O controle biológico de cigarrinha com Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) na cana-de-açúcar é um exemplo de sucesso da aplicação do manejo sustentável de pragas no Brasil. No entanto, pouco se sabe sobre a riqueza, distribuição e ecologia das espécies de Metarhizium nos agroecossistemas e ambientes naturais no Brasil. Neste trabalho, avaliou-se a diversidade genotípica e realizou-se a identificação específica de 96 isolados depositados na Coleção de Entomopatógenos \"Prof. Sérgio Batista Alves\" da ESALQ-USP pelo sequenciamento da região 5\' do fator de alongamento da tradução 1 alfa (5\'-TEF) e das regiões espaçadoras intergênicas do DNA nuclear MzIGS3 e MzFG543igs. Observou-se a existência de 10, 11 e 17 haplótipos pelas sequências destes genes, respectivamente. Foram ainda obtidos 41 isolados de dois talhões de canavial em Araras-SP que consistiram em 9 haplótipos pela região MzIGS3. Foi observada a existência de cinco espécies de Metarhizium, duas atualmente reconhecidas, M. anisopliae s.l. e M. robertsii s.l., sendo estes os dois clados mais abundantes e três novas linhagens não caracterizadas taxonomicamente, referidas aqui como Metarhizium sp. indet. 1, Metarhizium sp. indet. 2 e Metarhizium sp. indet. 3. Com exceção de um único isolado todos os outros provenientes de insetos, incluindo os isolados de cigarrinha, pertencem a um único clado de M. anisopliae s.l. M. robertsii foi obtido exclusivamente a partir de amostras de solo ou rizosfera. Apesar de proporcionar um maior grau de resolução genética entre os isolados a região MzIGS3 se mostrou incapaz de reconstruir a filogenia consenso para o clado PARB, dificultando a sua utilização como sequência diagnóstica na identificação ou análise filogenética de espécies de Metarhizium. Além disso, foi desenvolvida uma técnica de bioensaio em laboratório para avaliação de patogenicidade de Metarhizium spp. sobre M. fimbriolata com mortalidade da testemunha inferior a 12%, após 28 dias de avaliação. A caracterização da expressão dos genes pr1A, mad1 e mpl relacionados à virulência de três isolados de M. anisopliae (ESALQ 1037, ESALQ 1641 e ESALQ 1204) cultivados em meio mínimo e meio mínimo com cutícula de M. fimbriolata, D. saccharalis e T. molitor não revelou uma associação entre a expressão relativa desses genes ea virulência dos fungos in vivo. As informações contidas neste trabalho poderão contribuir em estudos de identificação e caracterização de Metarhizium em habitats naturais e agrícolas de no Brasil e países vizinhos na América do Sul, assim como auxiliar no contínuo desenvolvimento e acompanhamento do programa de controle biológico de M. fimbriolata com Metarhizium na cultura da cana-de-açúcar. / Biological control of spittlebug with Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) in sugarcane is an example of the successful application of sustainable pest management in Brazil. However little is known about the richness, distribution and ecology of Metarhizium species in agroecosystems and natural environments of Brazil. In this study, the genotypic diversity was accessed and species designation was assigned for 96 Metarhizium strains deposited in the Collection of Entomopathogens \"Prof. Sérgio Batista Alves\" from ESALQ-USP using the sequence variation at 5\'-TEF and the nuclear intergenic loci MzFG543igs and MzIGS3. Sequence diversity at these loci included 10, 11 and 17 sequence haplotypes, according to these loci, respectively. 41 strains were recovered from two sugarcane fields and consisted of 9 haplotypes according to MzIGS3. Five species of Metarhizium were observed, being the two most abundant taxa, Metarhizium anisopliae, Metarhizium robertsii and an additional three taxonomically unassigned lineages are referred to here as Metarhizium sp. indet. 1, Metarhizium sp. indet. 2 and Metarhizium sp. indet. 3. With a single exception, all strains isolated from insects belong to single clade of M. anisopliae, including the isolates infecting spittlebugs in sugarcane agroecosystems. M. robertsii was only recovered from soil or rhizosphere samples. Despite providing a greater degree of genetic resolution among strains, MzIGS3 revealed the inability to recapitulate the consensus phylogeny for the PARB clade and complicates its use as a stand-alone tool for species identification or phylogenetic analysis of Metarhizium. In addition, a laboratory bioassay technique was developed for pathogenicity screening of Metarhizium spp. on M. fimbriolata with low mortality on control group (8-12%) after 28 days of evaluation. The expression of genes pr1A, Mad1 and mpl of three M. anisopliae strains (ESALQ 1037, ESALQ1204 and ESALQ 1641) grown in minimal medium and minimal medium with M. fimbriolata, D. saccharalis or T. molitor cuticle apparently was not related to virulence of the fungi in vivo. Together these data will serve as resources for identification, discovery and communicating about Metarhizium biodiversity for insect biological control applications in Brazil and adjacent countries in South America, as well as assist in the ongoing development and monitoring of the biological control program of M. fimbriolata with Metarhizium in sugarcane fields.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007-Isabele da Costa Angelo.pdf: 1629986 bytes, checksum: 663b35706e830a57e185c3e0a68096c9 (MD5) Previous issue date: 2007-02-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Boophilus microplus is an ectoparasite which causes great economic losses around the world. The exclusive use of acaricides and the inadequate management have conducted the development of resistance in ticks populations, environmental and food contamination by acaricides and their residues. The use of entomopathogenic fungi to arthropods control has shown interesting responses. Several studies have proved the pathogenicity of fungi toward various ticks species. The aim of the present study was to evaluate the effect of Isaria farinosa, I. fumosorosea, Paecilomyces lilacinus and Lecanicillium lecanii toward engorged females, eggs and larvae of B. microplus tick. The isolates were cultured on malt extract medium at 25 ? 