Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las especies reactivas del O2 y del N2 son importantes mecanismos de defensa antimicrobianos. Salmonella necesita sobrevivir al daño oxidativo producido por estas defensas para poder establecer la infección. Debido a que previamente se ha observado variabilidad fenotípica entre cepas de S. Enteritidis, en este trabajo se estudió la resistencia a estrés oxidativo de 18 cepas de S. Enteritidis provenientes de distintos hospederos, comparándose la capacidad de supervivencia de estos grupos de bacterias frente al desafío con radicales libres derivados del O2 y del N2. Los resultados muestran diferencias significativas en la capacidad de supervivencia de las cepas de S. Enteritidis, pero no se detectaron diferencias significativas en la capacidad de supervivencia entre grupos y que existe baja correlación entre los ensayos. Finalmente, se sugiere la realización de nuevos estudios para complementar los resultados obtenidos / Proyecto ISID 9102.012

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Debido al problema actual provocado por Salmonella Enteritidis (S.E.), el sector avícola ha implementado medidas de control, pero ninguna de ellas ha demostrado la eficiencia necesaria. Actualmente, el uso de bacteriófagos líticos reaparece como una opción más de control que ha sido investigada a nivel internacional y nacional. En Chile, recientemente se obtienen resultados alentadores en el control de Salmonella Enteritidis mediante la utilización preventiva de 3 bacteriófagos líticos en pollos Libres de Patógenos Específicos (SPF, <Specific Pathogen Free>) experimentalmente infectados. El objetivo de este trabajo fue determinar la eficiencia de una mezcla de 3 bacteriófagos sobre la colonización de Salmonella spp. en aves comerciales provenientes de madres vacunadas. Se formaron 5 grupos de 30 pollos cada uno: 2 grupos recibieron la terapia con bacteriófagos (aves comerciales y aves SPF) y 3 fueron controles (control de infección en aves comerciales, control de infección en aves SPF y control sano). Al día 6 de edad, las aves fueron tratadas con una mezcla de bacteriófagos vía aerosol, con una multiplicidad de infección de 103 UFP y, al día siguiente, fueron desafiadas con 2,95 x 105 UFC/ml de S.E. vía oral. Siete días post desafío (14 días de edad), las aves fueron sacrificadas para la obtención de muestras individuales de ciegos y un “pool” de órganos internos para realizar Bacteriología cualitativa y Bacteriología cuantitativa para recuento cecal (UFC/g). En las aves comerciales que recibieron el desafío con S.E., la incidencia de la infección no disminuyó respecto al grupo de aves SPF desafiadas, alcanzando el 100% de infección total en ambos grupos, independiente del tipo de muestra. Al analizar sólo las muestras de “pool” de órganos, la incidencia en aves comerciales disminuyó en un 9,4%, reducción que no fue significativa. Por otro lado, en las aves comerciales que recibieron los bacteriófagos comparadas con las aves comerciales que no los recibieron, la incidencia de infección disminuyó significativamente (p=0,01) en un 20% mientras que, en las aves SPF tratadas con bacteriófagos la disminución alcanzó sólo un 6,9%. El análisis de la presencia de S.E. según tipo de muestra en ambos grupos de aves tratadas con los bacteriófagos, demostró que en los ciegos la disminución fue significativa (p=0,0028) sólo en el grupo de aves comerciales, alcanzando una reducción de 26,7% respecto al control. En relación a la infección sistémica (“pool” de órganos internos) hubo un 8,7% de disminución, valor que no fue significativo. En las aves SPF tratadas, hubo una pequeña disminución a nivel cecal que no fue significativa y, a nivel sistémico, no se observó disminución en la incidencia. En relación al recuento cecal, se observó una reducción de aproximadamente 1 log10 UFC/g de S.E. en las aves comerciales que recibieron el tratamiento, disminución que no fue significativa. En el grupo de aves SPF tratadas con bacteriófagos, se registró una leve disminución de 0,19 log10 UFC/g de S.E. respecto al control. Los resultados obtenidos señalan que la inmunidad materna