Orientador: José Paes de Almeida Nogueira Pinto / Banca: Luciano dos Santos Bersot / Banca: Vera Lúcia Mores Rall / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar o processo de disseminação de Salmonella Enteritidis via diferentes superfícies de corte (madeira, plástico com triclosan, vidro e aço inoxidável), a partir de pele de frango contaminada (5 log UFC/g), para alimentos prontos para o consumo, bem como o efeito de diferentes protocolos de higienização destas superfícies no controle da contaminação. Os seguintes protocolos foram simulados: protocolo 1, nenhuma limpeza foi realizada depois do manuseio da pele contaminada; protocolo 2, as superfícies foram rinsadas em água corrente, protocolo 3 as superfícies foram limpas com detergente e esfregação mecânica; protocolo 4, o protocolo 3 foi aplicado e as superfícies submetidas a sanitização com hipoclorito. A recuperação do patógeno foi possível em todas as superfícies no protocolo 1, com contagens variando de 1,90 a 2,80 log, bem como nos tomates nelas manuseados. Observou-se uma redução no número de células de S. Enteritidis nos protocolos subseqüentes, tanto nas superfícies como nos tomates, chegando a níveis não detectáveis no protocolo 4. As taxas de transferência da pele para superfícies e tomates variaram de 0,09 a 10,1%. Das superfícies avaliadas, a madeira foi a mais difícil de higienizar e o aço inoxidável a mais fácil. O protocolo 4 foi o que proporcionou a maior de redução de contaminação cruzada e proteção à saúde do consumidor / Abstract: The aim of this research was to evaluate the spreading process of Salmonella Enteritidis on different cutting boards (wood, triclosan incorporated plastic, glass and stainless steel), from contaminated poultry skin (5 log CFU/g) to food ready to eat, as well the effect of different cleaning protocols on these surfaces to contamination control. The following scenarios were simulated: scenario 1, no cleaning was performed after handling the contaminated skin; scenario 2, the surfaces were rinsed in water, scenario 3 the surfaces were cleaned with detergent and mechanical scrubbing; scenario 4, protocol 3 was applied and the surfaces submitted to sanitization with sodium hypochlorite. The recovery of the pathogen was possible in all surfaces in scenario 1, with scores ranging from 1.90 to 2.80 log, as well in the tomatoes handled on them. There was a reduction in the number of S. Enteritidis cells in subsequent scenarios, on the surfaces and in tomatoes, reaching undetectable levels in scenario 4. The transfer rates of skin surfaces and tomatoes ranged from 0.09 to 10.1%. About the surfaces assessed, the wood was the most difficult to sanitize and stainless steel easier. Scenario 4 was the one that provided the largest reduction of cross-contamination and protect consumer health / Mestre

Thesis Submitted in Partial Fulfillment for the Requirements to achieve the Degree of PhD in Biochemistry / El genero Salmonella comprende a mas 2,500 serotipos conocidos distribuidos en dos especies: enterica y bongori. Estos serotipos difieren mucho en términos de patogenicidad y especificidad hospedero. Dos serotipos de Salmonella entérica son de especial relevancia: los serotipos Gallinarum y Enteritidis. S. Gallinarum presenta un rango hospedero restringido a aves y causa una severa enfermedad sistémica conocida como tifoidea aviar, la que causa grandes perdidas económicas en la producción aviar en distintas partes del mundo. S. Enteritidis, en cambio, infecta a un amplio rango de hospederos incluyendo humanos, ratones y aves. A diferencia de S. Gallinarum, S. Enteritidis genera una infección subclinica en los pollos, y las aves infectadas pueden convertirse en portadores crónicos, poniendo huevos contaminados por Salmonella. El consumo humano de productos aviares o huevos resulta en un cuadro de gastroenteritis aguda autolimitante, la cual es responsable por ~61% del 1.5 millones de casos de salmonelosis reportados entre los años 1995 y 2008 (WHO Global Foodborne Infections Network Country Databank). Existen pocos trabajos realizados sobre los mecanismos moleculares detrás de la adaptación al hospedero aviar y sobre las implicancias clínicas de las infecciones causadas por los serotipos Enteritidis y Gallinarum, sin embargo evidencia reciente sugiere que estos serotipos poseen factores de virulencia no descritos que pueden ser responsables de estas diferencias. La interación entre las bacterias y sus hospederos es guiada por una comunicación dinámica que busca influenciar la respuesta del hospedero. Dentro de las herramientas utilizadas por las bacterias para influir la respuesta de sus hospederos, las maquinas secretoras que entregan proteínas y toxinas hacia el ambiente intracelular de sus blancos eucariontes son cruciales para la supervivencia y virulencia bacteriana. El Sistema de Secreción Tipo VI (T6SS) es un nuevo mecanismo de translocación de proteínas que existe en la mayoría de bacterias Gram-negativo que se encuentran en contacto íntimo con células eucariontes, incluyendo a aquellas que son patógenos humanos y de plantas. El papel preciso que cumplen estos T6SS todavía es desconocido pero es claro que cumple un papel importante en la virulencia bacteriana. En Salmonella enterica, solo se ha descrito un T6SS el cual esta codificado en la Isla de Patogenicidad 6 de Salmonella (SPI-6). En esta tesis, a través de análisis bioinformaticos y de genomica comparativa se determinó que el genero Salmonella codifica 5 T6SS, distribuidos diferencialmente entre distintos serotipos y con historias evolutivas diferentes. Los nuevos T6SS fueron identificados en islas genómicas designadas SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22. Ademas de la identificación de estas islas, una nueva proteína VgrG “evolucionada” con un dominio del tipo S-Piocina fue identificado en SPI-21. La presencia de este dominio sugirió por primera