Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-09-09T13:55:37Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Flávia Regina Santos da Paixão - 2016.pdf: 2930650 bytes, checksum: 6e200c8af02d2dc239dc8ba36d5d8806 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-09-09T15:25:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Flávia Regina Santos da Paixão - 2016.pdf: 2930650 bytes, checksum: 6e200c8af02d2dc239dc8ba36d5d8806 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-09T15:25:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Flávia Regina Santos da Paixão - 2016.pdf: 2930650 bytes, checksum: 6e200c8af02d2dc239dc8ba36d5d8806 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-04-08 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Rhipicephalus microplus engorged females lay their eggs in shaded and humid areas on the soil; these areas seems favorable for entomopathogenic fungi development, where they could be applied for tick control. This study produced pellets based on microesclerotia (ME) of Metarhizium spp. (CG 47, CG 632, IP 46, IP 119, ARSEF 1883 and ARSEF 2575) and assessed their virulence toward R. microplus engorged females under laboratory conditions. Microsclerotia produced in specific liquid medium were processed for pelletization. Conidial production and viability of conidia from each formulated Metarhizium spp. was evaluated by distributing 0,003 g pellets 2% water-agar medium, and incubating them at 27 °C or 32 °C for 15 days. The results showed that the conidial production among isolates was similar at 27 °C or 32 °C, and the viability of the conidia was superior than 90% for conidia produced. Two bioassays were conducted for screening the virulence of isolates against R. microplus: the first one tested 0,007 g of pellets of each Metarhizium spp. isolate; the second one tested different concentrations of IP 119 pellets (0,002, to 0,006 g). Pellets were sprinkled on the surface of 5 g sterile oxisol in Petri dishes, moistened with 2 ml sterile-distilled water. Ten replicates were prepared for each fungal isolate. The plates with pellets were incubated for 15 days at 27 °C and RH > 90% to induce conidial production; plates from control groups did not receive pellets. A female was placed in each plate and monitored daily for 15 days for fungal conidiogenesis on ticks. At day 15, the egg mass was removed from each plate and transferred to a glass vial and incubated at 27 ± 1ºC to quantify the number of hatching larvae hatched. In both bioassays the fungal treatment reduced the oviposition period of females, as well as the number of hatching larvae. A bioassay was conducted with IP 47 and IP 119 at two different temperatures: 27 °C or 32 °C. CG 47 pellets incubated at 27 °C incited conidiogenesis on R. microplus females by day 5, whereas IP 119 iniciated conidiogenesis by day 9. Trials conducted at 32 C revealed conidiogenesis on R. microplus females between day 5 and 6 for both fungi. The number of larvae from females exposed to pellets of CG 47 and IP 119 was reduced.. Tests with pellets of ME produced with the different inert materials showed that pellets with vermiculite presented higher conidial production compared with the pellets prepared with cellulose. Therefore, these results together indicate that the pelletized formulation of ME of Metarhizium spp. was effective in controlling R. microplus under laboratory conditions by reducing the number of offspring. This formulation is a potential mycoacaricide, since the temperature and humidity conditions required for production of infective conidia are conducive to those required by this tick to lay eggsand hatching larva in the environment. / Fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus procuram áreas sombreadas e úmidas no solo para realizar oviposição. Estes locais apresentam um microclima favorável para viabilizar o controle deste artrópode com fungos entomopatogênicos. O objetivo deste estudo foi produzir péletes à base de microescleródios (ME) de Metarhizium spp. (CG 47, CG 632, IP 46, IP 119, ARSEF 1883 e ARSEF 2575) e avaliar sua virulência sobre fêmeas ingurgitadas de R. microplus em condições de laboratório. Os péletes foram obtidos a partir de microescleródios produzidos em meio líquido específico e processados para peletização. A produção de conídios e a viabilidade de cada formulado de Metarhizium spp. foram observadas distribuindo-se 0, 03g de péletes em meio ágar-água 2%, e incubando-os a 27 ºC ou 32 ºC por 15 dias, resultados mostram que a produção de conídios pelo péletes dos isolados foi similar para a temperatura de 27 ºC, sendo a viabilidade dos conídios esporulados superior a 90% em e 32 ºC. Dois bioensaios para triagem da virulência dos isolados contra R. microplus foram conduzidos: o primeiro com 0,007 g de péletes de cada um dos isolados de Metarhizium spp. estudados; e o segundo com quantidades diferentes de péletes (0.002 a0,006 g) do isolado IP 119. Péletes foram distribuídos sobre a superfície de 5 g de latossolo vermelho estéril, em Placas de Petri, umedecido com 2 mL de água destilada estéril. Foram preparadas dez réplicas para cada isolado fúngico. As placas foram incubadas por 15 dias a 27°C e UR> 90% para induzir a produção de conídios a partir dos grânulos. Placas do grupo controle não foram acrescidas de péletes. Após este período, foi adicionada uma fêmea em cada placa e avaliou- se diretamente o início da conidiogênese sobre os carrapatos por 15 dias, e após este período a massa de ovos foi retirada das placas e acondicionada individualmente em tubos de vidro para posterior quantificação das larvas eclodidas. Em ambos os bioensaios, os tratamentos fungicos reduziram o período de oviposição das fêmeas, assim comoo número de larvas eclodidas. Resultado semelhante observado paradiferentes concentrações de péletes do isolado IP 119. Bioensaio similar à metodologia descrita foi conduzido somente com IP 119 e CG 47 em duas temperatura:s 27 ºC ou 32 ºC. Os resultados mostraram que a 27 ºC péletes formulados com ME de CG 47 iniciaram a conidiogênese em fêmeas de R. microplus em tempo médio de 5 dias, e IP 119 em 9 dias. Já os ensaios conduzidos a 32 ºC mostraram que a conidiogênese sobre as fêmeas de R. microplus iniciaram entre o 5° e 6° dia. Para ambos isolados o número médio de larvas eclodidas reduziram.(X 2 = 43.53; df = 2; P <0.001). Péletes de ME com inerte vermiculita apresentaram maior produção de conídios do que o formulado contendo celulose (P = 0,01). Os resultados do presente estudo indicam que a formulação peletizada de ME de Metarhizium spp. foi eficaz no controle de R. microplus em condições de laboratório por reduzir o número de progênies. Esta formulação merece atenção para desenvolver potencial carrapaticida biológico, visto que as condições de temperatura e umidade requeridas para produção de conídios infectivos são similares às requeridas por este carrapato para produção de ovos e eclosão das larvas no ambiente.

