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Antibiotic resistance is a growing threat to human health and is defined by the World Health Organization as a crisis that must be managed with the utmost urgency. Antibiotic resistant bacteria increase both mortality and morbidity and have a great impact on the global economy. Resistance is not confined to human health care, but is present also among animals and in our environment at large. Indeed, resistant bacterial strains have now been found in virtually all parts of the world, even in locations without direct human contact. The human gastrointestinal tract is populated by a complex, dynamic, diverse and highly interactive collection of microorganisms, including bacteria, archaea, fungi, yeasts and viruses, which constitutes our gastrointestinal microbiota. This microbiota is an important reservoir of resistance genes (our gastrointestinal resistome) and a “melting pot” for transfer of resistance genes between microbes, including potential pathogens. In this thesis I investigated the prevalences of two clinically important kinds of antibiotic resistance: extended-spectrum β-lactamases (ESBL) and vancomycin-resistant enterococci (VRE), as well as asymptomatic carriage of potential enteropathogens among healthy preschool children in Uppsala. Fecal samples from unidentified, individual diapers were collected in 2010 (125+313 samples) and in 2016 (334 samples). In addition, 204 environmental samples from the children’s preschools were collected in autumn 2016. A prevalence of 2.9% ESBL-producing Enterobactericeae was demonstrated in the first samples from 2010. No VRE were found and the occurrence of enteropathogens were reassuringly low. Results on ESBL prevalence in 2016 and transmission of resistance between children will be presented when the manuscript is published and at the dissertation.

Submitted by PATRICK DA SILVA null (patrick_dasilva@ymail.com) on 2016-09-01T14:44:37Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Patrick da Silva.pdf: 3098856 bytes, checksum: 3fb93fb0061cbc5d3f1d4f4066945e07 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-09-01T18:20:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_p_me_arafcf.pdf: 3098856 bytes, checksum: 3fb93fb0061cbc5d3f1d4f4066945e07 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T18:20:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_p_me_arafcf.pdf: 3098856 bytes, checksum: 3fb93fb0061cbc5d3f1d4f4066945e07 (MD5) Previous issue date: 2016-07-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Sinalização química em bactérias patogênicas é um mecanismo empregado para interagir com o hospedeiro e sua respectiva microbiota. Através desta interação ocorre a regulação dos mecanismos de virulência. Estudando o mecanismo de sinalização química do sistema de 2-componentes QseBC em Salmonella enterica serovar Typhimurium foi aberta uma nova perspectiva para desvendar os mecanismos de patogenicidade. Dentre estes, uma nova proteína VisP (Virulence and stress-related Periplasmic protein) foi reportada. Seu papel inicial na interação com a enzima LpxO em S. Typhimurium foi anteriormente demonstrada. O antígeno-O da camada de LPS fornece proteção contra as defesas do hospedeiro e, particularmente, o comprimento de sua cadeia exerce um papel essencial. A montagem do antígeno-O possui o sistema Wzz, o qual determina o comprimento final de sua cadeia polissacarídica, e também apresenta uma distribuição tri-modal. Forma cadeias curtas (S-OAg), longas (L-OAg) e muito longas (VL-OAg) de antígeno-O. As proteínas WzzST e WzzfepE regulam, respectivamente, a síntese das cadeias L-OAg e VL-OAg. Neste estudo, os genes wzzST, wzzfepE, visP e lpxO foram mutados, via mutagênese λ Red, obtendo simples e duplos mutantes. Dados preliminares evidenciaram que há um aumento nas cadeias VL-OAg e L-OAg no mutante ΔvisP, e reciprocamente há diminuição de L-OAg em ΔlpxO. Foram feitos ensaios para avaliar a motilidade, invasão em células epiteliais e sobrevivência intracelular em macrófagos com as amostras obtidas pelos ensaios de mutagênese. Foi evidenciado uma redução de 1,2 e 1,0 ordem de magnitude nos processos de invasão e sobrevivência intracelular, respectivamente, no mutante ΔvisP em relação à amostra selvagem, conforme já descrito, e também uma redução de 70,61% na motilidade comparada com à amostra selvagem. Observou-se que a deleção dos genes wzzfepE e lpxO no mutante ΔvisP faz com que a bactéria retorne ao fenótipo da amostra selvagem nos processos de motilidade, invasão em células epiteliais e sobrevivência intracelular em macrófagos. Este efeito de complementação fenotípica não ocorre no mutante duplo ΔwzzST, apresentando os mesmos níveis do mutante simples ΔvisP, apesar deste possuir um aumento na expressão