vez un papel de los T6SS en muerte bacteriana, abriendo un nuevo capitulo en el estudio de T6SS y su papel en relaciones interbacterianas. El T6SS de SPI-19 fue de especial relevancia debido a su amplia distribución dentro de serotipos virulentos de Salmonella y porque análisis bioinformaticos mostraron que mientras Gallinarum codifica un T6SS completo, el serotipo Enteritidis solo codifica para remanentes de este sistema. A pesar de estar estrechamente relacionados, los serotipos Gallinarum y Enteritidis presentan diferencias profundas en su rango de hospederos y patogenicidad. Por lo tanto, es posible especular que la presencia de un T6SS activo esta relacionada de alguna manera con las diferencias en especificidad hospedero y patogenicidad presentada por estos dos serotipos. Para resolver esta hipótesis y determinar la contribución de SPI-19 a la patogenicidad de Salmonella, el objetivo de esta tesis fue determinar si la isla genomica SPI-19 codifica un T6SS funcional que contribuye a la patogenicidad de Gallinarum y Enteritidis en el hospedero aviar. De manera de caracterizar el T6SS de SPI-19, fusiones génicas y de operon fueron construidas y la expresión, producción y secreción de componentes del T6SS fueron evaluadas bajo diferentes condiciones de crecimiento in vitro. El análisis mostro que la mayoría de los componentes se mantienen reprimidos bajo las condiciones analizadas. Infección de macrófagos murinos con una cepa de Gallinarum con una fusión entre el componente estructural/secretado VgrG al reportero GFP, mostró que los componentes del T6SS son preferencialmente producidos al interior de células infectadas. Mutantes por deleción no polares de la isla SPI-19 y componentes específicos del T6SS reveló que este T6SS es necesario para la supervivencia de Salmonella Gallinarum al interior de macrófagos a tiempos tardios de infección. Sin embargo, el T6SS de SPI-19 no pudo ser asociado muerte celular o citotoxicidad de macrófagos inducida por Salmonella. Para determinar la contribución del T6SS de SPI-19 a la patogenicidad de Salmonella, mutantes del T6SS fueron analizadas en ensayos de competencia contra la cepa silvestre de Gallinarum. Infección oral de pollos White Leghorn de cuatro días de edad, reveló que las mutantes del T6SS colonizaron pobremente el ileo, ciego, hígado y bazo comparado a la cepa silvestre. Restitución de SPI-19 a la mutante SPI- 19, utilizando el sistema VEX-Capture, complementó este defecto en colonización. Para analizar el impacto de poseer un T6SS completo en la habilidad de S. Enteritidis para colonizar al hospedero aviar, la SPI-19 de Gallinarum fue transferida a Enteritidis. Experimentos in vivo mostraron que la presencia de una SPI-19 completa aumento significatvamente la habilidad de Enteritidis para colonizar el ileo, hígado y bazo de pollos infectados al dia 1 post-infección. Sin embargo, esa ventaja en la colonización no fue duradera ya que esta cepa mostró un fuerte defecto en la colonización desde el día 3 post-infección hasta el final de los experimentos. Estos resultados sugieren que transferencia de SPI-19 desde S. Gallinarum tiene un impacto negativo en la habilidad de S. Enteritidis para colonizar el hospedero aviar. De esta forma podemos especular que perdida del T6SS de SPI-19 corresponde a un evento patoadaptativo durante la evolución de S. Enteritidis. Del mismo modo, este es el primer trabajo en el que se utiliza el método VEX-Capture para determinar el efecto de la transferencia de islas genómicas en un modelo animal de infección bacteriana. El reciente descubrimiento de Sistemas de Secreción Tipo VI (T6SS) ha abierto un nuevo capitulo en el estudio de la adaptación de Salmonella hacia sus hospederos y el medio ambiente. Si Salmonella codifica T6SS y si aquellos pueden ser considerados eventos evolutivos cuanticos, fueron algunas de las preguntas que el descubrimiento de los T6SS en los genomas bacterianos generó. En esta tesis, hemos expandido el actual conocimiento sobre los T6SS bacterianos y el potencial patogénico de Salmonella mediante: i) la identificación y descripción de 4 nuevas Islas de Patogenicidad de Salmonella (SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22) que codifican para T6SS filogenéticamente distintos, ii) el descubrimiento de una nueva “VgrG” evolucionada que sugirió por primera vez un papel de los T6SS en relaciones interbacterianas, iii) identificando que el T6SS de SPI-19 contribuye a la supervivencia intracelular de Salmonella en macrófagos y iv) determinando que el T6SS de SPI-19 contribuye a la colonización de pollos por S. Gallinarum. / The Salmonella genus includes over 2,500 known serotypes distributed between the two species: enterica and bongori. These serotypes differ greatly in terms of pathogenicity and host specificity. Two Salmonella enterica serotypes are of significant relevance: serotypes Gallinarum and Enteritidis. S. Gallinarum has a host range restricted to birds and causes a severe systemic disease called fowl typhoid, which causes major economic losses in poultry production in several parts of the world. S. Enteritidis on the other hand, infects a broad range of hosts including humans, mice and avian species. In contrast to S. Gallinarum, S. Enteritidis generates a subclinical infection in poultry, and infected hens can become chronic carriers laying Salmonella contaminated eggs. Human consumption of contaminated poultry or egg products results in an acute self-limiting gastroenteritis, being responsible for ~61% of the estimated 1.5 million human salmonellosis cases reported between 1995 and 2008 (WHO Global Foodborne Infections Network Country Databank). There is little work done on the molecular mechanisms behind the differential host-adaptation and clinical outcomes of infections caused by serotypes Enteritidis and Gallinarum in their susceptible hosts, including birds, but recent evidence suggests that