Submitted by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-09-12T19:59:58Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andreisa Prieb - 2015.pdf: 1433488 bytes, checksum: 0b16c552ef408a220fc72781528cf757 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-09-12T20:00:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andreisa Prieb - 2015.pdf: 1433488 bytes, checksum: 0b16c552ef408a220fc72781528cf757 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-12T20:00:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andreisa Prieb - 2015.pdf: 1433488 bytes, checksum: 0b16c552ef408a220fc72781528cf757 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-07-10 / Rhipicephalus microplus is one of the main parasites found in Brazilian cattle herds; it is vector of pathogens causing severe economic losses. Currently, the control of R. microplus is conducted almost exclusively by the use of chemical products applied to parasitized hosts; however, the continued use of these products may lead ticks to resistance, and human health to damage. New methods for tick control that causes low damage to humans and to the environment are required; therefore, the use of entomopathogenic fungi has been investigated for biological control purposes, and the fungus Metarhizium has shown efficacy against R. microplus. The current study investigated the the efficacy of M. anisopliae and M. robertsii to control the non-parasitic phase of R. microplus. Bioassays were conducted in Petri dishes containing 5 g of sterile soil and 0.003 g of granules of formulated fungi spread evenly over the soil surface. One engorged female was placed in each plate for evaluation of their biology. The mean number of hatched larvae obtained from groups of females treated with granules of the isolate CG 632 was 604, while 385 larvae were obtained from the groups treated with granules of CG 168, and 87 from groups treated with CG 47; in the control groups, 2,896 larvae hatched. The mean oviposition period of females treated with granules of CG 168 or CG 632 was, respectively, 2.8 and 0.9 days, while in the control groups the mean oviposition period was 14.2 days. The statistical analysis revealed that both the oviposition period of engorged females and the number of hatched larvae showed significance at 1% of probability (P<0.01). The current study revelaed that the fungal isolates tested, M. anisopliae and M. robertsii, formulated in granules were able to reduce progeny of R. microplus under controlled conditions, suggesting their potential to control the non-parasitic phase of the R. microplus tick. / Rhipicephalus microplus é um dos principais parasitos presentes no rebanho bovino brasileiro; é transmissor de agentes patogênicos causadores de doenças como anaplasmose e babesiose, e causador de sérios prejuízos financeiros. Atualmente, o controle de R. microplus é realizado quase que exclusivamente por produtos químicos empregados na fase parasitária; no entanto, a sua utilização contínua pode causar resistência desses parasitos e danos à saúde humana. Desse modo, é necessário descobrir novos meios capazes de realizar o controle dos carrapatos sem causar danos ao ser humano e ao ambiente. A utilização de fungos entomopatogênicos vem sendo estudada para fins de controle biológico e os fungos do gênero Metarhizium vêm mostrando eficácia contra R. microplus. O presente estudo teve o objetivo de investigar o controle da fase não parasitária de R. microplus com os fungos entomopatogênicos: M. anisopliae (CG 47 e CG 168 ) e M. robertsii (CG632). Ensaios foram conduzidos utilizando-se placas de Petri com 5 g de latossolo vermelho estéril e 0,003 g de grânulos fúngicos dos respectivos isolados espalhados de forma homogênea sobre a superfície do solo. Uma fêmea ingurgitada foi colocada em cada placa (10 Placas para cada isolado e 10 placas para o controle de cada isolado) para avaliação de seus parâmetros biológicos. O período de postura das fêmeas tratadas com os isolados CG 168 e CG 47 foi 2,8 e 0,9 dias, enquanto no grupo controle o período de postura foi 14,2 dias. O número médio de larvas recuperadas foi 604 nos grupos tratados com grânulos formulados com o isolado CG 632, enquanto 385 larvas foram recuperadas nos grupos tratados com CG 168, e 87 nos grupos tratados com CG 47; no grupo controle foi observada eclosão média de 2.896 larvas. Houve diferença significativa entre o número médio de larvas eclodidas e o período médio de postura das fêmeas submetidas aos diferentes tratamentos. A análise estatística revelou que tanto o período médio de postura das fêmeas quanto o número de larvas eclodidas, apresentou significância ao nível 1% de probabilidade (P<0,01). O presente estudo permitiu concluir que os isolados testados de M. anisopliae e M. robertsii, formulados em grânulos, foram capazes de reduzir a progênie de R. microplus em condições controladas, sugerindo assim seu potencial para controle da fase não parasitária desse carrapato.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-09T14:01:40Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thainá Rodrigues Santos - 2016.pdf: 1805548 bytes, checksum: d6bfd668c93a575d44e681ffbde761c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-09T14:01:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thainá Rodrigues Santos - 2016.pdf: 1805548 bytes, checksum: d6bfd668c93a575d44e681ffbde761c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-09T14:01:52Z (GMT). 