de genes envolvidos na motilidade e invasão celular comparado com o mutante ΔvisP. Aparentemente, há a atenuação destes processos patogênicos em bactérias com um alto nível de VL-OAg, levando-nos a hipotetizar que este tipo de cadeia de antígeno-O possui relevância na patogênese de S. Typhimurium. WzzfepE e LpxO apresentaram uma evidente participação nos processos de motilidade, invasão celular e sobrevivência intracelular via VisP, e possivelmente o antígeno-O de comprimento muito longo (VL-Oag) apresenta um papel de inibição nestes processos, além disso, evidenciou-se que VisP desempenha uma função relevante na montagem das cadeias de antígeno-O e na patogênese de S. Typhimurium. / Chemical signaling is a mechanism employed by several bacterial species to interact within surrounding microbiota and their host. Upon this interaction the pathogenic bacteria regulate their virulence traits. The two-component system QseBC was described on chemical signaling in Salmonella enterica serovar Typhimurium, and a novel branch of pathogenic cascade regulation was revealed. Among these mechanisms a novel protein was described, VisP (Virulence and stress related Periplasmic protein). VisP interacts with LpxO enzyme on the periplasm. The O-antigen of the LPS layer provides protection against host defenses, and particularly its chain’s length plays an essential role. The O-antigen assembly has the Wzz system, which determines the O-antigen final chain length, and also presents a tri-modal distribution. It forms short (S-OAg), long (L-OAg) and very-long (VL-OAg) O-antigen chains. The WzzST and WzzfepE proteins respectively regulate the L-OAg and VL-OAg synthesis. In this study, wzzST, wzzfepE, visP and lpxO genes were mutated via λ Red mutagenesis, obtaining single and double-mutants. Our preliminary data have shown that VisP increases VL-OAg and L-OAg, conversely LpxO diminishes L-OAg chain length. The motility, epithelial cell invasion and macrophage intracellular survival and replication were assessed with the mutants obtained. The ΔvisP presented 1,2 and 1,0 order of magnitude reduction in cell invasion and intracellular macrophage replication, respectively, comparing with WT S. Typhimurium, as described, and 70,61% less motility rate than WT. Mutating wzzfepE or lpxO genes in ΔvisP recovers the motility, epithelial cell invasion and macrophage intracellular survival and replication WT phenotypes. Nonetheless, this effect does not occur with wzzST gene deletion in ΔvisP, as this double-mutant presents the same phenotypes of ΔvisP single-mutant, although this deletion raises expression rates of motility and cell invasion related genes significantly. Apparently, these pathogenic processes are attenuated within samples with VL-Oag high levels, taking us to hypothesize that there is a correlation between this O-antigen chain length and S. Typhimurium pathogenesis. WzzfepE and LpxO presented an important role on motility, epithelial cells invasion and macrophage intracellular survival through VisP, and probably the VL-OAg inhibits these processes. Furthermore, VisP plays a relevant function on O-antigen chain assembly and pathogenesis of S. Typhimurium. / CNPq: 134434/2014-5

Orientador: Márcio Garcia Ribeiro / Resumo: Os patógenos entéricos são um grupo complexo de micro-organismos que causam doenças em animais e humanos. Os gatos domésticos podem ser considerados carreadores de patógenos entéricos com potencial zoonótico devido ao hábito de auto-limpeza, estabelecer amplo território, pelo instinto de caça e eliminar subclinicamente patógenos. O presente estudo investigou a ocorrência de Escherichia coli, Salmonella sp., Clostridium spp. e Rhodococcus equi nas fezes de 200 gatos domésticos sem sinais entéricos, dos quais 100 pertenciam ao ambiente urbano e 100 à áreas rurais. Marcadores de virulência de E. coli, Clostridium spp. e R. equi também foram investigados. Do total de 200 amostras fecais avaliadas foram identificadas 175 (88%) linhagens de E. coli das quais 93 (93%) de gatos de ambiente urbano e 82 (82%) de gatos de área rural. Houve diferença significante (p=0,03) entre os grupos para frequência mais alta de isolamento de E. coli em gatos de ambiente urbano. Dentre os marcadores de virulência de E. coli foram identificados os genes eae (13%), escN (13%), stx1 (1%), stx2 (0,6%), aatA (0,6%) e ipaH (0,6%). Foram isoladas 86 (43%) linhagens de C. perfringens A, das quais em 21 (24%) foi detectado o gene cpb2, que codifica a toxina beta 2 e em uma (1%) linhagem foi identificado o gene cpe, responsável pela codificação da enterotoxina. Também foram identificados cinco (2%) isolados de C. difficile, dos quais um (20%) apresentou os genes tcdA e tcdB, codificadores das toxinas A e B, re... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Enteric pathogens are a complex group of microorganisms associated to diseases in animals and humans. Domestic cats may be considered carriers of enteric pathogens with zoonotic potential, due to habit of self-cleaning, to establish wide territory of life, by hunting behavior, and subclinical elimination of pathogens through feces. The aim of present study was investigate the occurrence of Escherichia coli, Salmonella sp., Clostridium spp., and Rhodococcus equi in 200 fecal samples of cats without enteric signs, of which 100 cats belonging to urban area and 100 to farm environment. Virulence markers from E. coli, Clostridium spp. and R. equi were also tested. Among 200 fecal samples were identified 175 (88%) E. coli strains, from these, 93 (93%) were from feces of cats breeding in urban areas, whereas 82 (82%) were from animals from farms. Statistical difference was observed (p=0.03) to higher identification of E. coli from cats breeding in urban area. Genes eae (13%), escN (13%), stx1 (1%), stx2 (0,6%), aatA (0,6%) e ipaH (0,6%) were indentified from virulent markers in E. coli strains. Eighty-six (43%) C. perfringens A were isolated. From these, cpb2 gene (which encodes beta 2 toxin) was detected in 21 (24%) isolates, and cpe gene (which encodes enterotoxin) was identified in another (1%) isolate. Five (2%) strains of C. difficile were also identified. From these, only one (20%) presented tcdA e tcdB genes, which encodes A and B toxins, respectively. Were isolated also unco... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Para determinar a prevalência e epidemiologia dos enteropatógenos bacterianos e parasitários na diarréia aguda infantil, foram estudadas 290 crianças menores de 24 meses com diarréia e 290 crianças controles, que procuraram o serviço de emergência do Hospital Infantil Arlinda Marques em João Pessoa, Nordeste do Brasil. Enteropatógenos foram identificados em 78,2% dos casos e em 12,4% dos controles; Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) foi o patógeno mais freqüente sendo detectada em 25% dos casos e em 8,3% dos controles; seguida por E. coli enteropatogênica (EPEC) em 11% dos casos (dos quais 9,3% foram cepas atípicas) e em 0,3% dos controles; E. coli Enterotoxigência (ETEC) em 10% dos casos e 2,8% dos controles; Salmonella sp em 7,9% dos casos; Shigella sp em 4,1% dos casos; E. coli enteroinvasora (EIEC) em 1,7% dos casos; Campylobacter sp em 2,4% dos casos e enteroparasitas foram detectados em 15,5% dos casos e 1,0% dos controles. Infecções mistas foram verificadas em 32 (11%) casos e em apenas 1 (0,3%) controle. A faixa etária mais atingida foi a dos menores de um ano e as associações mais frequentes ocorreram entre EAEC + Salmonella e EAEC + EPEC atípica. Neste estudo foram identificados fatores de risco associados com episódios de diarréia em crianças de acordo com o agente etiológico bacteriano. As análises estatísticas demonstram uma importante associação de EAEC com diarreia aguda infantil em João Pessoa, Brasil, sendo a ingestão de leite de vaca em pó e a exposição a aglomerados e creche os fatores de risco mais associados a diarreia causada por EAEC. / In order to determine the prevalence and epidemiology of enteropathogens in acute infantile diarrhoea, 290 infants younger than 24 months of age with diarrhoea and 290 age-matched control subjects who came to ER of the Hospital Infantil Arlinda Marques in João Pessoa, Northeastern of Brazil were studied. Enteropathogens were identified in 78,2% of case infants and 12,4% of controls. Enteroagregative Escherichia coli (EAEC) was the most frequently found pathogen and was detected in 25,0% of cases and 8,3% of controls. The second most frequent pathogen was Enteropathogenic E. coli (EPEC), in 11,0% of cases and 0,3% of controls, followed by Enterotoxigenic E. coli (ETEC) in 10% of cases and 2,7% of controls; Salmonella sp was found in 7,9% of cases, Shigella sp in 4,1% of cases, Enteroinvasive E. coli (EIEC) in 1,7% of cases and Campylobacter sp in 2,4% of cases. Enteroparasites were detected in 15,5% of cases and 1,0% of controls. Mixed infections (more than one pathogen) were found in 32 (11%) of cases and in only 1 (0,3%) control. The most affected age group was of those smaller than 1 year of age and the most frequent associations were of EAEC + Salmonella e EAEC + atypical EPEC. In this study risk factors associated with episodes of diarrhoea among infants by bacterial etiological pathogens were identified. Statistical analysis demonstrated a significant association of Enteroagregative E. coli (EAEC) with acute infantile diarrhoea in João Pessoa, Brazil. The risk factors most strongly associated diarrhoea caused by EAEC were the ingestion of powdered cow milk and exposure to crowds and day care centres.