1?C and 80% of relative humidity for 15 days. Conidial suspensions were prepared in Tween 80 water solution (0.1% v/v). There were 4 treatment groups according to the following conidial concentrations: 105, 106, 107 and 108 conidia mL-1. The control group was made up of water and Tween 80 only (0.1% v/v). Treatment was based on immersion of the specimen in 1 mL of the conidial suspension. Each treatment group was made up of 10 repetitions. Changes in biology of engorged females, eggs viability and larvae mortality, were observed every 5 days up to the 20th day after treatment. The results have shown that L. lecanii changed biological parameters in engorged females through the reduction in posture period, nutritional rate, eggs production rate, and increase of incubation period. Isaria farinosa has shown reduction in posture period and in nutritional rate. Paecilomyces lilacinus was the unique isolate able to reduce the eclosion period of larvae from infected females. Isaria fumosorosea has reduced the nutritional rate and was the unique isolate that changed significantly in eclosion period when eggs were infected. Conidial concentrations reduced reproduction capacity of engorged females. The isolates of I. fumosorosea and L. lecanii have presented major potential to control B. microplus engorged females. All tested isolates have shown pathogenicity toward unfed larvae of B. microplus after in vitro infection. / Boophilus microplus ? um ectoparasito que causa grandes perdas na pecu?ria mundial. A utiliza??o exclusiva de produtos qu?micos no controle de carrapatos, associada ao manejo inadequado tem conduzido o desenvolvimento de popula??es de carrapatos resistentes, e a contamina??o dos produtos de origem animal e do ambiente pelos seus res?duos. O uso de fungos entomopatog?nicos no controle de artr?podes tem se tornado uma abordagem cada vez mais atrativa. In?meros trabalhos comprovam experimentalmente a patogenicidade dos fungos sobre diversas esp?cies de carrapatos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito in vitro de Isaria farinosa, I. fumosorosea, Paecilomyces lilacinus e Lecanicillium lecanii sobre f?meas ingurgitadas, ovos e larvas de B. microplus. Os fungos foram repicados em meio de cultura extrato de malte, e mantidos em c?mara climatizada sob temperatura de 25?C ? 1 e umidade relativa de 80% por quinze dias. Suspens?es conidiais foram preparadas a partir do crescimento do fungo, cujos con?dios foram adicionados a solu??o de ?gua destilada e Tween 0,1%. As concentra??es 105, 106, 107 e 108 con?dios mL-1 formaram os grupos tratamento, juntamente com o grupo controle, constitu?do por ?gua destilada est?ril e Tween 0,1%. O tratamento constituiu-se de um mililitro da concentra??o conidial testada, e cada grupo foi formado por 10 repeti??es. Os par?metros de avalia??o observados para demonstrar o efeito dos fungos sobre o carrapato foram as altera??es biol?gicas de f?meas ingurgitadas, viabilidade de ovos tratados e percentual de mortalidade de larvas, acompanhado a cada cinco dias at? o 20? dia ap?s infec??o. Os resultados mostraram que L. lecanii causou altera??es nos par?metros biol?gicos de f?meas ingurgitadas, diminuindo o per?odo de postura, o ?ndice nutricional, o ?ndice de produ??o de ovos, e aumentando o per?odo de incuba??o. Isaria farinosa mostrou redu??o no per?odo da postura e no ?ndice nutricional de f?meas ingurgitadas. P. lilacinus foi o ?nico fungo capaz de reduzir o per?odo de eclos?o das larvas provenientes da infec??o de f?meas ingurgitadas. I. fumosorosea reduziu o ?ndice nutricional e foi o ?nico isolado que causou altera??o significativa no per?odo de eclos?o de larvas provenientes da infec??o de ovos. Diferentes concentra??es dos entomomopat?genos reduziram o potencial reprodutivo das f?meas ingurgitadas dos grupos tratados. Os isolados de I. fumosorosea e L. lecanii apresentaram maior potencial de controle para f?meas ingurgitadas de B. microplus. Todos os isolados testados mostraram patogenicidade para larvas n?o alimentadas de B. microplus ap?s infec??o in vitro.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:16:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007-Thiago Campanharo Bahiense.pdf: 1378749 bytes, checksum: ef9fdcee9b7f5b82132b5b8d53a3fbe5 (MD5) Previous issue date: 2007-02-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Boophilus microplus can cause several cattle pathology and thus economic losses. Moreover, this tick species is able to develop resistance to acaricides. The biological control is a great promise to control cattle ticks populations. The aim of the present study was to contribute to the development of a new complementary method to control B. microplus. Therefore, it has been evaluated the compatibility between deltamethrin and the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae toward B. microplus tick in a stable test. It was used a tick strain resistant to pyrethroid and calves were artificially infested. A total of 8 calves were held in individual housing and infested with B. microplus larvae every other day for 25 days. After that, 4 treatments were realized with 2 calves per group. The control group was tested receiving just water; the second group was tested receiving M. anisopliae in a 108 conidia ml-1 suspension; the third one was tested receiving a 25 ppm deltamethrin solution; and the forth group was tested receiving a solution containing a 108 conidia ml-1 M. anisopliae suspension associated with a 25 ppm deltamethrin solution. The mortality rate was 32.57% in the second group, 38.58% in the third group, and 30.92% in the forth one. The main changes in ticks biology were a decreased nutritional rate until the forth day after treatment. The deltamethrin group was an exception with a decreased rate until the second day after treatment. The production of eggs rate was also decreased until the second day after treatment in all 3 tested groups. Therefore, the association between deltamethrin and B. bassiana and M. anisopliae could be used for B. microplus integrated management. Based on compatibility between acaricide and biological agents, it could be possible the use of both simultaneously on infested cattle. Thus, it is possible to control ticks resistant to deltamethrin if an association with entomogenous fungi such as Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae is established. The best performance of these fungi, associated or not with deltamethrin, was observed for a short period after treatment. / O principal ectoparasito dos bovinos ? o carrapato Boophilus microplus, que tem como caracter?stica grande capacidade de resistir ?s adversidades do meio ambiente sendo causador de diversas patologias, severos preju?zos econ?micos aos produtores e possui grande capacidade de desenvolver resist?ncia a carrapaticidas qu?micos. As pesquisas realizadas utilizando controle alternativo de B. microplus t?m apontado que os fungos que naturalmente promovem a infec??o e at? a