us to identify that mutants in 131 genes are attenuated in the three serotypes under study. Within this group we found genes encoded in some of the pathogenicity islands conserved in the Salmonella genus, genes required for biosynthesis of purines and aromatic compounds (aro, pur and gua), genes related to LPS biosynthesis (rfa and rfb) and genes encoding regulators previously associated with virulence (phoP, envZ, rpoN, dam and rsd). Other genes identified are those encoding the Twin-Arginine transport system (tatABC), genes coding the different subunits of a NADH dehydrogenase (nuo genes) and a locus encoding an ABC peptide transporter (sapBF). We also identified that mutants in genes involved in solute transport (i.e: trkH, that encodes a potassium transporter) are under negative selection in vivo. The Twin-Arginine transport system corresponds to one of the two pathways used by Gram-negative bacteria to translocate proteins to the periplasmatic space. Participation of this system in Salmonella pathogenicity was confirmed in the three serotypes under study by means of in vivo competition assays between targeted mutants of the operon and the corresponding wild-type strains. Overall, the global analysis of mutants under negative selection in vivo in three serotypes of Salmonella allowed us to identify a common group of genes required to establish acute systemic colonization of a murine host. We confirmed the participation of the Tat transport system in the pathogenicity of Salmonella using in vivo competition assays. These results further support the predictions obtained in our global analysis. / Fondecyt

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella spp. es uno de los principales agentes causantes de gastroenteritis en la población humana. Las fuentes de infección las constituyen alimentos y agua contaminada con este agente, siendo los de origen animal los más frecuentemente contaminados. El objetivo del presente estudio fue describir la situación de la problemática de salmonelosis humana y animal en Chile en el periodo 2000-2006 y comparar la aplicación de buenas prácticas con la incidencia de salmonelosis humana. Se recopilaron antecedentes sobre el agente en diversas instituciones de salud pública y de salud animal comparando así los datos de prevalencia. Al mismo tiempo, se realizó un cuestionario Delphi de 33 preguntas a expertos en el tema. Los casos de salmonelosis humana mostraron un constante aumento según los registros del Instituto de Salud Pública (ISP). Los alimentos de origen cárneo toman una gran importancia frente al resto de los alimentos en el contagio de esta bacteria. En los meses de altas temperaturas existe un mayor número de toxiinfecciones. Los casos de salmonelosis en mataderos de aves también mostraron un aumento en los años de estudio, no existiendo relación con los casos humanos. Los expertos plantean que la salmonelosis es un problema grave tanto en el ámbito nacional como internacional, cuya principal fuente de contagio se produce al interior del hogar. Se concluye que los casos de salmonelosis humana y animal son crecientes, lo cual hace notar que a pesar de los esfuerzos desplegados, Salmonella spp. sigue siendo un agente de preocupación. Salmonella Enteritidis es el principal serotipo responsable de toxiinfecciones alimentarias humanas en Chile, pero ahora los productos de origen cárnicos desplazaron a los derivados del huevo como principal fuente de contagio. Se concluye finalmente que es fundamental implementar esfuerzos en conjunto aplicando buenas prácticas en toda la cadena de producción y mejores programas de educación al consumidor.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella Enteritidis (S.E.) es una de las principales causas de toxiinfecciones alimentarias en el mundo, además de causar importantes pérdidas económicas a la industria avícola. Dentro de los alimentos implicados en los brotes de salmonelosis humana, el huevo cumple un rol fundamental en la transmisión de este enteropatógeno bacteriano. Debido al surgimiento de multiresistencia a los antimicrobianos, y a que ninguna de las medidas de control aplicadas por la industria avícola ha logrado eliminar esta bacteria del contenido de los huevos, es que nace la idea de utilizar bacteriófagos para el biocontrol