Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica encontrada em várias partes do mundo e tem a capacidade de produzir cristais durante a fase estacionária do crescimento. Esses cristais são toxinas compostas por proteínas ativas contra uma ampla variedade de fases imaturas de insetos. As toxinas do Bt têm sido usadas como bioinseticidas por décadas no controle de insetos das ordens Coleoptera, Lepidoptera e Diptera, e algumas toxinas já foram selecionadas como efetivas contra ácaros, nematoides e insetos sugadores de floema da ordem Hemiptera, como os afídeos. Recentemente, foi comprovada a patogenicidade de três isolados de Bt a outro inseto dessa ordem, o psilídeo Diaphorina citri. Esse psilídeo é vetor das bactérias Candidatus Liberibacter spp., agentes causais da principal doença dos citros: o Huanglongbing ou HLB. A descoberta da capacidade endofítica de Bt em plantas de diferentes espécies vegetais abriu perspectivas para novos estudos usando o Bt para controle de insetos sugadores, como a D. citri. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito patogênico de cada toxina Cry ou Cyt presente nestes três isolados através de isolados de Bt recombinantes expressando as toxinas individualmente. Foram montados bioensaios para confirmar a taxa de mortalidade causada por isolados de Bt contra ninfas de D. citri. Os bioensaios foram feitos usando cinco plantas de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) e dez ninfas de 3º ínstar de D. citri por planta, além dos controles (sem Bt). A mortalidade das ninfas foi avaliada diariamente durante cinco dias. Durante a avaliação, as ninfas mortas foram coletadas para o isolamento do Bt além da detecção do gene da toxina por PCR. No final do experimento, as folhas jovens onde as ninfas se alimentavam também foram avaliadas quanto à presença do Bt. Nossos resultados confirmaram que os isolados de Bt previamente identificados como patogênicos a D. citri causaram elevada mortalidade (em média 68-93%) em ninfas de 3º ínstar. Dentre os isolados recombinantes testados, um deles apresentou grande destaque, causando a mortalidade de 68-81% das ninfas em 48 horas e 83-93% em 120 horas. Esse isolado possui grande potencial de uso no controle biológico de D. citri através da produção de um bioinseticida ou produção de plantas de citros transgênicas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium found in several locations around the world and has the ability to produce crystals during the stationary phase of growth. These crystals are composed of protein toxins that are active against a wide variety of insect larvae. The Bt toxins have been used for decades as biopesticides to control insects of the orders Coleoptera, Lepidoptera, and Diptera. Some toxins have been selected as effective for mites, nematodes and phloem-sucking insects of the order Hemipera, such as aphids. The pathogenicity of strains of Bt to Diaphorina citri, an hemipteran known as Asian citrus psyllid, has been recently demonstrated. This psyllid is the vector of the bacteria Candidatus Liberibacter spp., the causal agents of the main disease of citrus: Huanglongbing or HLB. The discovery of the ability of Bt strains to endophytically colonize plants of different species has opened new perspectives for studies. The aim of this work was to evaluate the pathogenic effect of each Cry or Cyt toxin present in these three isolates through the use of recombinant Bt isolates expressing each toxin individually. A series of bioassays were done in order to confirm the mortality caused by Bt strains against nymphs of D. citri. Bioassays were performed in five seedlings of Citrus sinensis (L.) Osbeck (five replicates/ bioassay) and using ten D. citri 3rd instar nymphs to each assay plant. A suspension containing Bt spores was inoculated via drench in each seedling, and five seedlings were maintained as negative control (without Bt). Mortality was assessed daily for five days. During the bioassays, dead nymphs were collected for further Bt isolation and detection by PCR. At the end of the experiment, young leaves where nymphs feed were also collected to Bt isolation and detection. Our results confirmed that the previously identified Bt isolates pathogenic to D. citri cause high mortality to 3rd instar nymphs. Among the ten recombinant isolates tested, one of them stood out, causing 68-81 % and 83-93% mortality after 48 and 120 hours of inoculation, respectively. The isolation of Bt from dead nymphs and young leaves, and PCR performed with specific primers confirmed the presence of the Bt isolates in psyllids and plants, and their involvement in psyllid mortality. This recombinant Bt with the higher mortality rate found in our results has the potential to be used as a bioinsecticide to control D. citri and the toxin gene can be used to genetic engineering of citrus.