morte de diversas esp?cies e est?gios de vida de carrapatos s?o, promissores candidatos a esse papel de agente de controle microbiano. Com o objetivo de fornecer subs?dios que complementar?o o controle desta parasitose, avaliou-se in vivo a compatibilidade entre a deltametrina e os fungos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae sobre cepa resistente de B. microplus a deltametrina, atrav?s do teste de est?bulo, com bovinos infestados artificialmente. Foram utilizados oito bezerros, para cada bioensaio, alojados individualmente, infestados em dias alternados com larvas de B. microplus por um per?odo de 25 dias. Ao t?rmino da infesta??o, foram realizados quatro tratamentos com dois animais por grupo. O grupo controle recebeu somente ?gua; o grupo tratado com fungo recebeu suspens?o conidial na concentra??o de 108 con?dios/ml; o grupo tratado com deltametrina recebeu solu??o na concentra??o de 25 ppm e o grupo tratado com associa??o recebeu suspens?o do fungo na concentra??o de 108 con?dios/ml com deltametrina a 25 ppm. Os resultados foram obtidos atrav?s da contagem di?ria dos carrapatos desprendidos do corpo dos animais, al?m da avalia??o dos par?metros biol?gicos das f?meas, as quais foram incubadas em c?mara climatizada. Realizaram-se dois bioensaios, sendo o primeiro com o fungo Metarhizium anisopliae, onde os percentuais m?dios de mortalidade foram: 32,57% para este fungo, 38,58 % para deltametrina e 30,92% para associa??o entre ambos. No segundo bioensaio foi utilizado o fungo Beauveria bassiana, onde os percentuais m?dios de mortalidade foram: 26,06% para este fungo, 64,30% para deltametrina e 70,64% para associa??o entre ambos. Quanto aos par?metros biol?gicos, as principais altera??es em ambos bioensaios foram a redu??o do ?ndice nutricional, principalmente at? o quarto dia ap?s tratamento, com exce??o da deltametrina que reduziu at? o segundo dia ap?s o tratamento. O ?ndice de produ??o de ovos s? foi reduzido at? o segundo dia ap?s tratamento para todos os grupos do primeiro bioensaio e somente no quarto dia ap?s o tratamento para o B. bassiana. Sendo assim, a associa??o entre deltametrina e os fungos testados pode ser utilizada como ferramenta para o manejo integrado de B. microplus, demonstrando compatibilidade in vivo entre acaricida qu?mico e bio l?gico, sendo poss?vel sua utiliza??o, simult?nea sobre bovinos infestados com B. microplus. O melhor desempenho desses fungos, associados ou n?o, foi observado em um per?odo curto ap?s o tratamento.

Les micro-organismes entomopathogènes sont les ennemis naturels des insectes. Ils infectent leurs hôtes en pénétrant dans leurs corps et/ou en excrétant des composés insecticides. En parallèle, il a été démontré que la plupart des insectes hébergent de multiples micro-organismes symbiotiques qui jouent un rôle dans la nutrition et la défense de leurs hôtes. En conséquence, au cours du processus de colonisation, les micro-organismes entomopathogènes interfèrent avec ces micro-organismes bénéfiques. Ainsi, les interactions entre les insectes et les micro-organismes pathogènes peuvent induire la production d'insecticides et/ou de métabolites antimicrobiens. A partir d'insectes vivants infectés par des champignons entomopathogènes nous avons isolé 57 micro-organismes. Les extraits à l'acétate d'éthyle de ces micro-organismes ont été évalués pour leurs activités antimicrobiennes et insecticides sur quatre micro-organismes pathogènes pour l'Homme et sur les larves du moustique Aedes aegypti. Le criblage biologique a mis en évidence l'activité de plusieurs souches dont 6 ont été sélectionnées pour une étude chimique plus approfondie : deux champignons du genre Mucor, Isaria farinosa, Pestalotiopsis theae et les bactéries des genres Pantoea et Asaia. L'étude de ces extraits a permis l'isolement de 41 composés dont 10 sont nouveaux, parmis lesquels on retrouve des dérivés tétrahydrofuraniques, des dérivés d'acides tétramiques ou encore une macrolactone au squelette original. Des activités insecticides mais aussi antimicrobiennes ont été trouvées pour ces composés. La capacité métabolique de deux souches a également été explorée par une approche OSMAC couplée à des analyses métabolomiques par UHPLC-HRMS2. Si la recherche de composés insecticides et antimicrobiens représente un défi mondial pour la santé publique face au phénomène croissant de résistance aux antibiotiques et de toxicité des insecticides, ce travail montre que l'étude des interactions spécifiques entre les micro-organismes entomopathogènes et leurs insectes cibles peut conduire à la découverte de nouveaux composés prometteurs, d'intérêt pharmaceutique. / Entomopathogenic microorganisms are natural enemies of insects. They infect their hosts by penetrating the body and producing insecticidal compounds. However, it has also been shown that most insects host multiple symbiotic microbes which perform many important functions like nutrition and defense. During the process of colonization, entomopathogenic microorganisms interact with these beneficial microbial species. Thus, we expect that interactions between insects and insect pathogenic microorganisms should trigger the production of insecticides and/or antimicrobial metabolites.In this project, 57 microorganisms were isolated from the cuticles of live, entomopathogen infected insects . Ethyl acetate extracts of each strain were evaluated for their antimicrobial and insecticidal activities on four human pathogenic microorganisms and Aedes agypti mosquito larvae. The screening highlighted several bioactive strains, and 6 were selected for further chemical investigations. Among the selected ones were two fungal strains of the Mucor genus, Pestalotiopsis theae and Isaria farinosa and bacterial strains of the Pantoea sp. and an Asaia sp genera. The chemical study allowed us to isolate 41 compounds, of which 10 were new: tetrahydrofuran and tetramic acids derivatives, or a macrolactone with an original skeleton among others. Some of those presented insecticidal and antimicrobial activities. The biosynthetic potential of two strains was also investigated by an OSMAC approach coupled to metabolomics analyses by UHPLC-HRMS2. The search for insecticidal and antimicrobial molecules represents a global challenge for public health, to face the increasing phenomenon of antibiotic resistance but also insecticide toxicity. This work demonstrated that studying specific interactions between entomopathogenic microorganisms and their target insects may lead to the discovery of new promising compounds of pharmaceutical interest.