these serotypes might possess undescribed virulence factors that may account for these differences. Interaction between bacteria and hosts is guided by a communication/signaling interplay which aims to influence the host response. Among the tools used by bacteria to influence the host response, secretion machines that deliver proteins and toxins into the environment and within eukaryotic target cells are crucial for bacterial virulence and survival. The Type VI Secretion System (T6SS) is a newly described mechanism for protein translocation that exists in most Gram-negative bacteria that come into close contact with eukaryotic cells, including plant and animal pathogens. The precise role and mode of action of T6SS is still unknown, but it is clear that plays an important role in bacterial virulence. In Salmonella enterica, only one T6SS encoded in Salmonella Pathogenicity Island 6 (SPI-6) has been described. In this thesis, through bioinformatics and comparative genomic analyzes it was determined that the genus Salmonella encodes 5 T6SS loci, differentially distributed among different serotypes and with distinct phylogenetic histories. The novel T6SS loci were identified in genomic islands designated SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22. In addition of the identification of these T6SS loci, a novel “evolved” VgrG protein with a S-Type Pyocin containing-domain, was identified in SPI-21. The presence of this protein domain suggested for the first time a role for T6SSs in bacterial killing opening a new chapter in the study of T6SS and its role in inter-bacterial relationships. The SPI-19 T6SS was of significant relevance due to its wide distribution among virulent Salmonella serotypes and because bioinformatics analyzes showed that while Gallinarum encodes a complete T6SS, serotype Enteritidis only encodes for remnants of this system. Despite being closely related, serotypes Gallinarum and Enteritidis present profound differences in their host-range and pathogenicity. Therefore, it is tempting to speculate that the presence of an active T6SS is somehow related to the host-adaptation and pathogenicity differences presented by these serotypes. To resolve this hypothesis and assess the contribution of SPI-19 to Salmonella pathogenicity, the objective of this thesis was to determine whether the SPI-19 genomic island encodes a functional T6SS contributing to the pathogenicity of Gallinarum and Enteritidis in the avian host. In order to characterize the SPI-19 T6SS, gene and operon fusions were constructed and expression, production and secretion of T6SS components were evaluated under different in vitro growth conditions. The analysis showed that most T6SS components remain repressed under the conditions tested. Infection of murine macrophages with a Gallinarum strain harboring the structural/secreted T6SS component VgrG fused to the GFP reporter showed that T6SS components are preferentially produced inside infected cells. Non-polar deletion mutants of the whole SPI-19 and specific T6SS core components revealed that this T6SS was necessary for Salmonella Gallinarum survival within macrophages at late time points after infection. Furthermore, the SPI-19 T6SS function could not be linked to Salmonella-induced cytotoxicity or cell death of infected macrophages. To determine the contribution of SPI-19 T6SS to Salmonella pathogenesis, T6SS mutants were tested in competitive infection assays against the wild-type Gallinarum parental strain. Oral infection of four-day-old White Leghorn chicks revealed that T6SS mutants colonized the ileum, ceca, liver and spleen poorly compared to the wild-type strain. Restitution of SPI-19 to the ΔSPI-19 mutant, using VEX-Capture, complemented this colonization defect. Altogether, the data indicate that SPI-19 and the T6SS encoded therein contributes to macrophage intracellular survival and colonization of chicks infected by S. Gallinarum. To assess the impact of carrying a complete T6SS locus on the ability of S. Enteritidis to colonize the avian host, the SPI-19 from Gallinarum was transferred to Enteritidis. In vivo experiments showed that presence of a complete SPI-19 significantly increased the ability of Enteritidis to colonize the ileum, liver and spleen of infected chicks by day 1 post-infection. This colonization advantage was not lasting however, as this strain presented a strong colonization defect for each organ analyzed from day 3 post infection to the conclusion of the experiment. These results suggest that transfer of SPI-19 from S. Gallinarum has a negative impact on the ability of S. Enteritidis to colonize the avian host. In this context is tempting to speculate that loss of the SPI-19 T6SS corresponds to a pathoadaptative event during S. Enteritidis evolution. In addition, this is the first report of the use of Vex-Capture method to assess the effect of Genomic Island transfer in an animal model of bacterial infection. The recent discovery of Type VI Secretion Systems (T6SS) has opened a new chapter in the study of Salmonella host and environmental adaptation. Whether Salmonella encodes T6SSs and whether they could be considered as quantum leap evolution events are some of the questions that the discovery of T6SS in bacterial genomes generated. In this thesis, we have expanded the current knowledge on bacterial T6SSs and Salmonella virulence potential by: i) the identification and description of 4 novel Salmonella Pathogenicity Islands (SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22) encoding phylogenetically distinct T6SS loci, ii) the discovery of a novel “evolved” VgrG protein, which suggested for the first time a role for T6SSs in interbacterial relationships, iii) identifying that the SPI-19 T6SS contributes to Salmonella intracellular survival in macrophages and iv) determining that the SPI-19 T6SS contributes to chicken colonization by S. Gallinarum.