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Thus, the objective of this study was to develop and characterize inorganic pelletized formulations containing microsclerotia of M. anisopliae IP119, assess its stability under storage at 4°C and 40°C and determine its tolerance to UV-B radiation. Methods: Six pellets formulations composed of diatomaceous earth, vermiculite, aluminum magnesium silicate or colloidal silicon dioxide, alone or in combination, were developed and evaluated. The pellets were obtained using the extrusion-spheronization technique and were dried in a fluid-bed dryer with an outlet air temperature kept at 40°C or 50°C. During drying, at pre-determined time intervals, samples were collected for evaluation of the residual moisture content, conidia production and viability. The pellets were also evaluated for their storage stability at 4°C and 40°C. Conidia production and viability were evaluated after storage periods of 7 to 21 days. In addition, UV-B tolerance of the conidia and pellets containing MS was evaluated by exposing them to the artificial light for 4h (irradiance of 541,54 mW/m2) and 12h (irradiance of 1239,23 mW/m2), respectively. Results and Discussion: Inorganic pellets were obtained and the selected formulation was composed by vermiculite, diatomaceous earth and colloidal silicon dioxide (78:20:2), since it showed the best yield (48%), size distribution (from 431.5 to 758.5 μm), average size (584.90 μm ± 122.40) and sphericity (0.75 ± 0.07). There was a considerable reduction of the residual moisture between time 0 (~29%) and 5 minutes (~6%), which remained stable until the end of drying operation. Thus, pellet drying for a 5 minutes period at 40ºC or 50°C resulted in a proper moisture content. Fluid-bed dried pellets presented conidia production always above 1.7x109 conidia/g pellets, with viability > 93%, at all times and for both temperatures. In the pellet storage at 40°C, a contamination was observed after the 7th storage day, without differences in conidia production (~1.3x109 conidia/g of pellets) and viability (> 94%). At 4°C, the conidia production and viability remained stable until the 21th storage day. Regarding the tolerance to UV-B radiation test, the calculated LD50 of M. anisopliae conidia was 5.545 (kJ/m2) ± 0.059. In the exposed pellets containing microsclerotia germination was >98%, and it was observed high conidia production (>1,6x109 conidia/g of pellets). Conclusion: It can be concluded that the inorganic formulation allow to obtain pellets containing fungal material by extrusion-spheronisation technique with maintenance of fungal viability after drying, resulting in a formulation with high UV-B tolerance. This solid platform has a great potential for use in pest biological control. / Introdução e objetivo: Metarhizum anisopliae é uma das espécies de fungos entomopatogênicos mais estudadas em controle biológico por estar naturalmente associada a carrapatos e por apresentar alta virulência em condições laboratoriais. M. anisopliae é capaz de, sob condições in vitro, formar uma estrutura de resistência denominada microescleródio (ME). Os microescleródios têm-se mostrado mais eficazes do que produtos à base de conídios, quando aplicados diretamente ao solo para o controle de algumas pragas. Assim, o objetivo do presente trabalho consistiu em desenvolver e caracterizar formulação inorgânica peletizada contendo microescleródios de M. anisopliae IP119, avaliar sua estabilidade sob armazenamento a 4ºC e a 40ºC, e determinar sua tolerância à radiação UV-B. Métodos: Foram desenvolvidas e avaliadas seis formulações de pellets compostas por terra diatomácea, vermiculita, silicato de alumínio e magnésio ou dióxido de silício coloidal, de forma isolada ou em combinação. Os pellets foram obtidos pela técnica de extrusão-esferonização e a secagem foi realizada em leito fluidizado com temperatura do ar de saída mantida a 40ºC ou 50ºC. Durante a secagem, em intervalos pré-determinados de tempo, amostras foram coletadas para avaliação da umidade residual, produção e viabilidade de conídios. Além disso, avaliou-se a produção e a viabilidade de conídios após armazenamento dos pellets por 7 a 21 dias. Para a avaliação da tolerância de conídios e pellets contendo ME frente a radiação UV-B, os materiais foram expostos por até 4 horas (irradiância de 541,54 mW/m2) ou 12 horas (irradiância de 1239,23 mW/m2), respectivamente. Resultados e Discussão: Pellets com constituintes totalmente inorgânicos foram obtidos e a formulação selecionada foi àquela composta por vermiculita, terra diatomácea e dióxido de silício coloidal (78:20:2), que apresentou características de rendimento (48%), distribuição de tamanho (431,5 a 758,5 μm), tamanho médio (584,90 μm ± 122,40) e esfericidade (0,75 ± 0,07) adequados. Houve redução considerável da umidade residual entre o tempo 0 (~29%) e 5 minutos de secagem (~6%), e a umidade residual permaneceu estável até o final da operação. Dessa forma, a secagem dos pellets pelo período de 5 minutos a 40ºC ou a 50ºC se mostrou satisfatória. Além disso, os pellets selecionados e secos por leito fluidizado apresentaram produção de conídios sempre superior a 1,7x109 conídios/g de pellets, e a viabilidade dos mesmos foi maior do que 93%, em todos os tempos analisados e para ambas as temperaturas. Houve contaminação dos pellets sob armazenamento a 40ºC após o 7º dia de ensaio, sem diferença de produção (~1,3x109 conídios/g de pellets) e de viabilidade (>94%) dos conídios. Já na temperatura de 4ºC, a produção e a viabilidade dos conídios permaneceram estáveis até o 21º dia de armazenamento. No ensaio de tolerância à radiação UV-B, a DL50 estimada para os conídios de M. anisopliae foi de 5,545 ± 0,059 (kJ/m2), ao passo que para os pellets contendo microescleródios foi observada a manutenção da germinação (>98%) e uma elevada produção de conídios (>1,6x109 conídios/g de pellets). Conclusão: No presente trabalho, foi possível obter, pela técnica de extrusão-esferonização, pellets inorgânicos contendo material fúngico, com manutenção da viabilidade fúngica após secagem e alta tolerância à radiação UV-B, representando grande potencial para uso no controle biológico de artrópodes-praga.