O controle biológico de cigarrinha com Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) na cana-de-açúcar é um exemplo de sucesso da aplicação do manejo sustentável de pragas no Brasil. No entanto, pouco se sabe sobre a riqueza, distribuição e ecologia das espécies de Metarhizium nos agroecossistemas e ambientes naturais no Brasil. Neste trabalho, avaliou-se a diversidade genotípica e realizou-se a identificação específica de 96 isolados depositados na Coleção de Entomopatógenos \"Prof. Sérgio Batista Alves\" da ESALQ-USP pelo sequenciamento da região 5\' do fator de alongamento da tradução 1 alfa (5\'-TEF) e das regiões espaçadoras intergênicas do DNA nuclear MzIGS3 e MzFG543igs. Observou-se a existência de 10, 11 e 17 haplótipos pelas sequências destes genes, respectivamente. Foram ainda obtidos 41 isolados de dois talhões de canavial em Araras-SP que consistiram em 9 haplótipos pela região MzIGS3. Foi observada a existência de cinco espécies de Metarhizium, duas atualmente reconhecidas, M. anisopliae s.l. e M. robertsii s.l., sendo estes os dois clados mais abundantes e três novas linhagens não caracterizadas taxonomicamente, referidas aqui como Metarhizium sp. indet. 1, Metarhizium sp. indet. 2 e Metarhizium sp. indet. 3. Com exceção de um único isolado todos os outros provenientes de insetos, incluindo os isolados de cigarrinha, pertencem a um único clado de M. anisopliae s.l. M. robertsii foi obtido exclusivamente a partir de amostras de solo ou rizosfera. Apesar de proporcionar um maior grau de resolução genética entre os isolados a região MzIGS3 se mostrou incapaz de reconstruir a filogenia consenso para o clado PARB, dificultando a sua utilização como sequência diagnóstica na identificação ou análise filogenética de espécies de Metarhizium. Além disso, foi desenvolvida uma técnica de bioensaio em laboratório para avaliação de patogenicidade de Metarhizium spp. sobre M. fimbriolata com mortalidade da testemunha inferior a 12%, após 28 dias de avaliação. A caracterização da expressão dos genes pr1A, mad1 e mpl relacionados à virulência de três isolados de M. anisopliae (ESALQ 1037, ESALQ 1641 e ESALQ 1204) cultivados em meio mínimo e meio mínimo com cutícula de M. fimbriolata, D. saccharalis e T. molitor não revelou uma associação entre a expressão relativa desses genes ea virulência dos fungos in vivo. As informações contidas neste trabalho poderão contribuir em estudos de identificação e caracterização de Metarhizium em habitats naturais e agrícolas de no Brasil e países vizinhos na América do Sul, assim como auxiliar no contínuo desenvolvimento e acompanhamento do programa de controle biológico de M. fimbriolata com Metarhizium na cultura da cana-de-açúcar. / Biological control of spittlebug with Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) in sugarcane is an example of the successful application of sustainable pest management in Brazil. However little is known about the richness, distribution and ecology of Metarhizium species in agroecosystems and natural environments of Brazil. In this study, the genotypic diversity was accessed and species designation was assigned for 96 Metarhizium strains deposited in the Collection of Entomopathogens \"Prof. Sérgio Batista Alves\" from ESALQ-USP using the sequence variation at 5\'-TEF and the nuclear intergenic loci MzFG543igs and MzIGS3. Sequence diversity at these loci included 10, 11 and 17 sequence haplotypes, according to these loci, respectively. 41 strains were recovered from two sugarcane fields and consisted of 9 haplotypes according to MzIGS3. Five species of Metarhizium were observed, being the two most abundant taxa, Metarhizium anisopliae, Metarhizium robertsii and an additional three taxonomically unassigned lineages are referred to here as Metarhizium sp. indet. 1, Metarhizium sp. indet. 2 and Metarhizium sp. indet. 3. With a single exception, all strains isolated from insects belong to single clade of M. anisopliae, including the isolates infecting spittlebugs in sugarcane agroecosystems. M. robertsii was only recovered from soil or rhizosphere samples. Despite providing a greater degree of genetic resolution among strains, MzIGS3 revealed the inability to recapitulate the consensus phylogeny for the PARB clade and complicates its use as a stand-alone tool for species identification or phylogenetic analysis of Metarhizium. In addition, a laboratory bioassay technique was developed for pathogenicity screening of Metarhizium spp. on M. fimbriolata with low mortality on control group (8-12%) after 28 days of evaluation. The expression of genes pr1A, Mad1 and mpl of three M. anisopliae strains (ESALQ 1037, ESALQ1204 and ESALQ 1641) grown in minimal medium and minimal medium with M. fimbriolata, D. saccharalis or T. molitor cuticle apparently was not related to virulence of the fungi in vivo. Together these data will serve as resources for identification, discovery and communicating about Metarhizium biodiversity for insect biological control applications in Brazil and adjacent countries in South America, as well as assist in the ongoing development and monitoring of the biological control program of M. fimbriolata with Metarhizium in sugarcane fields.