Salmonella Enteritidis y Salmonella Gallinarum son dos patógenos importantes para el hospedero aviar. El primero causa infecciones silentes en aves de postura, lo que le permite infectar los huevos y tras el consumo de éstos, llegar al hospedero humano. El segundo, causa en el ave un cuadro de gastroenteritis severa y posterior tifoidea aviar, generando graves consecuencias económicas y productivas. Previamente, mediante herramientas bioinformáticas, identificamos una nueva isla de patogenicidad no caracterizada en cuatro serotipos distintos de Salmonella, entre ellos Gallinarum y Enteritidis. Esta fue nombrada isla de patogenicidad 19 de Salmonella (SPI-19), y codificaría para un sistema de secreción tipo VI (T6SS), un sistema de secreción de proteínas el cual se encuentra ampliamente distribuido entre las bacterias Gram negativo. S. Gallinarum posee codificado en la SPI-19 todos los genes esenciales para un T6SS funcional, mientras que S. Enteritidis posee una versión trunca de la isla, y sólo posee algunos genes del T6SS. Este sistema cumpliría una serie de funciones en los procesos patogénicos dependiendo de la bacteria, y hasta el momento se ha descrito su participaciòn en adherencia, invasión, citotoxicidad y proliferación intracelular. Al analizar filogenéticamente el T6SS codificado en SPI-19 se descubrió que se encontraba cercano a los sistemas codificados en bacterias como Vibrio cholerae y Aeromonas hydrophila. En estos patógenos ya se ha descrito un rol del T6SS en la interacción con células del sistema inmune, particularmente en la sobrevida y citotoxicidad en líneas celulares de macrófagos. Debido a que la capacidad de Salmonella para sobrevivir dentro de macrófagos es un proceso fundamental para su diseminación sistémica y colonización de órganos blanco, en esta memoria se propuso determinar el papel que cumple el T6SS codificado en SPI-19 en la interacción con macrófagos murinos. Para esto se estudió la capacidad de sobrevivir al interior de macrófagos RAW 264.7 de mutantes en genes estructurales y efectores del T6SS. A su vez, se analizó la capacidad citotóxica de estas cepas. Los resultados muestran que mutantes de S. Gallinarum presentan una supervivencia menor a tiempos tardíos de infección. En S. Enteritidis la mutante para SPI-19 no presenta una disminución significativa de la sobrevida. En ambos serotipos no se presentan cambios en la citotoxicidad. También se estudió la expresión en la infección de macrófagos del efector VgrG mediante una fusión con el fluoróforo GFP. Esto reveló una rápida expresión de la fusión, lo que sugiere que el contacto bacteria-macrófago gatilla la expresión del efector. Estos resultados demuestran que la isla SPI-19 codifica para un T6SS funcional, que participa en un proceso esencial de la infección por Salmonella.

Orientador: Edir Nepomuceno Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-19T02:06:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Afonso_MagalyAnanias_M.pdf: 2768658 bytes, checksum: 3b0cd61fc672cafefd6f641b93b7bf53 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Determinou-se a sobrevivência de Salmonella enteritidis em ovos artificialmente, contaminados e submetidos à cocção em chama de gás e forno de microondas (FMO), e, em alimentos preparados com ovos contaminados c submetidos a diferentes temperaturas de armazenagem. Foi utilizado Salmonella enteritidis patogênico, fagotipo 28 isolado de aves e ovos brancos de galinhas comerciais. Os alimentos contaminados com aproximadamente 106 a 108 UFC e examinados foram: ovos cozidos em água em ebulição por até oito minutos, ou em forno microondas por 1 minuto, ovos mexidos; ovos tipo pochê; maionese, glacê de clara, gemada e sorvete de creme. A recuperação da Salmonella enteritidis contaminante foi feita quantitativamente através do plaqueamento em duplicata de alíquotas de diluições decimais da amostra sobre Agar a, qualitativamente, com enriquecimento da mesma para verificar presença ou ausência de células viáveis na amostra original. A cocção de ovos em FMO foi mais eficiente na eliminação de Salmonella enteritidis que a em água, num mesmo período de tempo. A cocção de ovos em água em ebulição, até 8 minutos, reduziu drasticamente, mas não foi capaz de eliminar totalmente a contaminação por Salmonella enteritidis. A cocção de ovos em por 1:00 minuto reduziu drasticamente, mas não foi capaz de eliminar totalmente a contaminação por Salmonella enteritidis. O preparo convencional de ovos tipo pochê em chama de gás reduziu drasticamente, mas não foi capaz de eliminar totalmente a contaminação por Salmonella enteritidis. Novamente, a cocção de ovos tipo poché em FMO eliminou totalmente a contaminação por Salmonella enteritidis de ovos inoculados, quando o tempo de cocção era igual ou superior a 1m:30s. A cocção de ovos mexidos em ambos os métodos foi capaz de eliminar totalmente a contaminação de ovos inoculados. Sorvete contaminado, mantido a -18ºC, teve grande redução na sua contami¬nação original por Salmonella enteritidis mas deixou, ainda, uma população residual após 35 dias de armazenagem. A população inicial de Salmonella enteritidis contaminante de glacê de ciara reduziu gradativamente na armazenagem refrigerado a (8ºC) mas, continha, ainda, população residual após 7 dias. A escaldarem com o leite fervente no preparo de gemada artificialmente inoculada exerceu efeito "past eur isante" destruindo quase totalmente a contaminação por Salmonella enteritidis. A detecção de células viáveis sobreviventes (101 UFC/g) só foi possível através de cultivo qualitativo. Tanto a variação do pH (3,80 a 4,04), do tempo (4 a 72 horas), quanto a variação da temperatura de armazenagem (8 e 25ºC) tiveram pequeno ou nenhum efeito na redução ou aumento da contaminação por Salmonella enteritidis de maionese. A população de fungos. e leveduras aumentou gradativamente quando maionese