por sí sola no protegió frente a la colonización de S.E. en ciegos, ni disminuyó su recuento cecal, aunque logró disminuir la incidencia a nivel sistémico. Cuando las aves comerciales, provenientes de madres vacunadas, recibieron bacteriófagos se logró una disminución significativa de la incidencia total de infección y, a pesar que también se observó una disminución en el recuento cecal de S.E., este valor no fue significativo. Los resultados de este estudio permiten concluir que la fagoterapia es una alternativa factible y complementaria para el control de este patógeno en pollos comerciales provenientes de madres vacunadas. Sin embargo, es necesario continuar en la búsqueda de nuevos bacteriófagos que logren disminuciones de mayor impacto en la incidencia de infección y sobre todo, en el recuento bacteriano a nivel cecal.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las infecciones humanas por Salmonella Enteritidis (SE), han experimentado un aumento considerable en Chile y el mundo. Corresponde a una zoonosis transmitida por consumo de alimentos contaminados, cuyo principal reservorio lo constituyen las aves. Esta característica ha orientado a la investigación científica en la utilización del modelo aviar para establecer métodos de control eficientes, y así lograr la reducción de SE en aves y con ello la transmisión hacia los consumidores. El objetivo de este estudio fue describir, en pollos comerciales, la dinámica de la infección experimental con una cepa nativa de Salmonella Enteritidis nal r rif r P – 9. Para esto se trabajó con 320 pollos broiler de 1 día de edad, negativos a Salmonella spp por coprocultivo y PCR. A los 7 días de edad, las aves recibieron 1 ml vía oral de una suspensión de Salmonella Enteritidis nal r rif r P – 9: un grupo con 104 ufc/ml y el otro con 105 ufc/ml. Seriadamente, se obtuvieron muestras de deposiciones de 10 pollos y posteriormente se eutanasiaron para la extracción de muestras de órganos internos (hígado corazón y bazo), ciegos e intestino sin ciegos a las 3, 6, 8, 18, 24 horas post infección (pi), y luego diariamente hasta los 12 días pi. A partir de estas muestras se procedió al reaislamiento de la cepa desafío mediante cultivo tradicional. La colonización intestinal se estableció a las 3 horas pi, independiente de la dosis bacteriana recibida. La invasión sistémica se inició a las 3 horas pi en un 70% de los pollos en la dosis 104 ufc y en un 30% en la dosis 105 ufc. Posteriormente, el porcentaje de animales positivos fue variable en ambos grupos, con rangos entre 0 y 70% para la dosis 104 ufc y entre 10 y 90 en la dosis 105 ufc. La eliminación de Salmonella Enteritidis a través de las fecas fue intermitente y se inició tan rápido como a las 3 horas pi, independiente de la dosis utilizada. Las muestras de ciegos fueron las mejores para detectar la infección, ya que se obtuvo > 80% de aves positivas hasta el día 6 pi (dosis 105 ufc) y día 9 pi (dosis 104 ufc), mientras que en las muestras de intestino sin ciegos se obtuvo >70% de aves positivas hasta el día 8 pi (dosis 104 ufc) y hasta el día 5 pi (dosis 105 ufc). Las muestras de deposiciones (obtenidas por hisopado) fueron malos detectores de la infección en las aves experimentalmente infectadas, ya que arrojaron los valores más variables de reaislamiento durante los 12 días pi. El porcentaje de infección total (animales con al menos una muestra positiva), sin considerar las deposiciones, fue > 80% hasta el día 9 pi en la dosis 104 ufc y > 90% hasta el día 6 pi en la dosis 105 ufc. Se concluye que los mejores días para sacrificar las aves y extraer muestras dependerán de los objetivos de cada experiencia, y variarán según las muestras que se analicen en cada caso.