Horticulture is a major foreign exchange earner in Kenya and provides employment to approximately 75% of the population. However, the growth of the horticultural industry is constrained by pests such as the leafminer flies, Liriomyza sativae, L. trifolii and L. huidobrensis (Diptera: Agromyzidae). These pests do not only cause damage to crops, but are also tagged as quarantine pests, resulting in export rejections, loss of export markets and consequently loss of revenue to smallholders. The management of leafminers worldwide has commonly relied on the use of chemical insecticides, but due to associated negative effects thereof, biological control using parasitoids and entomopathogenic fungi has been proposed as major components of integrated pest management (IPM) strategies. The indigenous ectoparasitoid Diglyphus isaea and exotic endoparasitoid Phaedrotoma scabriventris are the two key natural enemies being considered. A number of endophytic fungal isolates have been identified with potential for use as biological control agents of pests. Although there have been previous reports on toxicity of fungal endophytes to leafminers, no attempts have been made to exploit them for control of Liriomyza leafminers. The objectives of this study were to investigate the mechanisms by which fungal endophytes control Liriomyza spp., as well as the interactions between these endophytic fungi and the L. huidobrensis, endoparasitoid Phaedrotoma scabriventris and ectoparasitoid Diglyphus isaea. This study showed that under laboratory conditions, while used separately, parasitism rates of L. huidobrensis by D. isaea and P. scabriventris were 63.6 ± 7.7% and 30.4 ± 10.9% respectively and increased to 77.0 ± 5.3% when used simultaneously. In addition, both parasitoids induced leafminer mortality through larval-feeding and stinging. In order to identify and characterize endophytic fungi that could possibly be used for control of these pests, fungi were isolated from the aboveground parts of maize, sorghum, Napier grass, Coleopteran larvae and Busseola fusca pupae. Identified fungi were evaluated endophytically in two host plants species (Phaseolus vulgaris and Vicia faba) through seed inoculation. The fungal isolates that succeeded in colonizing the host plants were all pathogenic to L. huidobrensis, causing 100% mortality within 13.2 ± 0.7-15.0 ± 0.6 days. They were also able to reduce the longevity of the progeny, the number of pupae and adult emergence and survival. In addition, results also showed that endophytically-inoculated and L. huidobrensis-infested V. faba plants had no adverse effects on parasitism rates and life history parameters of P. scabriventris and D. isaea. Bio-prospecting for fungal endophytes in P. vulgaris and V. faba seeds, followed by morphological and molecular identification revealed the presence of various species of fungal entomopathogens, including Beauveria bassiana, Epacris microphylla, Phanerochaete chrysosporium and Metarhizium anisopliae. / PhD (Environmental Sciences), North-West University, Potchefstroom Campus, 2013

Hypothenemus hampei apresenta aspectos bioecológicos e comportamentais que dificulta o seu controle, como a sua natureza críptica, ficando dentro da semente de café a maior parte de seu ciclo de vida, por apresentar várias gerações por ano. Uma grande quantidade de frutos com H. hampei cai ao solo, constituindo uma excelente forma para sobrevivência do inseto na entressafra e como fonte para novas infestações. O controle de H. hampei deve então ser efetuado no período em que as fêmeas deixam o fruto onde nasceram até o momento em que colonizam novos frutos para reproduzirem. Biopesticida a base de Beauveria bassiana é uma opção disponível para o controle de H. hampei, no entanto, existem poucas evidências de sua eficiência em campo. Objetivou-se com está pesquisa avaliar estratégias para utilização de B. bassiana para manejo de populações de H. hampei por: i) pulverização aquosa com adjuvantes, ii) armadilha atrativa para auto-autocontaminação e iii) incorporação do patógeno no solo com fertilizantes quimícos. Pulverização direta de suspensões de conídios com o adjuvante Tween 80 resultou em menor mortalidade de H. hampei do que suspensões com os demais adjuvantes testados em laboratório. A eficácia dos adjuvantes com o fungo variou com o método de inoculação. As pulverizações diretas dos insetos resultaram em mortalidades reduzidas (23 - 53%), enquanto que a imersão e os métodos que permitiram que os insetos ficassem em contato com os conídios no substrato (fruto ou papel de filtro) após a pulverização resultaram em maiores mortalidades (63 - 98%). As imagens ultramorfológicas de H. hampei inoculados por diferentes métodos sugerem que a região ventral do abdome é o principal sítio de infecção do fungo, visto que, diferente dos outros métodos, na pulverização direta que resultou em mortalidades reduzidas, grande quantidade de conídios aderidos e germinados foram observados no élitro em comparação com a região ventral. Três modelos de armadilha de auto-inoculação foram comparadas em cafezal sombreado e a pleno sol e a captura de H. hampei foi superior em ESALQHh2. O manejo de H. hampei com a armadilha ESALQ-Hh2 foi avaliado em cafezal a pleno sol desde a fase de formação dos frutos até a colheita. Foi constatado em média 6,6% de H. hampei infectados por Beauveria sp. nas plantas distante 4 e 8 m das armadilhas e nenhum inseto infectado nas parcelas com as mesmas armadilhas, mas sem o fungo. Observou-se redução na concentração e viabilidade do patógeno nas armadilhas ao longo do tempo, porém as mortalidades de H. hampei expostos ao fungo foram elevadas (73 - 100%) durante os 148 dias de avaliação. Estudos conduzidos em laboratório revelaram que a capacidade de voo de H. hampei não é afetada pela carga de conídios aderidos ao seu corpo quando comparados aos insetos sem exposição ao fungo. Além disso, apenas 5% dos insetos expostos ao fungo conseguiram penetrar na semente de café, indicando baixo potencial de danos. A mistura de conídios de B. bassiana com fertilizantes químicos