contaminada com Salmonella enteritidis. Foi mantida a 25ºC, mas nao quando estocada a 8ºC, no período de 72 horas, independente da variação do pH da amostra de 3,80 a 4,04. Nossos experimentos determinaram que alimentos que contenham ovos e os ovos propriamente ditos, quando apresentam uma carga alta de contaminante como Salmonella enterit idis podem, em alguns casos, trazer risco à saúde consumidor quando sofrem preparo doméstico convencional. / Abstract: The survival of Salmonella enteritidis was determined in artificially contaminated eggs cooked using both a gas flame and microwave oven (MWO). It was also determined in foods prepared with contaminated eggs and stored at different temperatures. The pathogenic Salmonella enteritidis used was phagotype 28, isolated from chicken meat and white eggs produced commercially. The following foods were examined, having been contaminated with approximately to 106 to 108 UFC: eggs cooked in boiling water for 8 minutes or in the microwave oven for 1 minute, scrambled eggs, poached eggs; mayonnaise, egg white glaze; milk drink containing beaten egg yolk, vanilla ice-cream. The quantitative recuperation of Salmonella enteritidis contamination was carried out by plating decimal dilutions of the sample on agar in duplicate. For the qualitative determination, an enrichment procedure was used to check for the presence or absence of viable cells in the original sample. Using the same time period, MWO cooking was more efficient than boiling water in eliminating Salmonella enteritidis. Boiling in water for 8 minutes reduced the count drastically, but was not capable of eliminating the Salmonella enteritidis completely. Similarly, poaching eggs over a gas flame reduced the count drastically but did not completely eliminate Salmonella enteritidis contamination, whereas MWO totally eliminated it if a cooking time equal or greater to 1 min 30 sees was used. Both methods of cooking scrambled eggs completely eliminated the contamination. When contaminated ice-cream was stored at -18ºC, a considerable reduction in the Salmonella enteritidis count occurred, but after 35 days of storage, there was still a residual population. In egg white glaze- the- initial population of Salmonella enteritidis declined gradually during refrigerated storage (8ºC), but there was still a residual population after 7 days. In the milk drink containing beaten egg yolk, the scalding of the contaminated yolk with boiling milk effectively pasteurized the yolk, almost completely destroying the Salmonella enteritidis contamination. The detection of surviving viable cells- was only possible by way of qualitative cultivation (101 UFC/g). With respect to mayonnaise, variations in pH (3.80 - 4.04), time (4-7S hours) and storage temperature (8 e 25ºC) had little or no effect on the reduction or increase of the Salmonella enteritidis contamination. The yeast and mould count increased gradually when maionese contaminated with Salmonella enteritidis was held at 25ºC, but not when held at 8ºC for a period of 72 hours, independent of the variation in sample pH (from 3.80 to 4.04). These experiments showed that foods containing eggs can, in some cases, present health risks to the consumer when prepared by conventional domestic methods, if the original eggs show a high level of contamination by Salmonella enteritidis. / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En la actualidad la detección de cepas bacterianas resistentes a múltiples agentes antimicrobianos parece ir en aumento y se atribuye principalmente a la inadecuada utilización de ellos. Estos fármacos han permitido la selección de genes de resistencia en bacterias zoonóticas, como Salmonella, los cuales pueden diseminarse a los seres humanos a través de la cadena alimentaria. Además cobra importancia el rol de las aves silvestres como reservorios y agentes diseminadores de genes de resistencia a antibióticos hacia los seres humanos y otros animales. El objetivo de esta Memoria de Título fue comparar los perfiles genéticos de resistencia antimicrobiana de cepas de S. enterica ser. Enteritidis aisladas desde aves silvestres, aves comerciales y seres humanos en Chile, y determinar su relación con el hospedero de origen de estas cepas. Se analizaron 96 cepas en total, de las cuales 33 fueron aisladas desde aves silvestres, 31 de aves comerciales y 32 de seres humanos. Se utilizó la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para determinar los perfiles de resistencia antimicrobiana. Los genes seleccionados fueron: tet(A), tet(B), tet(G) (resistencia a tetraciclinas), blaPSE-1, blaTEM, blaCMY (resistencia a β-lactámicos), aadB, aacC (resistencia a aminoglicósidos) y además se detectó la presencia de integrones clase 1. Para determinar la asociación de los perfiles genéticos de resistencia con su hospedero de origen se utilizó el programa Infostat®. De las 96 cepas analizadas en esta Memoria, se encontraron 13 perfiles genéticos de resistencia antimicrobiana diferentes, los cuales resultaron estar asociados con el hospedero de origen de las cepas. Adicionalmente, los datos obtenidos fueron analizados con la finalidad de determinar la asociación de genes de resistencia antimicrobiana con hospedero de origen de las cepas, siendo tet(A) el único gen asociado a cepas obtenidas de aves silvestres. Los resultados de esta Memoria proporcionan evidencia sobre los efectos colaterales que provoca la sobreutilización de antimicrobianos en el medio ambiente, impactando indirectamente en la fauna silvestre