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella Enteritidis (S.E) es el serotipo de Salmonella más involucrado en la presentación de enfermedades transmitidas por los alimentos en nuestro país, siendo los productos de la industria avícola la mayor fuente de infección para el hombre. Por esta razón, su diagnóstico y control se hace cada vez más importante en los productos de esta industria para evitar brotes que pongan en riesgo la salud de la población. El cultivo bacteriológico es la prueba diagnóstica tradicional para la detección de S.E en muestras de tejidos de animales, que a pesar de tener una sensibilidad y especificidad apropiada, presenta la gran limitante de tomar como mínimo 4 a 7 días para entregar resultados. Con el fin de reducir el tiempo de diagnóstico, sin disminuir la especificidad y sensibilidad, es que se han desarrollado metodologías alternativas, entre las cuales el PCR ha ocupado un lugar privilegiado, logrando reducir los tiempos de detección y procesar una gran cantidad de muestras en forma simultánea. El objetivo de este trabajo fue implementar la prueba de PCR convencional, para la detección de S.E, utilizando partidores específicos para detectar el gen invA, y un tratamiento de muestras que incluyó la incubación de éstas en caldo Rappaport Vassiliadis 37ºC por 48 horas y un complejo proceso de extracción de ADN bacteriano, para evitar la acción de inhibidores. Para esto, se realizó una primera etapa en que se implementó la técnica, utilizando bacterias inoculadas en caldo de enriquecimiento, para luego establecer la cantidad de bacterias mínima detectable por la prueba, obteniéndose un mínimo de 101 UFC/ml. No se obtuvo bandas de amplificación con cepas de E. coli y Proteus spp. El caldo Rapapport Vassiliadis no evidenció la presencia de inhibidores ni tampoco los tejidos intestinales, ni órganos internos. Posteriormente se utilizó la prueba implementada para detectar S.E en 53 muestras de tejidos y contenido intestinal de pollos experimentalmente infectados, positivas al cultivo bacteriológico y en 126 muestras negativas. En el primer caso, todas las muestras presentaron amplificación del gen invA, mientras que en el segundo, de las 126 muestras negativas, sólo 6 fueron positivas a PCR (4,8%), correspondiendo 3 de ellas a un pool de órganos y 3 a intestino y contenido intestinal. Basado en estos resultados, se puede concluir que se logró implementar la prueba de PCR convencional para la detección de S.E en tejidos y contenido intestinal de pollos en forma exitosa, con una alta capacidad de detección bacteriana y con un tiempo de ejecución de un máximo de 3 días (de los cuales 2 corresponden a incubación en caldo de enriquecimiento), la cual debiese ser utilizada como complemento a la prueba tradicional actualmente utilizada

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis) continúa siendo un enteropatógeno de importancia en la industria avícola y en salud pública, debido a su condición zoonótica. Pese a los esfuerzos realizados en ambos sectores para su control, la bacteria continúa generando brotes de salmonelosis en la población humana, asociados principalmente al consumo de huevos inadecuadamente preparados. Debido a la limitada eficacia de las medidas de control actualmente aplicadas, el uso de bacteriófagos líticos muestra un potencial uso como medida de biocontrol de S. Enteritidis en la industria avícola. No obstante, a pesar de los exitosos resultados obtenidos tras su aplicación en pollos broiler y pollas de reposición, su uso aún no ha sido evaluado en aves de postura adultas. El objetivo de este trabajo fue determinar la eficacia de una terapia preventiva con bacteriófagos, para el control de la colonización intestinal de S. Enteritidis, en gallinas de postura experimentalmente infectadas. Para esto, gallinas Hy–Line Brown de 22 semanas de edad libres de Salmonella, fueron tratadas durante 3 días seguidos con una mezcla de 3 bacteriófagos líticos, a una dosis de 1011 UFP/cada fago/ave y, un día después de la última dosis de bacteriófagos, fueron desafiadas con S. Enteritidis nalr rifr (2,4 x 108 UFC/dosis/ave). Además, se consideró un grupo control de infección, el cual sólo recibió la cepa desafío. Diez días post infección bacteriana, las aves fueron sacrificadas, obteniéndose muestras individuales de ambos ciegos, las cuales fueron sometidas a bacteriología cualitativa y cuantitativa (recuento bacteriano). Adicionalmente, los huevos ovipuestos durante la experiencia por el grupo control de infección y el grupo sometido a fagoterapia, fueron recolectados y procesados