granulados em solo de cafezal resultou em reduções (34 e 50%) da infestação de H. hampei quando comparadas às parcelas somente com aplicação dos fertilizantes. Sugere-se que o manejo desta praga com B. bassiana apresenta maior potencial a curto prazo por pulverizações apenas no período de trânsito das fêmeas colonizadoras, e, à médio e longo prazo, pela aplicação do patógeno no solo conjuntamente com fertilizantes e com o uso de armadilha de auto-inoculação. / Hypothenemus hampei, presents bioecological and behavioral aspects that hinders its control, such as its cryptic nature, remaining inside the coffee bean most of its life cycle and for presenting several generations per year. A large number of coffee beans carrying H. hampei drop to the ground, providing an excellent way for insect survival in the off season and as a source for new infestations of berries. The control of H. hampei must thus be made in the period when the females leave the beans where they were born until the moment they colonize new fruits to reproduce. Biopesticide based with Beauveria bassiana is an option available for the control of H. hampei; however, there is little evidence of its effectiveness in the field. The objective of this study was to evaluate strategies to use B. bassiana in the management of H. hampei in three ways: i) aqueous spray with adjuvants, ii) attractive trap of autoinoculation and iv) inoculation of the pathogen into the soil with chemical fertilazers. Direct spraying of suspensions of fungal conidia with adjuvant Tween 80 resulted in lower mortality of H. hampei than suspensions with the other adjuvants tested in the laboratory. The effectiveness of the adjuvant with the fungus varied with the inoculation method. Direct sprays on the insects reduced mortalities (23 - 53%), while immersion and the methods that allowed the insects to have contact with the conidia in the substrate (fruit or filter paper) after spraying, resulted in greater mortality (63 - 98%). Ultramorphological images of H. hampei, inoculated by different methods, suggest that the ventral region of the abdomen is the primary site of infection of the fungus since, unlike the other methods, the direct spray that resulted in reduced mortality, large quantity of conidia adhered and germinated were observed in the elytron compared to the ventral region. Three models of autoinoculation traps were compared in a shaded coffee plantation and in the full sun. Capture of H. hampei was superior in ESALQHh2. The management of H. hampei with trap ESALQ-Hh2 was assessed at a coffee plantation under full sun from fruit formation until harvest. On average, 6.6% of H. hampei was infected by Beauveria sp. in plants 4 and 8 m distant from the traps and no insect was infected in the plots with the same traps, but without the fungus. There was a reduction in concentration and viability of the pathogen in the traps over time; however, mortality of H. hampei exposed to the fungus were high (73 - 100%) during the 148 days of evaluation. Studies conducted in laboratory revealed that the flight capacity of H. hampei was not affected by the load of conidia adhered to its body when compared to insects without exposure to the fungus. Furthermore, only 5% of insects exposed to the fungus managed to penetrate the coffee bean, indicating low potential damage. Inoculation of conidia of B. bassiana, along with granulated chemical fertilizers in the soil of the coffee plantation, reduced (34 and 50%) the infestation of H. hampei compared the plots with only the application of fertilizers. It is suggested that the management of this pest with B. bassiana presents greater potential in the short term by spraying only during the period of transit of colonizing females and in the medium and long term through the application of the pathogen to the soil together with fertilizers and autoinoculation traps.

Horticulture is a major foreign exchange earner in Kenya and provides employment to approximately 75% of the population. However, the growth of the horticultural industry is constrained by pests such as the leafminer flies, Liriomyza sativae, L. trifolii and L. huidobrensis (Diptera: Agromyzidae). These pests do not only cause damage to crops, but are also tagged as quarantine pests, resulting in export rejections, loss of export markets and consequently loss of revenue to smallholders. The management of leafminers worldwide has commonly relied on the use of chemical insecticides, but due to associated negative effects thereof, biological control using parasitoids and entomopathogenic fungi has been proposed as major components of integrated pest management (IPM) strategies. The indigenous ectoparasitoid Diglyphus isaea and exotic endoparasitoid Phaedrotoma scabriventris are the two key natural enemies being considered. A number of endophytic fungal isolates have been identified with potential for use as biological control agents of pests. Although there have been previous reports on toxicity of fungal endophytes to leafminers, no attempts have been made to exploit them for control of Liriomyza leafminers. The objectives of this study were to investigate the mechanisms by which fungal endophytes control Liriomyza spp., as well as the interactions between these endophytic fungi and the L. huidobrensis, endoparasitoid Phaedrotoma scabriventris and ectoparasitoid Diglyphus isaea. This study showed that under laboratory conditions, while used separately, parasitism rates of L. huidobrensis by D. isaea and P. scabriventris were 63.6 ± 7.7% and 30.4 ± 10.9% respectively and increased to 77.0 ± 5.3% when used simultaneously. In addition, both parasitoids induced leafminer mortality through larval-feeding and stinging. In order to identify and characterize endophytic fungi that could possibly be used for control of these pests, fungi were isolated from the aboveground parts of maize, sorghum, Napier grass, Coleopteran larvae and Busseola fusca pupae. Identified fungi were evaluated endophytically in two host plants species (Phaseolus vulgaris and Vicia faba) through seed inoculation. The fungal isolates that succeeded in colonizing the host plants were all pathogenic to L. huidobrensis, causing 100% mortality within 13.2 ± 0.7-15.0 ± 0.6 days. They were also able to reduce the longevity of the progeny, the number of pupae and adult emergence and survival. In addition, results also showed that endophytically-inoculated and L. huidobrensis-infested V. faba plants had no adverse effects on parasitism rates and life history parameters of P. scabriventris and D. isaea. Bio-prospecting for fungal endophytes in P. vulgaris and V. faba seeds, followed by morphological and molecular identification revealed the presence of various species of fungal entomopathogens, including Beauveria bassiana, Epacris microphylla, Phanerochaete chrysosporium and Metarhizium anisopliae. / PhD (Environmental Sciences), North-West University, Potchefstroom Campus, 2013