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En los últimos años se han utilizado biotecnologías, como los bacteriófagos, para controlar patógenos bacterianos asociados a enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), tales como Campylobacter spp., E. coli 0157H7 y Salmonella enterica. Si bien en un inicio se realizaron fagoterapias directamente en los animales de abasto, hace poco más de una década se inició el biocontrol de estos agentes biológicos directamente en los alimentos, tanto a temperatura de refrigeración como ambiental. Los resultados internacionales indican que la aplicación directa de ellos logra reducir en rangos variables los recuentos bacterianos, sin producir cambios organolépticos. El objetivo de este estudio fue establecer la efectividad de una mezcla de fagos líticos nativos en la reducción de los recuentos de Salmonella Enteritidis (SE), en dos matrices alimentarias como son las cecinas cocidas, particularmente el jamón de pavo y la vienesa pollo. Para esto se trabajó con dos grupos de 25 muestras cada uno: el grupo experimental se contaminó con SE y se le aplicó la mezcla de fagos (MOI 105), en tanto que el grupo control sólo se contaminó con la cepa desafío. La dosis de contaminación varió según la temperatura de incubación de las muestras. Una vez contaminada y aplicada la mezcla de fagos, las muestras se incubaron por 10 días a temperatura ambiente (18 ºC) y a temperatura de refrigeración (4 ºC) para luego realizarles recuento bacteriano. Pasados los 10 días se observó que la aplicación de la mezcla de bacteriófagos redujo significativamente (p < 0,0001) los recuentos de SE en jamón de pavo mantenidos a temperatura ambiente, logrando una leve reducción de 0,48 unidades logarítmicas de SE/g mientras que en las muestras que permanecieron a temperatura de refrigeración se obtuvieron mayores reducciones del orden de 1,72 unidades logarítmicas de SE/g. Para vienesa pollo, la mezcla de fagos redujo los recuentos en 1,13 unidades logarítmicas de SE (p < 0,05) para el grupo que permaneció a temperatura ambiente mientras que en el grupo a temperatura de refrigeración se logró obtener reducciones significativas de 0,48 unidades logarítmicas (p < 0,05) de SE. Los resultados obtenidos indican que la efectividad de esta mezcla de fagos líticos depende de la matriz alimentaria y que podría ser una alternativa para el biocontrol de SE en jamón de pavo y vienesa de pollo a temperatura ambiente y de refrigeración por 10 días. / In recent years, biotechnological tools, as bacteriophages, have been used to control bacterial pathogens associated with food-borne diseases, such as Campylobacter spp., E. coli 0157:H7 and Salmonella enterica. While initially performed direct phagetherapies were performed in livestock, just over a decade ago the biocontrol direct in Food began, both cooling and room temperature. The international data have shown that the bacteriophage direct application reduce, in variable ranges, the bacterial counts, with no organoleptic changes. The aim of this study was to establish the effectiveness of a native lytic bacteriophage cocktail in reducing Salmonella Enteritidis (SE) counts, in two processed food matrices, as turkey breast ham and chicken sausage. Thus, two groups of 25 samples each one were differentiated: the experimental group was inoculated with SE and receive the phage cocktail (MOI 105), in so far as the control group was only inoculated with the bacterial strain. The inoculation dose varied according to the storage temperature of the samples. Once contaminated and added with the phage cocktail, the samples were incubated for 10 days at room (18 ºC) and cooling (4 ºC) temperature, to next perform the bacterial count. After 10 days a significant bacterial count reduction (p < 0.0001) was observed due to the application of the phage cocktail in turkey breast ham stored at room temperature, achieving a slight reduction of 0.48 log CFU/g, while in the samples stored at cooling temperature higher reductions were obtained, around 1.72 log UFC/g. In chicken sausage, the phage cocktail reduced the bacterial counts in 1.13 log UFC/g (p < 0.05) in the samples stored at room temperature, while in the samples stored at cooling temperature the reduction were of 0.48 log CFU/g (p < 0.05). The present results indicates that the effectiveness of this lytic bacteriophage cocktail depends strongly in the type of food matrix, and that could be an alternative tool for the biocontrol of SE in turkey ham and chicken sausages at room and cooling temperatures for 10 days. / Financiamiento: Proyecto FONDECYT 1110038.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella Enteritidis continúa siendo una zoonosis emergente tanto en Chile como en el mundo entero, principalmente asociada al sector avícola. Los productores de aves han realizado esfuerzos para implementar medidas de control y prevención frente a este enteropatógeno, sin embargo estas medidas aún no han mostrado la eficiencia esperada. En la actualidad en el sector avícola se están realizando novedosas investigaciones sobre el uso de bacteriófagos líticos como biocontroladores frente a patógenos de importancia en salud publica. El objetivo de este trabajo fue demostrar la eficiencia de tres bacteriófagos líticos frente a la colonización de SE en pollos SPF experimentalmente infectados, estudiando su administración solos o en asociación y diferentes vías de administración. En una primera experiencia se formaron 5 grupos de 30 pollos SPF de 10 días de edad cada uno, estos fueron tratados con fagos, individuales y en asociación (mezcla) con una MOI de 103 UFP y posteriormente las aves fueron desafiadas con 8,5x105 UFC/ml de SE. A los 20 días de edad las aves recibieron eutanasia, obteniendo muestras individuales de intestino y pool de órganos (hígado, corazón y bazo), para bacteriología cualitativa y cuantitativa. Los grupos controles fueron: uno tratado solo con fagos, otro que recibió solo cepa desafío y un tercer grupo que no recibió tratamiento ni desafío. En una segunda experiencia se formaron 3 grupos de 22 pollos libres de Salmonella spp y provenientes de madres no vacunadas. Al día 9 de edad, dos grupos recibieron una mezcla de los tres