para detectar la presencia de S. Enteritidis (bacteriología cualitativa). Los resultados de la bacteriología cualitativa de ciegos fueron iguales entre el grupo tratado con bacteriófagos y el grupo control de infección, lográndose en ambos una incidencia de infección cecal del 96,67%. Por otra parte, los recuentos bacterianos a nivel cecal fueron menores en el grupo que recibió la fagoterapia (2,402 log10 UFC/g), respecto al grupo control de infección (2,978 log10 UFC/g), pero no se hallaron diferencias significativas entre estos resultados (p = 0,0961). Durante la experiencia, no fue posible el aislamiento de S. Enteritidis en los huevos frescos recolectados de los grupos experimentales. No obstante, se logró su aislamiento a partir de una muestra de huevos internos (presentes en el oviducto al momento de la eutanasia) del grupo control de infección. Adicionalmente, el porcentaje de postura gallina/día, promediado durante los 10 días post infección, fue estadísticamente menor en el grupo control de infección, respecto al grupo de aves que recibió la fagoterapia (p = 0,0054). Los resultados del presente estudio demuestran que, bajo el modelo experimental utilizado, los bacteriófagos no fueron capaces de reducir en forma significativa la colonización cecal de S. Enteritidis en gallinas de postura. Sin embargo, dado los buenos resultados obtenidos a nivel nacional e internacional en aves jóvenes, sería importante investigar los posibles factores que determinaron la falta de efectividad del tratamiento en aves adultas, con el objetivo de mejorar los resultados de la fagoterapia en este modelo animal. De este modo, en la medida que la fagoterapia en aves adultas sea perfeccionada, podría proyectarse como una herramienta adicional para el control de la salmonelosis en la industria avícola. / Proyecto FONDECYT 1080291

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Salmonella spp., principalmente el serotipo Enteritidis, causa serios problemas en la salud humana y animal, tanto en el país como en el mundo, además de grandes costos económicos. En aves, se promueven medidas de control, particularmente la disminución de su colonización. Este trabajo, realizado en pollas Leghorn comerciales experimentalmente infectadas, aplica dos biocontroladores, un probiótico y una mezcla de bacteriófagos nativos específicos contra Salmonella Enteritidis (S.E.), para determinar si los resultados de esta asociación aumentan, mantienen o disminuyen la colonización del patógeno. Complementariamente se determinó si esta asociación produce un cambio del peso en las aves. Se trabajaron cinco grupos de aves comerciales Leghorn de un día de edad cada uno, un grupo que sólo recibió probiótico, un grupo sólo con bacteriófagos y un grupo con probiótico más bacteriófagos. Otros dos grupos correspondieron a controles, sano sin tratamiento, y control de infección que fue inoculado con la misma cepa desafío a los siete días de edad. Las aves de un día de edad recibieron el probiótico vía aerosol en dosis única. La administración de la mezcla de tres bacteriófagos nativos se realizó a los seis días de edad, vía aerosol, con una multiplicidad de infección (MOI) de 103 ufp. Los grupos probiótico, bacteriófagos y probiótico más bacteriófagos, fueron inoculados con la cepa desafío S.E. nalr rifr (2,95 x 105 ufc/mL) a los siete días de edad. A los 14 días de edad se sacrificaron todas las aves, obteniéndose muestras individuales de “pool” de órganos internos (hígado, corazón y bazo) para bacteriología cualitativa y de ambos ciegos para bacteriología cualitativa y cuantitativa. Los resultados de bacteriología cualitativa demostraron que el uso de probiótico disminuyó a 75,7% la incidencia de S. Enteritidis en relación al grupo control de infección (100%); la mezcla de bacteriófagos a 80% y, cuando se utilizaron ambos biocontroladores la incidencia bajó significativamente a 38,7% (P<0,0001). Además, entre los grupos de aves con probiótico y el grupo de aves con probiótico más bacteriófagos se observó una diferencia significativa en la incidencia de P=0,0027. Entre el grupo de aves con bacteriófagos versus el grupo de aves con probiótico