de S.E. en huevos. El objetivo del presente estudio fue determinar la capacidad biocontroladora de una mezcla de tres bacteriófagos líticos, sobre S.E. contenida en huevos permeabilizados. Se analizaron las efectividades tanto de dos vías de administración de estos como de diferentes tiempos, sobre el biocontrol de S.E. en huevos experimentalmente contaminados. Para ésto, huevos SPF fueron contaminados, a través de la cámara de aire, con una suspensión de S.E. (1,28 x 101 UFC/mL); dos horas después se adicionaron los fagos (107 UFP/mL), mediante dos formas de administración: inmersión o aspersión de gota gruesa. Los huevos así tratados fueron mantenidos a temperatura ambiente hasta por cinco días, divididos según vía de administración en cinco grupos paralelos, se analizaron por bacteriologías cualitativa y cuantitativa (UFC/mL) cada 24 horas (D1 a D5). El diseño experimental incluyó, además, un grupo control de infección, inoculado sólo con S.E. y dos grupos controles de fagos que sólo recibieron la mezcla de fagos en estudio, uno por inmersión y el otro por aspersión. Los resultados de la bacteriología cualitativa mostraron que los grupos de huevos que recibieron terapia con fagos, tanto por inmersión como por aspersión, en ningún día de los análisis de las muestras (D1 a D5) tuvieron reducciones significativas (p > 0,05) en la incidencia de contaminación. Sin embargo, la bacteriología cuantitativa mostró que los fagos fueron capaces de lograr disminuciones significativas (p < 0,05) en los recuentos de S.E. de aproximadamente 3 log, independiente de las vías de administración y de los tiempos. Estos resultados sugieren que los bacteriófagos pueden ser una alternativa efectiva para el control de Salmonella Enteritidis en huevos, dosificados tanto por inmersión como por aspersión. Además, se comprobó que la actividad lítica de los bacteriófagos se mantuvo en el tiempo, por hasta 5 días

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é o responsável pela pandemia mundial da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Uma vez infectado pelo HIV, o hospedeiro apresenta a forma aguda da doença, caracterizada por aumento da carga viral circulante, rápido declínio das células TCD4+ e ativação da resposta imune inata. Quando o HIV se estabelece no organismo, induz latência em algumas células e leva à cronicidade da infecção e nessa fase o principal alvo do HIV são as células T CD4+, observa-se então constante diminuição desta população, que tem como consequência a imunodeficiência, com desativação de outras células imunes, como os monócitos, macrófagos, células Natural Killer e neutrófilos. Portanto, há o favorecimento das infecções oportunistas por fungos, bactérias, parasitas e outros vírus, além do surgimento de neoplasias principais responsáveis pela morbidade e mortalidade relacionadas à AIDS. Para conter a destruição do sistema imune pelo vírus, inicia-se a terapia antirretroviral (TARV), sendo que o parâmetro disponível na clínica para início da terapia é a carga viral e contagem de células TCD4+. Neste sentido, investigamos se fatores relacionados à função e fenótipo de monócitos de pacientes HIV+ poderiam servir como biomarcadores da progressão da infecção. Para tanto, monócitos provenientes do sangue periférico de indivíduos HIV+, virgens ou não de tratamento e de indivíduos controle foram ou não infectadas in vitro com Salmonella Enteritidis. A capacidade fagocítica, a atividade microbicida, a produção de óxido nítrico (NO) e de citocinas foi avaliada e para avaliar a produção de espécies reativas do oxigênio (EROs), os monócitos foram ainda estimulados ou não com PMA. Concluímos que a infecção pelo HIV leva ao aumento da capacidade fagocítica de monócitos de homens quando comparados à mulheres nas mesmas condições, entretanto a infecção não altera funções como a atividade microbicida, produção de EROs ou NO, entretanto, o perfil de citocinas entre os grupos foi muito diferente, entretanto o uso de TARV é capaz de recuperar parcialmente as correlações formadas entre citocinas comparadas ao grupo controle. Desta forma uma bioassinatura funcional poderia ser descrita, tendo como base a produção diferencial de citocinas e quimiocinas, como IL-1?, IL-6 e IL-12p70. / The human immunodeficiency virus (HIV) is