Os fungos entomopatogênicos do gênero Metarhizium e Beauveria compreendem um importante grupo de patógenos de artrópodes-praga. A seleção de isolados de fungos promissores é a primeira e uma das mais importantes etapas no desenvolvimento de um biopesticida, pois alguns isolados podem apresentar alta virulência e não necessariamente boa produção em substrato e vice-versa, sendo interessante a combinação desses dois parâmetros para a viabilidade comercial de um produto. A dificuldade de criação ou manutenção de algumas espécies de pragas em laboratório é um limitante para a condução de testes de virulência, tornando-se interessante a utilização de espécies modelo, de fácil criação, nas etapas preliminares de seleção. Nesse sentido, este estudo objetivou selecionar isolados com alta produção de conídios e virulência, comparando a eficiência de controle de M. anisopliae e B. bassiana às pragas alvo Mahanarva fimbriolata e Bemisia tabaci Biótipo B, respectivamente, com a mortalidade em Tenebrio molitor. Inicialmente, foram selecionados 50 isolados a partir de 100 isolados de cada gênero, baseado em avaliações visuais do crescimento e esporulação em meio de cultivo em placas de Petri. Estes isolados selecionados foram cultivados em arroz parboilizado para quantificação do rendimento produtivo de conídios. Os 25 isolados mais produtivos de cada espécie de fungo foram utilizados nos bioensaios com T. molitor. Posteriormente, os cinco isolados que causaram maior e menor mortalidade de cada gênero, foram utilizados nos bioensaios com as respectivas pragas-alvo. A variação no rendimento de conídios de Beauveria spp., foi de 0,3 a 7,7 x 109 conídios.grama de arroz-1 e de Metarhizium spp. foi de 0,1 a 2,5 x 109 conídios.grama de arroz-1. A mortalidade confirmada de larvas de T. molitor por Beauveria spp., variou de 5,5 a 96,4% e por M. anisopliae variou de 29,1 a 89,1%. Alguns isolados causaram mortalidade elevada tanto no inseto modelo quanto na praga-alvo, porém, não foi verificada uma relação entre a virulência para as duas espécies. Da mesma forma, não foi observada associação entre os parâmetros produção de conídios e virulência. O isolado ESALQ 4958 de B. bassiana se destacou nos dois bioensaios apresentando mortalidades elevadas de ninfas de B. tabaci Biótipo B. Nos bioensaios utilizando ninfas de M. fimbriolata, ESALQ 1641 foi o isolado que apresentou os maiores percentuais de mortalidade nos dois bioensaios. Analisando conjuntamente as variáveis produção de conídios e virulência a T. molitor e a espécie alvo, os isolados ESALQ 540 (B. bassiana) e ESALQ 1116 (M. anisopliae) se destacaram por apresentarem valores elevados para todas as variáveis de interesse. Os resultados reforçam a necessidade de uma análise conjunta destas variáveis com um peso diferenciado para cada variável na seleção de isolados para utilização em produtos microbianos para o controle de pragas. / The genus Metarhizium spp. and Beauveria spp. are important entomopathogenic fungi used to control arthropod pests. The selection of promising fungal isolates is the first and one of the most important steps on the development of a biopesticide, since some isolates may present high virulence and not necessarily good production in substrate and vice-versa, being the combination of these two parameters important for the commercial viability. Difficulties of rearing or maintaining some species of pests in laboratory are limitations for the conduction of virulence tests, justifying the use of easy to breed model species on the preliminary steps of selection. Therefore, this study aimed to select isolates with high conidia production and virulence, comparing the control efficiency of M. anisopliae and B. bassiana to the target pests, Mahanarva fimbriolata and Bemisia tabaci biotype B, respectively, with mortality in Tenebrio molitor. At first, 50 isolates were selected from 100 isolates of each genus, based on growth and sporulation in culture medium on Petri dishes. These isolates were grown in parboiled rice to quantify the yield of conidia. The 25 most productive isolates of each fungus species were used in the bioassays with T. molitor. After, the five isolates that caused higher and lower mortality of each genus were used in the bioassays with the respective target pests. Beauveria spp. conidia yield ranged from 0.3 to 7.7 x 109 conidia.grams of rice-1 and Metarhizium spp. from 0.1 to 2.5 x 109 conidia.gram of rice-1. The confirmed mortality of T. molitor larvae by Beauveria spp. varied from 5.5 to 96.4% and M. anisopliae varied from 29.1 to 89.1%. Some isolates caused high mortality in both, model insect and the target pest; however, no relationship between the virulence of both species was observed. Similarly, there was no association between the parameters conidia production and virulence. The B. bassiana isolate ESALQ 4958 in both bioassays presented high mortalities of B. tabaci Biotype B. In bioassays using M. fimbriolata nymphs, ESALQ 1641 was the isolate that presented the highest mortalities in both bioassays. Analyzing the variables, conidia production and virulence to T. molitor and the target species, the isolates ESALQ 540 (B. bassiana) and ESALQ 1116 (M. anisopliae) showed high values for all variables of interest. The results reinforce the necessity of a joint analysis of these variables with different weight for each one in the selection of isolates, aiming to use them in microbial products for pest control.