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis, is considered a major insect pest of soybean. For its control, an alternative to chemical methods is the microbial control, inserted into the pest biological control. Thus, the objective of this study was to isolate fungi from contaminated A. gemmatalis caterpillars and evaluate the pathogenic potential of isolated fungal cultures. For the fungus that caused the greatest mortality percentage of larvae exposed, enzymatic production capacity and production feasibility were found. Still, pathogenicity was evaluated and LC50 and LC90 from the best formulation obtained were established. The fungi isolation occurred from caterpillars on mummification stage, obtained in the central region of Rio Grande do Sul. Larvae mortality, allied to observation of mummification stage, lead to identify the species as Aspergillus nomius presenting the best results (about 95% mortality) among the 20 isolated-fungi. There was no growth of this fungus in culture media rich in chitin and lipids. However, there was growth in a media containing protein, which might suggest that the fungus is a good protease type enzyme producer. Testing to evaluate A. nomius production feasibility, the average spore s concentration (conidia mL-1) in all treatments were similar, with the majority stayed with 1010 conidia.mL-1. Visually, the treatment with 25% water volume per rice volume (50mL), addition of casein in the medium and adding of 6 mL of spore suspension of the fungus A. nomius, which resulted in 2.88 x1010 conidia mL-1, the rice was looser and, therefore, more aired, which may have resulted in a trend toward to a better fungus development. It was evaluated the pathogenicity of this formulated, yielding a high level of mortality among A. gemmatalis larvae, similar to results obtained when spore suspensions originated were applied directly from the fungus growth plates. Yet, at the same conidia concentration mentioned, but testing various dosages, values around 2,23x107 and 1,46x1010 mL.lagarta-1 were obtained, corresponding to LC50 and LC90, respectively, estimated by probit method. Finally, it is concluded that A. nomius presents a high potential regarding to a possible use as A. gemmatalis biological control agent in soybean crops. However, because it is a fungus with pathogenic potential for humans and other native fauna animals, it is necessary further studies related to aflatoxin production by this pathogen and its effects on the environment. / A lagarta-da-soja, Anticarsia gemmatalis, é considerada o principal inseto-praga dessa cultura. Para o seu controle, uma alternativa aos métodos químicos é o controle microbiano, inserido dentro do controle biológico de pragas. Assim, o objetivo deste trabalho foi realizar o isolamento de fungos de lagartas de A. gemmatalis contaminadas e avaliar o potencial patogênico das culturas fúngicas isoladas. Para o fungo que ocasionou a maior porcentagem de mortalidade das lagartas expostas, foi verificada a capacidade de produção enzimática e a viabilidade de produção. Ainda, foi avaliada a patogenicidade e foram estabelecidas a DL50 e a DL90 da melhor formulação obtida. O isolamento dos fungos se deu partir de lagartas, em estágio de mumificação, obtidas na região central do Estado do Rio Grande do Sul. A mortalidade das lagartas, aliada à observação de estágio de mumificação nas mesmas, serviu para identificar a espécie Aspergillus nomius como apresentando o melhor resultado (cerca de 95% de mortalidade) dentre os 20 fungos isolados. Não se observou o crescimento desse fungo em meios de cultura ricos em quitina e lipídios. Porém, houve crescimento em meio contendo proteína, podendo-se sugerir que o fungo é um bom produtor de enzimas do tipo proteases. No teste visando avaliar a viabilidade de produção de A. nomius, a concentração média (conídios.mL-1) de esporos em todos os tratamentos foi semelhante, sendo que a maioria ficou na casa de 1010 conídios.mL-1. Visualmente, no tratamento com 25% de volume de água por volume de arroz (50mL), adição de caseína no meio e adição de 6 mL de suspensão de esporos do fungo A. nomius, e que resultou em 2,88x1010 conídios.mL-1, o arroz ficou mais solto e, com isso, mais aerado, o que pode ter resultado numa tendência de melhor desenvolvimento do fungo. Foi avaliada a patogenicidade desse formulado, obtendo-se um alto nível de mortalidade em lagartas de A. gemmatalis, semelhante aos resultados obtidos quando foram aplicadas suspensões de esporos originadas diretamente das placas de crescimento do fungo. Ainda, na mesma concentração de conídios mencionada, porém testando-se várias dosagens, foram obtidos valores em torno de 2,23x107 e 1,46x1010 mL.lagarta-1, correspondentes à CL50 e CL90, respectivamente, estimadas utilizando-se o método de Probit. Por fim, conclui-se que A. nomius apresenta um alto potencial com vistas a uma possível utilização como agente de controle biológico de A. gemmatalis em cultivos da soja. Porém, por se tratar de um fungo com potencial patogênico para o homem e para outros animais da fauna nativa, é necessário aprofundar estudos relacionados à produção de aflatoxinas por esse entomopatógeno e seus efeitos no ambiente.