the responsible for the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) global pandemic. Once infected with HIV, the host has an acute form of the disease, characterized by a very high circulating level of virus and a rapid decline in CD4+ T cells, and then, the activation of innate immune response. The HIV is established in the body, inducing latency in some cells and leads to chronic infection, phase which the main target of HIV are the CD4+ T cells, and then what we observe is the constant decline of this population, which brings the immunodeficiency as a consequence, characterized by the deactivation of other immune cells, such as monocytes, macrophages, natural killer and neutrophils. In this way, opportunistic infections by fungal, bacteria, parasites and others viuses in adition to the neoplasm are established, being the main responsible for the morbidity and mortality related to AIDS. To contain the immune system destruction by the virus, the antiretroviral therapy (HAART) can be initiated, and the clinical parameter available considered to the onset of therapy to is the viral load and CD4+ T cell counts. In this sense, we have investigated if the factors related to the function and phenotype of monocytes from HIV+ patients could serve as biomarkers of the progression of infection. To this end, monocytes from the peripheral blood of HIV+ patients treated or not with HAART and control subjects were infected or not in vitro with Salmonella Enteritidis. The phagocytic capacity, microbicidal activity, the production of nitric oxide (NO) or cytokines were evaluated and when monocytes were stimulated or not with PMA, the production of reactive oxygen species (ROS) was evaluated. We conclude that HIV infection leads to increased phagocytic ability of monocytes of men compared to women in the same conditions, however, the infection does not alter functions such as microbicidal activity and ROS and NO production, however, the cytokine profile between groups was very different, however the use of HAART is able to partially recover the correlations formed between cytokines compared to the control group. Thus a functional biosignature could be described based on the differential production of cytokines and chemokines such as IL-1?, IL-6 and IL-12p70.

O objetivo deste estudo foi o de avaliar a eficiência da aderência de produtos de exclusão competitiva e de probiótico sobre a tonsila cecal de frangos SPF, com idade de um a doze dias. Através da microscopia eletrônica de varredura, verificou-se a ação destes produtos comerciais com relação a proteção ao epitélio, quando desafiados com Salmonella Enteritidis. O delineamento experimental foi dividido em cinco (05) grupos, sendo o grupo T1 o controle negativo, o grupo T2 recebeu o produto de exclusão competitiva Aviguard, o grupo T3 recebeu o produto de exclusão competitiva Broilact, o grupo T4 recebeu o probiótico Biotop e o grupo T5 o controle positivo. Após 12 horas do tratamento com os produtos de exclusão competitiva ou probiótico as aves foram infectadas, por via oral, com S. Enteritidis. Os resultados obtidos mostraram que os produtos de exclusão competitiva e probiótico apresentaram uma maior eficiência em estabelecer uma microbiota protetora contra S. Enteritidis, e que a adição destes pode produzir um efeito de melhor índice zootécnico, quando comparado com as aves que foram desafiadas com S. Enteritidis e que apresentaram um ganho de peso inferior. / The aim of this study was to evaluate the ultra structure of the cecal tonsil in SPF chicks using scanning electron microscopy, determining the efficacy of competitive exclusion products and probiotic and its protection in cecal epithelium against an oral challenge with Salmonella Enteritidis. The experimental design included five groups: T1 negative control, T2 chicks treated with Aviguard, T3 chicks treated with Broilact, T4 chicks treated with Biotop, and, T5 positive control. After 12 hours of treatment with competitive exclusion products or probiotic the chicks were infected orally with S. Enteritidis. Results showed that treated groups had a protective effect stimulating the establishment of the resident microflora against pathogenic bacteria. Treated chicks showed high weight gain when compared to chicks challenged.