Para determinar a prevalência e epidemiologia dos enteropatógenos bacterianos e parasitários na diarréia aguda infantil, foram estudadas 290 crianças menores de 24 meses com diarréia e 290 crianças controles, que procuraram o serviço de emergência do Hospital Infantil Arlinda Marques em João Pessoa, Nordeste do Brasil. Enteropatógenos foram identificados em 78,2% dos casos e em 12,4% dos controles; Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) foi o patógeno mais freqüente sendo detectada em 25% dos casos e em 8,3% dos controles; seguida por E. coli enteropatogênica (EPEC) em 11% dos casos (dos quais 9,3% foram cepas atípicas) e em 0,3% dos controles; E. coli Enterotoxigência (ETEC) em 10% dos casos e 2,8% dos controles; Salmonella sp em 7,9% dos casos; Shigella sp em 4,1% dos casos; E. coli enteroinvasora (EIEC) em 1,7% dos casos; Campylobacter sp em 2,4% dos casos e enteroparasitas foram detectados em 15,5% dos casos e 1,0% dos controles. Infecções mistas foram verificadas em 32 (11%) casos e em apenas 1 (0,3%) controle. A faixa etária mais atingida foi a dos menores de um ano e as associações mais frequentes ocorreram entre EAEC + Salmonella e EAEC + EPEC atípica. Neste estudo foram identificados fatores de risco associados com episódios de diarréia em crianças de acordo com o agente etiológico bacteriano. As análises estatísticas demonstram uma importante associação de EAEC com diarreia aguda infantil em João Pessoa, Brasil, sendo a ingestão de leite de vaca em pó e a exposição a aglomerados e creche os fatores de risco mais associados a diarreia causada por EAEC. / In order to determine the prevalence and epidemiology of enteropathogens in acute infantile diarrhoea, 290 infants younger than 24 months of age with diarrhoea and 290 age-matched control subjects who came to ER of the Hospital Infantil Arlinda Marques in João Pessoa, Northeastern of Brazil were studied. Enteropathogens were identified in 78,2% of case infants and 12,4% of controls. Enteroagregative Escherichia coli (EAEC) was the most frequently found pathogen and was detected in 25,0% of cases and 8,3% of controls. The second most frequent pathogen was Enteropathogenic E. coli (EPEC), in 11,0% of cases and 0,3% of controls, followed by Enterotoxigenic E. coli (ETEC) in 10% of cases and 2,7% of controls; Salmonella sp was found in 7,9% of cases, Shigella sp in 4,1% of cases, Enteroinvasive E. coli (EIEC) in 1,7% of cases and Campylobacter sp in 2,4% of cases. Enteroparasites were detected in 15,5% of cases and 1,0% of controls. Mixed infections (more than one pathogen) were found in 32 (11%) of cases and in only 1 (0,3%) control. The most affected age group was of those smaller than 1 year of age and the most frequent associations were of EAEC + Salmonella e EAEC + atypical EPEC. In this study risk factors associated with episodes of diarrhoea among infants by bacterial etiological pathogens were identified. Statistical analysis demonstrated a significant association of Enteroagregative E. coli (EAEC) with acute infantile diarrhoea in João Pessoa, Brazil. The risk factors most strongly associated diarrhoea caused by EAEC were the ingestion of powdered cow milk and exposure to crowds and day care centres.