fagos (MOI 103 cada uno), uno por aerosol y otro por agua de bebida. Un día después, los tres grupos fueron desafiados con 9,6 x 105 UFC/ml de SE. A los 10 días post infección las aves recibieron eutanasia obteniendo muestras individuales de intestino y pool de órganos (hígado, corazón y bazo), para bacteriología cualitativa y cuantitativa. En la primera experiencia, solo las aves tratadas con la mezcla de fagos (58,6%) y el fago 3 de forma individual (53,3%) disminuyeron significativamente el número de aves infectadas (P= 0,0154 y P= 0,0099 respectivamente) comparado con el grupo control de infección (86,6%). Mediante bacteriología cuantitativa se demostró que la terapia con mezcla, fago 1 y fago 3 redujeron el recuento de SE en contenido intestinal, desde 108 UFC/g hasta 105/UFC/g. El fago 2 logró una menor disminución en los recuentos (107UFC/g). En relación a las vías de administración, la bacteriología cualitativa reveló diferencias estadísticas en el total de aves infectadas solo en el grupo de aves que recibió la mezcla de fagos por vía aerosol (P= 0,0084) donde se logró un nivel de infección de 72,7% comparado con el 100% de infección detectado en el grupo control. En las aves que recibieron la mezcla de fagos en el agua de bebida se detectó un nivel de infección del 90,9%. En relación al recuento bacteriano las aves tratadas con fagos por ambas vías, aerosol y agua de bebida, lograron reducir significativamente SE a nivel intestinal (P< 0,01 y P< 0,05 respectivamente), mientras que solo la terapia por agua de bebida fue capaz de disminuir los recuentos a nivel sistémico (P= 0,014). El grupo que solo recibió fago y el grupo control sano no evidenciaron algún tipo de alteración clínica ni lesiones macroscópicas a la necropsia, hecho que aseguró la inocuidad de los fagos, y de las vías de administración y descartó una posible contaminación entre los grupos experimentales. Con los resultados obtenidos se concluye que la terapia preventiva de fagos podría constituir una herramienta promisoria para el biocontrol de Salmonella Enteritidis en el sector avícola, disminuyendo la incidencia y la colonización intestinal y sistémica. A pesar que quedan desafíos pendientes respecto a la incorporación de partículas virales en animales, esta experiencia sugiere que la fagoterapia es una medida fácil y económica para ser aplicada a gran escala en la producción aviar.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella Enteritidis (S.E.) se encuentra ampliamente distribuida alrededor del mundo, causando problemas en salud pública y pérdidas económicas para los países, particularmente para la industria avícola. Las aves de corral son el principal reservorio de este enteropatógeno y dentro de los productos avícolas, el huevo presenta una mayor importancia epidemiológica en los brotes causados por esta bacteria. Debido a que las medidas de control no han sido lo suficientemente satisfactorias y, producto del desarrollo de resistencia a antimicrobianos, renace el interés por el uso de bacteriófagos líticos como una herramienta terapéutica y profiláctica. El objetivo de este estudio fue determinar si una mezcla de tres bacteriófagos líticos, administrados de manera profiláctica, era capaz de disminuir la incidencia de infección y el recuento (UFC/g) de S.E. en el tracto reproductivo (ovario y oviducto) de gallinas infectadas experimentalmente. Para ello, se utilizaron 80 gallinas comerciales de postura Hy Line Brown, de 22 semanas de edad, las que se dividieron de manera aleatoria en cuatro grupos; control negativo (A, no recibió fagos ni S.E.), control de inocuidad de fago (C, solo se le administraron fagos), control de infección (B, solo desafiadas con S.E.) y grupo terapia (D, fagos y S.E.). Las aves pertenecientes a los grupos C y D, recibieron por tres días consecutivos una dosis de 1011 UFP/cada fago/mL (MOI 103), por vía oral forzada y al cuarto día del ensayo, las gallinas de los grupos B y D, fueron desafiadas con S.E. a una dosis total de 2,4 x 108 UFC, por vía oral. Al décimo día post infección se procedió al sacrificio de las aves, para la obtención de muestras separadas de ovario y oviducto, las que se analizaron mediante bacteriología cualitativa y cuantitativa (UFC/g). La bacteriología cualitativa reveló a nivel de ovario, un 43,3% de positividad en el grupo control de infección, mientras que en el grupo tratado con bacteriófagos el porcentaje alcanzó un 30%, reducción (13,3%) que no fue estadísticamente significativa (p=0,2839). Situación similar ocurrió en tejido oviductal, en donde la incidencia de S.E. en el grupo control de infección (23,3%) y en el grupo que recibió fagos (10%), no presentaron diferencias estadísticamente significativas (p=0,1659). 4 En cuanto a la bacteriología cuantitativa, el tratamiento con bacteriófagos no logró disminuir significativamente el recuento de S.E. a nivel oviductal (p=0,1007), mientras que en ovario, la utilización profiláctica del cóctel de fagos redujo significativamente (p=0,0489) la colonización de la bacteria, al compararlo con los recuentos del grupo control de infección (0,95 versus 0,31 UFC log10). Las aves pertenecientes al grupo control de inocuidad de fago, se observaron asintomáticas durante toda la experiencia y no presentaron lesiones patológicas macroscópicas al momento de la necropsia. De acuerdo a los resultados obtenidos en este trabajo, se concluye que la utilización profiláctica de una mezcla de tres bacteriófagos líticos, en gallinas de postura no fue eficaz en reducir la incidencia de infección ni los recuentos de S.E. en tejidos reproductivos, exceptuando la colonización a nivel ovárico (recuento). La actividad lítica de estos virus demostrada sólo en el tejido ovárico, sugiere que una mayor investigación es necesaria para determinar el verdadero aporte de la utilización de bacteriófagos como biocontroladores de S.E. en gallinas de postura.