A cultura dos citros é considerada de muita importância para a economia brasileira. Atualmente, o inseto Diaphorina citri tem sido considerado como o principal problema dessa cultura, por ser vetor da bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus (?-Proteobacteria) causadora da doença conhecida como Greening. Além de D. citri, a cultura dos citros apresenta inúmeras espécies de insetos e ácaros pragas que reduzem a qualidade e a produção dos frutos e requerem medidas de controle. O controle das espécies pragas tem sido realizado quase exclusivamente por aplicações frequentes de pesticidas químicos. Recentemente, isolados dos fungos entomopatogênicos Isaria fumosorosea e Beauveria bassiana foram selecionados para o controle de D. citri. Nesse estudo investigou-se a patogenicidade destes isolados associados a adjuvantes no controle de ninfas e adultos dos insetos Diaphorina citri, Toxoptera citricida, Aleurocanthus woglumi, Praelongorthezia praelonga e adultos dos ácaros Brevipalpus phoenicis e Panonychus citri em condições de laboratório. Notou-se que os fungos estudados foram patogênicos para quase todas as espécies de pragas, com a execção do fungo B. bassiana para ninfas e adultos de P. praelonga. As maiores mortalidade provocadas pelos fungos entomopatogênicos foram obtidas para ninfas e adultos de D. citri (>86% e 55,7%, respectivamente) e T. citricida (>90% e 90,8%, respectivamente), onde também foi encontrado o maior nível de esporulação por indivíduo. Essas duas espécies pragas foram selecionadas para os ensaios de transmissão horizontal, onde foi avaliada a transferência de conídios dos fungos entomopatogênicos entre indivíduos esporulados e não infectados. Nos experimentos de laboratório foi observado que I. fumosorosea e B. basssiana apresentaram transmissão horizontal entre cadáveres e adultos não infectados de D. citri (intra-específica) e adultos de T. citricida para D. citri (inter-específica). Os mesmos resultados foram obtidos nos experimentos em semi-campo com adultos de D. citri. Podemos concluir que os fungos entomopatogênicos I. fumosorosea e B. bassiana apresentam potencial como agentes de controle de D. citri, T. citricida, A. woglumi, B. phoenicis, P. citri. A transmissão horizontal dos fungos apartir de T. citricida e D. citri infectados para adultos sadios de D. citri pode contribuir para o controle desta praga em campo. / The citrus crops are considered of great importance to the Brazilian economy. Currently, the insect Diaphorina citri is considered as the major pest of this crop, as a vector of the bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (? - Proteobacteria) causing the disease known as Greening. Besides D. citri, the orange crop has numerous species of insect and mites pests that reduce the quality and yield of fruits and require control. The control of pest species is carried out almost exclusively by frequent applications of chemical pesticides. Recently, isolates of the entomopathogenic fungi Isaria fumosorosea and Beauveria bassiana were selected for the control of D. citri. This study investigated the pathogenicity of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Isaria fumosorosea associated adjuvants on nymphs and adults of the insects Diaphorina citri, Toxoptera citricida, Aleurocanthus woglumi, Praelongorthezia praelonga and adult mites and B. phoenicis, Panonychus citri in laboratory conditions. The fungi studied were pathogenic to almost all pests species, with exception of the fungus B. bassiana against nymphs and adults of P. praelonga. The highest mortality caused by the entomopathogenic fungi were obtained for nymphs and adults of D. citri (> 86% and 55.7%, respectively) and T. citricida (> 90% and 90.8%, respectively), where we also found the highest level of sporulation per individual. These two pest species were selected to test horizontal transmission, which evaluated the transmission of disease between sporulated and healthy individuals. In the laboratory experiments, we observed that I. fumosorosea and B. basssiana showed horizontal transmission between cadavers and healthy adults of D. citri (intraspecific) and adults of T. citricida to D. citri (interspecific). Similar results were obtained in experiments in semi-field conditions with adults of D. citri. The results show that the potential of the entomopathogenic fungi I. fumosorosea and B. bassiana to control D. citri, T. citricida, A. woglumi, B. phoenicis, P. citri. Horizontal transmission of the disease from infected T. citricida and D. citri to health adults of D. citri may improve the control of D. citri in fields.

Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium anisopliae, têm despertado grande interesse como agentes no controle de insetos-pragas. Estas espécies de fungos são especializadas na secreção de um complexo enzimático constituído de proteases, lipases e quitinases, entre outras, estando relacionadas com patogenicidade e virulência. Neste contexto a foi analisada a secreção de quitinases pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae var. anisopliae, como identificado molecularmente. Contudo, alguns aspectos morfológicos analisados mostram pequenas diferenças entre estes isolados. Para produção de quitinases, os isolados foram cultivados em fermentação submersa na presença e ausência de indutores e em fermentação em estado sólido, tendo crisálida como substrato. A maior síntese de quitinase intracelular foi obtida para IBCB 425 no meio contendo extrato de levedura mais glicose (EG). Visando a produção da enzima extracelular e disponibilidade de fonte de carbono, o meio extrato de levedura mais crisálida (EC), sob agitação foi padronizado para fermentação submersa (FSbm). Os maiores níveis enzimáticos intracelulares para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram obtidos entre 72 h e 216 h e para a forma extracelular entre 96h e 144h. A produção quitinásica em fermentação sólida (FSS) utilizando crisálida como fonte de carbono foi otimizada por delineamento composto central rotacional (DCCR, tendo como variáveis o tempo de crescimento e umidade. O melhor produtor de quitinase em FSS foi o isolado IBCB 360. A análise do secretoma mostrou um maior número de proteínas quando os isolados foram cultivados na presença do indutor, com destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas secretadas pelos isolados IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas, estando entre elas a endo-N-acetyl--D-glucosaminidase, enzima do complexo quitinolítico. As quitinases produzidas pelos quatro isolados foram parcialmente purificadas em DEAE Celulose, obtendo-se dois picos de atividade quitinásica. O processo de purificação foi continuado para o IBCB 384 em coluna de exclusão molecular, obtendo se um único pico de atividade quitinásica, analisado por electrospray. A temperatura ótima de atividade para as quitinases produzida em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 variou de 50ºC a 60ºC e pH ótimo de atividade ficou na faixa de 5,0 - 5,5. As quitinases dos isolados mantiveram-se estáveis nas temperaturas de 30ºC e 40ºC e em uma ampla faixa de pH. Os sais BaCl2 e MnCl2 ativaram