más bacteriófagos también hubo diferencia significativa en la incidencia (P=0,0010). Se demostró que si bien las terapias individuales obtuvieron buenos resultados, cuando se administraron ambas, los resultados se potenciaron. Los resultados de bacteriología cuantitativa demostraron que en relación al grupo control de infección, el recuento cecal de S. Enteritidis disminuyó en 1,69 log10 con el uso de ambos biocontroladores. Hubo diferencia significativa entre los grupos control de infección y probiótico más bacteriófagos (P=0,0003). En relación a las diferencias de pesaje observadas en los grupos experimentales, el grupos de aves con probiótico versus el grupo de aves con probiótico más bacteriófagos mostraron diferencia de sólo 1,1 g. de aumento de peso por ave, a favor del primero. Se concluye que tanto la terapia sólo con probiótico como la terapia sólo con bacteriófagos disminuyen efectivamente la colonización de S. Enteritidis y, al utilizar la terapia probiótico asociado a bacteriófagos los resultados se potenciaron. Por esto, el uso en conjunto de ambos biocontroladores sería efectivo como método para disminuir o evitar la colonización de S. Enteritidis en pollas Leghorn comerciales, presentándose como una posible real herramienta para la mejorar la sanidad en la producción avícola / proyecto Fondecyt nº 1060569

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos son un problema mundial en aumento. Uno de los agentes causales es Salmonella enterica serovar Enteritidis (SE), serotipo predominante en Chile y asociado a alimentos de origen animal, entre ellos, carne de pescado. Una forma reciente de controlar la presencia de SE en los alimentos, ya en uso internacional, es el biocontrol mediante bacteriófagos. Para poder realizar a futuro estudios ajustados al escenario nacional que permitan evaluar su efecto directamente en alimentos, es primordial contar previamente con protocolos de contaminación experimental de las muestras. Por esto, el presente estudio analizó protocolos de contaminación experimental con SE, en carne de salmón congelada fresca y ahumada, mantenida 10 días a temperatura de refrigeración y ambiente. Las variables analizadas fueron: presentación de los alimentos (molido y laminado) y técnica de contaminación (goteo con y sin homogeneización). En cada protocolo se determinó la menor dosis bacteriana (entre 102 a 106 UFC/mL) que lograra ≥ 80% de muestras contaminadas. Además, se evaluó la eficiencia de Piruvato de Sodio en la recuperación de SE en estas carnes contaminadas y refrigeradas. Las menores dosis que lograron ≥ 80% de muestras contaminadas fueron de 102 UFC/mL para todos los protocolos independiente de la temperatura, excepto salmón fresco molido sin homogeneizar refrigerado, cuya dosis fue 103 UFC/mL. Los cuatro protocolos comparados por cada matriz no presentaron diferencias estadísticas (p>0,05) en la bacteriología cualitativa (detección) y cuantitativa (recuentos). La adición de Piruvato de Sodio no generó diferencias estadísticamente significativas (p>0,05) en la recuperación de SE / Proyecto Fondecyt N° 1110038

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos representan un problema de salud pública creciente, siendo Salmonella spp. el patógeno más frecuentemente aislado en los brotes. En Chile, la mayor prevalencia la registra Salmonella Enteritidis (SE), aislado principalmente desde productos de origen animal como carnes de diferentes especies. En este trabajo se implementaron protocolos de contaminación experimental con SE en alimentos cárneos crudos de riesgo, como un paso previo para la investigación del uso de bacteriófagos líticos en la disminución de la carga bacteriana en estos alimentos. Se implementaron cuatro diferentes protocolos de contaminación experimental con SE en productos cárnicos crudos considerados como riesgosos: pollo, pavo, cerdo y bovino. Se determinó la menor dosis de inóculo bacteriano (102 hasta 106 UFC/mL), forma de aplicación del inóculo (goteo con/sin homogeneización) y forma de presentación de las carnes (molido y laminado) con las cuales se logró porcentajes ≥ 80% de contaminación de las muestras, mantenidas por 