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella spp. es uno de los principales patógenos involucrados en enfermedades transmitidas por los alimentos, siendo el serotipo Enteritidis el que más se asocia a productos derivados de la industria avícola, principalmente a los huevos. Es por esto que se han buscado diversas medidas de control en gallinas comerciales de postura, no logrando éstas ser completamente eficientes. Los bacteriófagos podrían ser una potencial alternativa para el control de Salmonella Enteritidis (S.E.) en huevos ya que demostraron ser inocuos para las células eucariotas y logran reducir una variedad de patógenos en diversos alimentos. El objetivo del presente trabajo fue determinar in vitro la efectividad de una mezcla de bacteriófagos sobre Salmonella Enteritidis en yemas y albúminas de huevos. Se trabajó con tres grupos de huevos SPF: grupo control de infección que sólo recibió S.E. (101 UFC/0,1 mL), grupo control de fagos que sólo recibió fagos (106 UFP/0,1 mL) y tres grupos que recibieron S.E. (101 UFC/0,1 mL) y fagos en distintas concentraciones (MOI de 103, 104 y 105 /0,1 mL). Albúminas y yemas por separado fueron inoculadas con la cepa desafío S.E. nalr rifr y luego de dos horas a temperatura ambiente, se les administró la mezcla de tres fagos líticos. Las muestras fueron mantenidas a 37 ºC por 24 horas (protocolo de 24 horas) y por 48 horas (protocolo de 48 horas), antes de ser analizadas por bacteriología cualitativa y cuantitativa (recuento bacteriano). Los fagos no lograron disminuir (p > 0,05) la incidencia de S.E. en las muestras de yemas, presentándose un 100% de positividad, tanto para el protocolo de 24 horas como para el de 48 horas, independiente de la MOI utilizada. En las muestras de albúminas, los fagos no lograron disminuir (p > 0,05) la incidencia de S.E. en el protocolo de 24 horas, presentándose un 100% de positividad. En el protocolo de 48 horas, los fagos no disminuyeron (p > 0,05) la incidencia de S.E. en albúminas tratadas con una MOI de 103 (96%) y 104 (100%), pero sí lo hicieron (p < 0,05) en albúminas tratadas con una MOI de 105 (68% de positividad) Los resultados de la bacteriología cuantitativa en los grupos experimentales demostraron que los fagos disminuyen (p < 0,05) los recuentos de S.E. en yemas en 2,53 log10 (MOI 105), en 2,26 log10 (MOI 104) y en 2,32 log10 (MOI 103) en relación al grupo control de infección, para el protocolo de 24 horas. Para el protocolo de 48 horas, los recuentos disminuyeron (p < 0,05) en 0,48 log10 (MOI 103), en 0,35 log10 (MOI 104) y en 0,25 log10 (MOI 105), en relación al grupo control de infección. En las muestras de albúminas tratadas con fagos, los recuentos de S.E. aumentaron (p < 0,05) en 2,4 log10 (MOI 103) y en 1,55 log10 (MOI 104) en relación al grupo control de infección, mientras que en el grupo tratado con una MOI 105 (4,49 log10), no hubo diferencias significativas (p > 0,05) en relación al grupo control (3,07 log10), para el protocolo de 24 horas. Para el protocolo de 48 horas, los recuentos de S.E. disminuyeron (p < 0,05) en 1,81 log10 (MOI 105) y en 1,35 log10 (MOI 103) en relación al grupo control de infección, mientras que en el grupo tratado con una MOI 104 (3,00 log10), no hubo diferencias significativas (p > 0,05) en relación al grupo control de infección (3,55 log10). Con los resultados obtenidos se concluye que el uso de fagos líticos podría ser una herramienta eficaz en la reducción de Salmonella Enteritidis en huevos, sin embargo mayores estudios son necesarios para optimizar el modelo experimental

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Las infecciones por Salmonella enteritidis, han aumentado considerablemente en Chile y en el mundo entero. Esta zoonosis se transmite principalmente por el consumo de productos contaminados, siendo el reservorio más frecuente las aves. Este hecho ha canalizado los esfuerzos hacia métodos de control eficientes, que excluyan el uso de antibióticos, debido a los altos niveles de multirresistencia observados en este enteropatógeno.El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del bacteriófago f3alfaSE, de origen aviar, sobre la colonización de Salmonella enteritidis en un modelo de aves, para esto se trabajó con pollos broiler. A los 10 días de edad se formaron 5 grupos de 15 pollos cada uno. El grupo 1 se inoculó con una relación bacteria/fago 1:1, el grupo 2 fue inoculado con una relación bacteria/fago 1:10, el grupo 3 constituyó el control de infectividad de la cepa de Salmonella entritidis nal elevado a r rif elevado a r recibiendo una dosis de 4 x 10 elevado a 9 UFC/ml, el grupo 4 fue inoculado sólo con el fago en una dosis de 10 elevado a 10 UFP/ml, constituyendo el grupo control de inocuidad del fago, se contó además con un quinto grupo, que no recibió fago ni bacteria, para controlar la contaminación cruzada del fago entre las unidades experimentales. Después de 10 días de la inoculación fago/bacteria, se efectuó la eutanasia de las aves y se procedió al reaislamiento de la cepa desafío a partir de intestino y corazón e hígado ("pool" de órganos) de cada una de las aves. La inoculación del fago en una dosis de 10 elevado a 9 UFP/ml, disminuyó en forma significativa el número de aislamientos de Salmonella desde hígado y corazón vs el grupo control, no así desde intestino. El fago administrado en una dosis de 10 elevado a 10 UFP/ml disminuyó significativamente los aislamientos de Salmonella a nivel intestinal vs el grupo control, no ocurriendo lo mismo en órganos internos. En el grupo control de inocuidad del fago, inoculado con 10 elevado a 10 UFP/ml, no se observó daño en órganos internos a nivel macroscópico. Se concluye que el uso de bacteriófago f3alfaSE sería eficaz en disminuir la colonización intestinal y sistémica de pollos desafiados con una cepa de Salmonella enteritidis / Proyecto FIV 3718-2