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é o responsável pela pandemia mundial da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Uma vez infectado pelo HIV, o hospedeiro apresenta a forma aguda da doença, caracterizada por aumento da carga viral circulante, rápido declínio das células TCD4+ e ativação da resposta imune inata. Quando o HIV se estabelece no organismo, induz latência em algumas células e leva à cronicidade da infecção e nessa fase o principal alvo do HIV são as células T CD4+, observa-se então constante diminuição desta população, que tem como consequência a imunodeficiência, com desativação de outras células imunes, como os monócitos, macrófagos, células Natural Killer e neutrófilos. Portanto, há o favorecimento das infecções oportunistas por fungos, bactérias, parasitas e outros vírus, além do surgimento de neoplasias principais responsáveis pela morbidade e mortalidade relacionadas à AIDS. Para conter a destruição do sistema imune pelo vírus, inicia-se a terapia antirretroviral (TARV), sendo que o parâmetro disponível na clínica para início da terapia é a carga viral e contagem de células TCD4+. Neste sentido, investigamos se fatores relacionados à função e fenótipo de monócitos de pacientes HIV+ poderiam servir como biomarcadores da progressão da infecção. Para tanto, monócitos provenientes do sangue periférico de indivíduos HIV+, virgens ou não de tratamento e de indivíduos controle foram ou não infectadas in vitro com Salmonella Enteritidis. A capacidade fagocítica, a atividade microbicida, a produção de óxido nítrico (NO) e de citocinas foi avaliada e para avaliar a produção de espécies reativas do oxigênio (EROs), os monócitos foram ainda estimulados ou não com PMA. Concluímos que a infecção pelo HIV leva ao aumento da capacidade fagocítica de monócitos de homens quando comparados à mulheres nas mesmas condições, entretanto a infecção não altera funções como a atividade microbicida, produção de EROs ou NO, entretanto, o perfil de citocinas entre os grupos foi muito diferente, entretanto o uso de TARV é capaz de recuperar parcialmente as correlações formadas entre citocinas comparadas ao grupo controle. Desta forma uma bioassinatura funcional poderia ser descrita, tendo como base a produção diferencial de citocinas e quimiocinas, como IL-1?, IL-6 e IL-12p70. / The human immunodeficiency virus (HIV) is the responsible for the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) global pandemic. Once infected with HIV, the host has an acute form of the disease, characterized by a very high circulating level of virus and a rapid decline in CD4+ T cells, and then, the activation of innate immune response. The HIV is established in the body, inducing latency in some cells and leads to chronic infection, phase which the main target of HIV are the CD4+ T cells, and then what we observe is the constant decline of this population, which brings the immunodeficiency as a consequence, characterized by the deactivation of other immune cells, such as monocytes, macrophages, natural killer and neutrophils. In this way, opportunistic infections by fungal, bacteria, parasites and others viuses in adition to the neoplasm are established, being the main responsible for the morbidity and mortality related to AIDS. To contain the immune system destruction by the virus, the antiretroviral therapy (HAART) can be initiated, and the clinical parameter available considered to the onset of therapy to is the viral load and CD4+ T cell counts. In this sense, we have investigated if the factors related to the function and phenotype of monocytes from HIV+ patients could serve as biomarkers of the progression of infection. To this end, monocytes from the peripheral blood of HIV+ patients treated or not with HAART and control subjects were infected or not in vitro with Salmonella Enteritidis. The phagocytic capacity, microbicidal activity, the production of nitric oxide (NO) or cytokines were evaluated and when monocytes were stimulated or not with PMA, the production of reactive oxygen species (ROS) was evaluated. We conclude that HIV infection leads to increased phagocytic ability of monocytes of men compared to women in the same conditions, however, the infection does not alter functions such as microbicidal activity and ROS and NO production, however, the cytokine profile between groups was very different, however the use of HAART is able to partially recover the correlations formed between cytokines compared to the control group. Thus a functional biosignature could be described based on the differential production of cytokines and chemokines such as IL-1?, IL-6 and IL-12p70.