10 días a temperatura ambiente y de refrigeración. Además, se estudió la eficiencia del Piruvato de Sodio adicionado a los medios de cultivo en los recuentos de SE en las muestras contaminadas y almacenadas a temperatura de refrigeración. En la mayoría de los protocolos analizados se obtuvo elevados porcentajes de muestras contaminadas con bajas dosis de SE (102 UFC/mL y 103 UFC/mL) tanto a temperatura ambiente como en refrigeración, obteniendo recuentos similares entre protocolos. La adición de Piruvato de Sodio no produjo recuentos significativamente mayores (p > 0,05) que aquellos obtenidos sin la adición del suplemento / Proyecto FONDECYT 1110038

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / En Chile y el mundo, el aumento de la prevalencia de Salmonella enterica serotipo Enteritidis en enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs), ha generado gran preocupación sanitaria y económica. La principal fuente de infección para el ser humano es el consumo de productos avícolas, aunque también se ha sugerido el rol de aves silvestres en la transmisión directa del agente, hacia personas y aves comerciales. El objetivo de este trabajo, fue determinar la diversidad fenotípica ligada a virulencia de cepas de S. Enteritidis, aislada desde aves comerciales, aves acuáticas y seres humanos en Chile y observar su asociación a estos hospederos. Los fenotipos de virulencia testeados in vitro fueron la supervivencia en acidez (pH3), en estrés oxidativo (H2O2/NaNO2) y hambruna. Bajo acidez, se observó diferencias significativas (p≤ 0,05) entre cepas a los 30min de ensayo. En estrés oxidativo (H2O2/NaNO2), se determinó diferencias (p≤ 0,05) entre cepas a los 30min y 3h respectivamente. Finalmente, bajo hambruna se observó diferencias (p≤ 0,05) entre cepas y entre hospederos en todos los días de medición (días 10, 20, 30 y 40). En conclusión, existe diversidad fenotípica ligada a virulencia entre cepas de S. Enteritidis y en el caso de hambruna, se evidenció que la diversidad también se asocia al hospedero de origen, lo que sugiere procesos de adaptación de la bacteria a condiciones específicas frente a la falta de nutrientes en cada uno de ellos o en el ambiente en que viven / Proyecto FONDECYT DE INICIACIÓN 11110398

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las enfermedades transmitidas por los alimentos, son un importante problema de salud pública a nivel mundial, donde los agentes biológicos juegan un rol trascendental en su transmisión. Frente a esto, en los últimos años se han utilizado diversas tecnologías de naturaleza biológica, como los bacteriófagos, para controlar en forma efectiva Salmonella sp. en los alimentos. El objetivo de este estudio fue establecer la capacidad biocontroladora de una mezcla de fagos líticos nativos en la reducción de los recuentos de Salmonella Enteritidis (SE), en dos matrices alimentarias consideradas de riesgo como son salmón fresco congelado y salmón ahumado. Para llevar a cabo el objetivo se trabajó con dos grupos de 25 muestras cada uno: el grupo experimental se contaminó con SE y recibió la mezcla de fagos (MOI 104), mientras que el grupo control sólo se contaminó con la cepa desafío. La dosis de contaminación varió según la temperatura de incubación de las muestras. Una vez contaminado y aplicada la mezcla de fagos, las muestras se incubaron por 10 días a temperatura ambiente y a temperatura de refrigeración para luego realizarles recuento bacteriano. Al final del periodo del estudio se observó que la aplicación de la mezcla de fagos redujo (p < 0,0001), los recuentos de SE en ambas matrices alimentarias independiente de la temperatura de incubación, obteniéndose mayores reducciones en aquellas muestras mantenidas a temperatura ambiente (3,19 unidades logarítmicas de SE/g para salmón fresco congelado y 1,96 unidades logarítmicas de SE/g para salmón ahumado). Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que la mezcla de fagos nativos es efectiva en la reducción de SE en carne de salmón ahumado y fresco congelado a temperatura ambiente y de refrigeración durante 10 días / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1110038