as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 425. Além disso, todas as quitinases foram tolerantes ao - mercaptoetanol. O comportamento cinético de todas as quitinases foi Michaeliano e a maior afinidade pelo substrato foi para a quitinase do isolado IBCB 360. Já os experimentos in vivo e in vitro mostraram que o isolado IBCB 425 foi melhor na fase pré-infecção e isolado IBCB 384 foi melhor na fase pós infecção, sendo o mais virulento. Portanto, os isolados M. anisopliae têm se mostrado como bons produtores de quitinases, com boa estabilidade a temperatura e pH além de outras características distintas que provavelmente estão relacionadas com o potencial de patogenicidade e virulência de cada isolado. / Entomopathogenic fungi such as Metarhizium anisopliae, have been attracting great interest as agents to control insect pests. These species of fungi are specialized in the secretion of an enzymatic complex consisting of proteases, lipases and chitinases, among others which are related to pathogenicity and virulence. In this context the secretion of chitinase by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolated from M. anisopliae var. anisopliae molecularly identified, were analyzed. However, some structural features analyzed showed small differences among these isolates. For chitinase production, the isolates were grown in submerged culture in the presence and absence of inducers and under solid state fermentation with chrysalis as substrate. The enhanced synthesis of intracellular chitinase was obtained with IBCB 425 using yeast extract plus glucose (EG). Aiming to produce the extracellular enzyme and the carbon source available, the medium yeast extract and chrysalis (EC), was standardized to SbmF. The high intracellular enzymes levels produced by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates were obtained between 72 h and 216 h and for the extracellular form between 96h and 144h. The chitinase production in SSF using chrysalis as carbon source was optimized by CCRD, having the time of growth and moisture as variables. The best producer of chitinase in SSF was the isolated IBCB 360. The analysis of the secretome showed a great number of proteins when the isolates were grown in the presence of the inducer, especially for the isolated IBCB 425. Most of the proteins secreted by IBCB 167 and IBCB 384 isolates were identified. Among these proteins the endo-N-acetyl--D-glucosaminidase was identified, enzyme that participates in the chitinulitic complex. Chitinases produced by the isolates were partially purified on DEAE - cellulose, yielding two peaks of chitinase activity. The purification process was continued for IBCB 384 isolated using molecular exclusion chromatographic column, yielding only one peak of chitinase activity, analyzed by electrospray. The optimal temperature for the chitinase activity from IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates obtained in SSF, ranged from 50 ºC to 60 ºC and the optimum pH of activity was 5.0 to 5.5. All chitinases were stable at 30 ºC and 40 ºC, and wide pH range. The BaCl2 and MnCl2 salts activated the chitinases of IBCB 167 and IBCB 425 isolates. In addition, all chitinases were mercaptoethanol tolerant. The kinetic behavior of all chitinases was Michaelian with the highest affinity to the substrate observed for the chitinase of isolated IBCB 360. The in vivo and in vitro experiments showed that isolated IBCB 425 was better in pre -infection phase and the isolated IBCB 384 was better in the post infection phase. Therefore, the M. anisopliae isolates were good producers of chitinases with interesting temperature and pH stability, and other different characteristics that are probably related to the potential pathogenicity and virulence of each isolate.

The coleoptera Rhynchophorus palmarum (L.), vulgarly known as palm weevil is considered on of mainly pest of several palm trees of economic importance. In coconut tree their larvae destroy the plant culms and their adults act like a vector of nematode Bursaphelenchus cocophilus that cause the red ring disease. With the objective of subside the practices of biological control of R. palmarum already utilized it was carried out tests aiming to determine the flight activity of the insect in coconut fields; to validate the technique of autoinoculation of adults of R. palmarum using traps like vegetal traps bait inoculated with the Beauveria bassiana enthomopatogenic fungi; and to characterize genetically isolates of the fungi by molecular makers of RAPD, microsatellites and ITS-DNAr. To determine the flight activity of the insect it was installed, around the commercial field, traps of capture/monitoring for population of R. palmarum adult’s insect, containing attractive feed (culms of sugar cane) added with pheromone of aggregation. For the autoinoculation tests it was used the randomized statistical design, in a factorial scheme 3x4 (3 spores concentration of the fungi and 4 periods of autoinoculation), using four replications constituted by 5 pairs of males and females. The insects were separated, cleaned with distilled water and transfer to buckets with sugar cane culms inoculated with B. bassiana on concentrations 107, 108 and 109 spores/mL of suspension), keeping in contact with the inoculums for 45min.; 90min.; 3h00 and 6h00. After this period of exposition the insects were individualized being the mortality/infection evaluated for 20 days. For genetic characterization it was used 11 isolates obtained from monospores cultures that posterior were inoculated in a liquid medium at 25ºC±1ºC under constant shaking in dark conditions. After seven days the mycelium were filtered, lyophilized and after DNA extracted in SDS buffer at 10%. It was tested 20 decamer primers of arbitrary sequence of IDT Company. The amplifications were carried out in termocycler (Biometra/Unisciense) programmed for initial temperature of 94°C for 5min. and 45 cycles of: 94°C for 1min., 36°C for 2min. and 72°C for 1min.. For microsatellites analyses it was used four pairs of primers. The amplification reactions were carried out using a volume of 25µL. The amplifications consisted by one initial cycle of 94ºC and 30 cycles of 94ºC for 1min.; 50ºC for 1min. and 72ºC for 2min., and a end cycle of 72ºC for 7min.. The amplified fragments were separated by electrophoresis in agarose gel using TBE buffer, and the gel stained with ethidium bromete (0.5µg/mL) after visualized under UV light. The insect initiates flight activity at 5h00 am through 6h00 pm o’clock occurring the population maximum at 9h00 am to11h00 am. It was verified the mortality increase of adults of R. palmarum in accord to fungi concentration and period of exposition of the inoculums. The higest index of mortality (53%) occurred nine days after the autoinoculation by B. bassiana. The RAPD analysis generated 138 polymorphic and 14 monomorphic bands being the patterns used to calculate the genetic similarity that varies of 2% to 77%. The 57.99 (Betume2-SE) and 53.96 (Mojú-PA) isolates presented high similarity (77%), followed by 64.99 (Egypt) and 53.96 (Mojú-PA), with similarity of 73% by RAPD test. For microssatellite the BC.05 and 32.91 isolates presented genetic similarity of 82%, followed by 64.99 and 57.99 with genetic similarity of 80%. It was not observed amplifications variations using ITS regions for B. bassiana isolates. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / O coleóptero Rhynchophorus palmarum (L.), vulgarmente conhecido como broca-doolho-do-coqueiro é considerado uma das principais pragas de palmeiras de importância econômica. Suas larvas destroem a estipe da planta e os adultos atuam como vetores do nematóide Bursaphelenchus cocophilus causador da doença “anel vermelho”. Com o objetivo de subsidiar as práticas de controle biológico do R. palmarum já empregadas, foram realizados testes visando: determinar a atividade de vôo do inseto em plantios de coco; validar a técnica de autoinoculação de adultos de R. palmarum usando armadilhas com iscas vegetais inoculadas com o fungo entomopatogênico Beauveria bassiana e caracterizar geneticamente isolados do fungo por meio de marcadores moleculares do tipo RAPD, microssatélite e ITS-DNA. Para determinar a atividade de vôo do inseto foram instaladas, na periferia de pomares comerciais de coco, armadilhas de captura/monitoramento da população de adultos de R. palmarum, contendo atrativo alimentar (colmos de cana-de-açúcar) mais feromônio de agregação. Nos testes de autoinoculação utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3x4 (3 concentrações do fungo e 4 tempos de autoinoculação), com 4 repetições de 5 casais. Os insetos foram separados, limpos em água destilada e transferidos para baldes contendo cana-de-açúcar inoculada com B. bassiana nas concentrações padronizadas (107, 108 e 109 esporos/mL de suspensão), permanecendo em contato com o inóculo por 45min.; 90min.; 3h00 e 6h00. Após o período de exposição ao fungo, os insetos foram individualizados, sendo a mortalidade/infecção avaliada por 20 dias. Na caracterização genética foram utilizados 11 isolados, para os quais foram obtidas culturas monospóricas que posteriormente foram repicadas, em meio líquido a 25ºC±1ºC, em agitação constante e no escuro. Após sete dias os micélios foram filtrados, liofilizados e em seguida seu DNA genômico extraído em tampão de extração SDS 10%. Foram testados 20 primers decâmeros de seqüência arbitrária da marca IDT. As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra/Unisciense) programado com temperatura inicial de 94°C por 5min. e 45 ciclos a 94°C por 1min., 36°C por 2min. e 72°C por 1min.. Para as análises de microssatélites foram empregados quatro pares de primers. As reações de amplificação foram feitas em um volume de 25µL. As amplificações consistiram de um ciclo inicial de 94ºC e 30 ciclos de: 94ºC por 1min.; 50ºC por 1min. e 72ºC por 2min., ao final 1 ciclo de 72ºC por 7min. Os fragmentos amplificados foram separados em gel de agarose, submetidos à eletroforese em tampão TBE, corados com brometo de etídio (0,5 µg/mL) e visualizados sob luz UV. Observou-se que o inseto inicia sua atividade de vôo as 5h00 até às 18h00, ocorrendo um pico populacional máximo das 9h00 às 11h00. Verificou-se uma mortalidade crescente de adultos de R. palmarum em função do aumento da concentração do fungo e dos tempos de exposição ao inóculo. O maior índice de mortalidade (53%) ocorreu nove dias após a autoinoculação do inseto. As análises de RAPD geraram 138 bandas polimórficas e 14 monomórficas, sendo os padrões empregados para o cálculo das similaridades genéticas que variaram de 2% a 77%. Os isolados 57.99 (Betume2-SE) e 53.96 (Moju-PA) apresentaram maior similaridade (77%), seguidos de 64.99 (Egito) e 53.96 (Moju-PA), com uma similaridade de 73% pelo teste de RAPD. Enquanto que para o microssatélite os isolados BC.05 e 32.91 apresentaram maior similaridade genética (82%), seguidos de 64.99 e 57.99 com similaridade genética de 80%. Não foram observadas variações na amplificação das regiões ITS de DNAr para os isolados de B. bassiana.

Avaliou-se a patogenicidade de diversas espécies de fungos entomopatogênicos a ninfas de 2&#186; a 4&#186; ínstares do psilídeo Diaphorina citri. Assim foram feitos bioensaios com Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium muscarum, L. longisporum, Paecilomyces fumosoroseus, P. farinosus, Syngliocladium sp. na concentração de 5x107 conídios/mL para cada patógeno, com exceção de Hirsutella thompsonii que foi aplicado na concentração de 2,8x107 conídios/mL. Utilizou-se mudas de murta, Murraya paniculata, infestadas com ninfas do inseto que foram pulverizadas com as suspensões conidiais. Os fungos B. bassiana, M. anisopliae, H. thompsonii, L. muscarum e P. fumosorosus foram patogênicos para as ninfas do psilídeo. O isolado mais promissor foi o Esalq-PL63, de B. bassiana, que causou mortalidade de aproximadamente 72% das ninfas, sete dias após a inoculação. Esse fungo também afetou o processo de metamorfose das ninfas. A concentração letal média (CL50) foi calculada em 2,3 x 107 conídios/mL. O ciclo de infecção de B. bassiana sobre as ninfas do psilídeo foi estudado pulverizando-se a suspensão de 3x108 conídios/mL do fungo e, em seguida, observado em microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura, nos intervalos de tempo de 0, 24, 48, 72 e 168 horas após a inoculação. Constatou-se que o referido patógeno não conseguiu completar o desenvolvimento no corpo do hospedeiro, uma vez que a fase de conidiogênese é inibida, provavelmente, pela presença no interior do inseto de bactérias antagônicas ao seu desenvolvimento. O isolado Esalq-PL63 é um promissor agente de controle microbiano de ninfas de D. citri por afetar sua fisiologia e causar em altos índices de mortalidade. / It was evalueted the patogenicity of several species of entomopathogenic fungi against 2nd to 4th instar of Diaphorina citri. For the bioassays with Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium muscarum, L. longisporum, Paecilomyces fumosoroseus, P. farinosus, Syngliocladium sp. a concentration of 5x107 conidia.mL-1 was used. For the Hirsutella thompsonii strain the concentration used was 2.8x107 conidia.mL-1. Seedlings of orange jasmine, Murraya paniculata, infested with nymphs of the insect were sprayed with the conidia suspensions. The fungi B. bassiana, M. anisopliae, H. thompsonii, L. longisporum and P. fumosoroseus were pathogenic to nymphs. The strain of B. bassiana (Esalq-PL63) was the most pathogenic causing 72% mortality after seven days of inoculation. This fungus also affected the process of nymph molting. The letal concentration (LC50) calculated was 2.3x107 conidia.mL-1. To prove mortality the pathogen was reisolated in media culture (AN, MC and BDA) and besides, observed under microscope examination. The infection cycle of B. bassiana in nymphs was studied after inoculation of 3x108 conidia.mL-1. This process were evaluated with the use of a light microscope and an electron scan microscope, after 0, 24, 48, 72 and 168 hours of conidia sprayed. This strain did not complete the development in the host because the conidiogenesis was inhibited, probably because it was found antagonistic bacteria into the host. However, this isolate is a potencial microbial control agent of nymphs of D. citri, affecting its physiology and causing high mortality.