Hypothenemus hampei apresenta aspectos bioecológicos e comportamentais que dificulta o seu controle, como a sua natureza críptica, ficando dentro da semente de café a maior parte de seu ciclo de vida, por apresentar várias gerações por ano. Uma grande quantidade de frutos com H. hampei cai ao solo, constituindo uma excelente forma para sobrevivência do inseto na entressafra e como fonte para novas infestações. O controle de H. hampei deve então ser efetuado no período em que as fêmeas deixam o fruto onde nasceram até o momento em que colonizam novos frutos para reproduzirem. Biopesticida a base de Beauveria bassiana é uma opção disponível para o controle de H. hampei, no entanto, existem poucas evidências de sua eficiência em campo. Objetivou-se com está pesquisa avaliar estratégias para utilização de B. bassiana para manejo de populações de H. hampei por: i) pulverização aquosa com adjuvantes, ii) armadilha atrativa para auto-autocontaminação e iii) incorporação do patógeno no solo com fertilizantes quimícos. Pulverização direta de suspensões de conídios com o adjuvante Tween 80 resultou em menor mortalidade de H. hampei do que suspensões com os demais adjuvantes testados em laboratório. A eficácia dos adjuvantes com o fungo variou com o método de inoculação. As pulverizações diretas dos insetos resultaram em mortalidades reduzidas (23 - 53%), enquanto que a imersão e os métodos que permitiram que os insetos ficassem em contato com os conídios no substrato (fruto ou papel de filtro) após a pulverização resultaram em maiores mortalidades (63 - 98%). As imagens ultramorfológicas de H. hampei inoculados por diferentes métodos sugerem que a região ventral do abdome é o principal sítio de infecção do fungo, visto que, diferente dos outros métodos, na pulverização direta que resultou em mortalidades reduzidas, grande quantidade de conídios aderidos e germinados foram observados no élitro em comparação com a região ventral. Três modelos de armadilha de auto-inoculação foram comparadas em cafezal sombreado e a pleno sol e a captura de H. hampei foi superior em ESALQHh2. O manejo de H. hampei com a armadilha ESALQ-Hh2 foi avaliado em cafezal a pleno sol desde a fase de formação dos frutos até a colheita. Foi constatado em média 6,6% de H. hampei infectados por Beauveria sp. nas plantas distante 4 e 8 m das armadilhas e nenhum inseto infectado nas parcelas com as mesmas armadilhas, mas sem o fungo. Observou-se redução na concentração e viabilidade do patógeno nas armadilhas ao longo do tempo, porém as mortalidades de H. hampei expostos ao fungo foram elevadas (73 - 100%) durante os 148 dias de avaliação. Estudos conduzidos em laboratório revelaram que a capacidade de voo de H. hampei não é afetada pela carga de conídios aderidos ao seu corpo quando comparados aos insetos sem exposição ao fungo. Além disso, apenas 5% dos insetos expostos ao fungo conseguiram penetrar na semente de café, indicando baixo potencial de danos. A mistura de conídios de B. bassiana com fertilizantes químicos granulados em solo de cafezal resultou em reduções (34 e 50%) da infestação de H. hampei quando comparadas às parcelas somente com aplicação dos fertilizantes. Sugere-se que o manejo desta praga com B. bassiana apresenta maior potencial a curto prazo por pulverizações apenas no período de trânsito das fêmeas colonizadoras, e, à médio e longo prazo, pela aplicação do patógeno no solo conjuntamente com fertilizantes e com o uso de armadilha de auto-inoculação. / Hypothenemus hampei, presents bioecological and behavioral aspects that hinders its control, such as its cryptic nature, remaining inside the coffee bean most of its life cycle and for presenting several generations per year. A large number of coffee beans carrying H. hampei drop to the ground, providing an excellent way for insect survival in the off season and as a source for new infestations of berries. The control of H. hampei must thus be made in the period when the females leave the beans where they were born until the moment they colonize new fruits to reproduce. Biopesticide based with Beauveria bassiana is an option available for the control of H. hampei; however, there is little evidence of its effectiveness in the field. The objective of this study was to evaluate strategies to use B. bassiana in the management of H. hampei in three ways: i) aqueous spray with adjuvants, ii) attractive trap of autoinoculation and iv) inoculation of the pathogen into the soil with chemical fertilazers. Direct spraying of suspensions of fungal conidia with adjuvant Tween 80 resulted in lower mortality of H. hampei than suspensions with the other adjuvants tested in the laboratory. The effectiveness of the adjuvant with the fungus varied with the inoculation method. Direct sprays on the insects reduced mortalities (23 - 53%), while immersion and the methods that allowed the insects to have contact with the conidia in the substrate (fruit or filter paper) after spraying, resulted in greater mortality (63 - 98%). Ultramorphological images of H. hampei, inoculated by different methods, suggest that the ventral region of the abdomen is the primary site of infection of the fungus since, unlike the other methods, the direct spray that resulted in reduced mortality, large quantity of conidia adhered and germinated were observed in the elytron compared to the ventral region. Three models of autoinoculation traps were compared in a shaded coffee plantation and in the full sun. Capture of H. hampei was superior in ESALQHh2. The management of H. hampei with trap ESALQ-Hh2 was assessed at a coffee plantation under full sun from fruit formation until harvest. On average, 6.6% of H. hampei was infected by Beauveria sp. in plants 4 and 8 m distant from the traps and no insect was infected in the plots with the same traps, but without the fungus. There was a reduction in concentration and viability of the pathogen in the traps over time; however, mortality of H. hampei exposed to the fungus were high (73 - 100%) during the 148 days of evaluation. Studies conducted in laboratory revealed that the flight capacity of H. hampei was not affected by the load of conidia adhered to its body when compared to insects without exposure to the fungus. Furthermore, only 5% of insects exposed to the fungus managed to penetrate the coffee bean, indicating low potential damage. Inoculation of conidia of B. bassiana, along with granulated chemical fertilizers in the soil of the coffee plantation, reduced (34 and 50%) the infestation of H. hampei compared the plots with only the application of fertilizers. It is suggested that the management of this pest with B. bassiana presents greater potential in the short term by spraying only during the period of transit of colonizing females and in the medium and long term through the application of the pathogen to the soil together with fertilizers and autoinoculation traps.