Este trabalho teve o objetivo de avaliar, em condições de laboratório, a influência da temperatura e do tempo de exposição na viabilidade e virulência dos fungos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae em suspensões preparadas com produtos à base de Conídios puros, Arroz+fungo e nas formulações Pó molhável e Suspensão concentrada em óleo emulsionável. Inicialmente foi necessário o desenvolvimento de um método eficiente e econômico para avaliação da viabilidade, especialmente para produtos formulados em óleo emulsionável misturados em água (suspensão de aplicação). Durante o desenvolvimento do método de avaliação foram definidos parâmetros e condições adequadas para cada formulação, como o meio de cultura, e também a influência de antibióticos e fungistáticos. O protocolo estabelecido baseiase resumidamente no plaqueamento de 150 µL de uma suspensão contendo entre 0,7 e 1×106 conídios/mL em placas tipo Rodac® com 5 mL de meio de cultura Batata-Dextrose-Ágar + 5 mg/L de Pentabiótico® e 10 µL/L de Derosal® (Carbendazim), efetuando-se posteriormente a contagem dos conídios germinados. Este método foi comparado com outra técnica de viabilidade direta (VD) e com as técnicas de Unidade Formadoras de Colônia (UFC) e viabilidade por fluorescência, confrontando-se a precisão obtida pelo coeficiente de variação (CV) das análises de cada método. Os resultados demonstraram que além da facilidade de execução, o método desenvolvido apresentou maior precisão que as demais técnicas (com CV até 7 vezes menor em relação à VD, e até 32 vezes menor que UFC). Foi constatado que a técnica de UFC não é adequada para avaliações de produtos formulados, visto que em relação à quantificação inicial subestimou a concentração viável na maioria das formas dos fungos testadas, sendo que nos produtos em óleo emulsionável estes valores foram 54% menores para B. bassiana, e 73% menores para M. anisopliae. A técnica para avaliação da viabilidade da suspensão preparada com produtos formulados em óleo se mostrou eficaz, após a retirada do óleo da suspensão e outras adaptações. Suspensões de produtos e formulações a base de B. bassiana e M. anisopliae foram mantidas a 26°C, 36°C e 46°C por 1h, 4h e 6h e os efeito destes tratamentos foram medidos na viabilidade e virulência dos fungos contra lagartas de Diatraea saccharalis. Verificou-se que quanto maior o tempo de exposição e maior a temperatura, maior é a influência negativa nos parâmetros dos fungos. Entretanto, a formulação em óleo emulsionável foi a que apresentou melhor proteção aos efeitos detrimentais da temperatura. Mesmo após 6h de exposição a temperatura de 36°C a viabilidade se manteve acima dos 85% para ambos os fungos avaliados. Esta formulação também apresentou os melhores resultados de mortalidade dos insetos, e mesmo após 4h de exposição a 46°C atingiu 39% e 50% de eficiência para B. bassiana e M. anisopliae, respectivamente, sendo recomendável para o controle de D. saccharalis. O protocolo para avaliação da viabilidade de conídios de fungos entomopatogênicos proposto constitui-se como uma ferramenta importante para estudos da influência de fatores bióticos e abióticos durante o período de pré-aplicação na eficiência de micoinseticidas. / This study aimed to evaluate, under laboratory conditions, the influence of temperature and exposure time on the viability and virulence of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae in suspensions prepared with pure conidia, rice plus fungus and in formulations of wettable powder and concentrated suspension in emulsifiable oil. Initially, an efficient and economical methodology was developed to evaluate conidia viability for each formulation, especially for products formulated in emulsifiable oil mixed in water (suspension of application). During the development of the methodology, the influence of culture media, antibiotics and fungistatics and appropriate conditions were defined for each formulation. Briefly, the established protocol was based on plating 150 L of suspensions containing between 0.7 and 1×106 conidia/mL on a plate type Rodac® with 5 ml of Potato Dextrose Agar culture medium plus 5 mg/L pentabiotic® and 10mg/L and 10 µL/L Derosal® (Carbendazim) and the subsequent counting of germinated conidia. This method was compared to a direct counting (DC) technique, the technique of colony-forming unit (CFU) and viability through fluorescence. The precision of each methodology was measured by their coefficient of variability (CV). Besides its easiness of execution, the new developed methodology was the most precise of all methods (with CV up to 7 times lower compared to the DC, and up to 32 times lower than the UFC). Our results showed that the technique of UFC is not appropriate for evaluation of formulated products, as compared to the conidial quantification by hemacytometer, this technique underestimated the viable concentration in most forms of fungi tested, and for the products in emulsifiable oil these values were 54% lower for B. bassiana, and up to 73% lower for M. anisopliae. The technique for assessing the viability of the suspension prepared with products formulated in emulsifiable oil was effective, after the removal of oil from the suspension and others adaptations. The effect of temperature and period of time on conidia viability of B. bassiana and M. anisopliae-based products and formulations and their virulence against larvae of Diatraea saccharalis was measured at 26°C, 36°C and 46°C for 1h, 4h and 6h. The longer the time of heat exposure and the higher the temperature, the greater the negative influence on vital parameters of the fungi. However, the emulsifiable oil formulation was the least affected by the detrimental effects of heat for both fungi. Even after 6 hours of exposure to temperature of 36°C, the viability remained above 85% for both species evaluated. This formulation also showed the best results of insect mortality, and even after 4h of exposure to 46°C the efficiency was 39% (for B. bassiana) and 50% (for M. anisopliae), and therefore can be useful for control of D. saccharalis. The proposed protocol of evaluation of entomopathogenic fungi viability is a valuable tool for studies of biotic and abiotic factors effect on efficiency of micoinsecticides during the pre-application period.

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