Um dos principais riscos associados às culturas inseticidas que expressam toxinas da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) é a evolução de resistência em pragas alvo, processo governado por fatores genéticos e bioecológicos que se inter-relacionam. Um dos parâmetros chave que influenciam a evolução de resistência é a freqüência inicial do alelo de resistência na população da praga alvo (FreqInicial). Devido à complexidade desse processo, experimentos para estudar sua evolução em larga escala são praticamente impossíveis. Modelos matemáticos de simulação têm sido utilizados para estimar a freqüência do alelo de resistência (FreqR) à toxina Bt ao longo das gerações da praga. O risco de resistência foi estimado utilizado o modelo de Caprio, incorporando incerteza ao parâmetro FreqInicial. Essa abordagem, denominada análise de incertezas, possibilita estimar o risco ao longo das gerações da praga, quantificado pela probabilidade de FreqR exceder um valor crítico. Os principais objetivos deste trabalho foram: (i) discutir o uso de análise de incertezas no contexto da estimação do risco de resistência e (ii) avaliar o efeito de diferentes distribuições da freqüência inicial do alelo de resistência (FreqInicial) sobre as estimativas de risco. Foi desenvolvido um software (RRiskBt), em linguagem Visual BASIC que permite quantificar o risco de resistência utilizando análise de incertezas. Os resultados da análise de incertezas indicaram que as estimativas de risco são afetadas pela distribuição de FreqInicial de modo diferenciado ao longo das gerações. As estimativas do risco de resistência, considerando a distribuição Normal para FreqInicial, são similares àquelas considerando a distribuição Triangular quando as referidas distribuições têm a mesma variância. O uso da distribuição Uniforme, ao invés da Normal ou Triangular em função da falta de informação sobre FreqInicial, leva à superestimação das estimativas de risco de resistência nas gerações iniciais e subestimação nas gerações subseqüentes à geração na qual a freqüência crítica é atingida. A análise de sensibilidade de FreqR a variações nos parâmetros FreqInicial ou DFRes possibilita estimar a geração a partir da qual a estimativa de FreqR independe da variação do parâmetro em questão dentro de um intervalo de valores possíveis preestabelecido. A utilização da análise de incertezas possibilita estimar a geração da praga alvo a partir da qual o risco de resistência é superior a 0,99, independentemente da distribuição utilizada para caracterizar a incerteza associada a FreqInicial. / One of the main risks associated to transgenic crops expressing Bacillus thuringiensis (Bt) toxins is the pest resistance evolution, process driven by genetic and ecological inter related factors. A key parameter that influences the rate of resistance evolution is the initial frequency of the resistance allele in the pest population (FreqInicial). Due to complexity of that process, large scale field experiments to investigate resistance evolution are practically impossible. Mathematical simulation models have been utilized to estimate the R allele frequency (FreqR) along pest generations. The resistance risk was estimated using the deterministic Caprio’s model, incorporating uncertainty to FreqInicial. That approach, called uncertainty analysis, allows to estimate resistance risk along generations. The risk is quantified by the probability of FreqR exceeding a critical value. The main objectives of this work were: (i) to discuss the use of uncertainty analysis in the context of risk resistance estimation and (ii) to evaluate the effect of different FreqInicial input probability distributions on the risk estimates. A software (RRiskBt) was developed in Visual BASIC language to quantify risk of pest resistance evolution to Bt toxins using uncertainty analysis. The results of uncertainty analysis showed that the influence of FreqInicial input distributions on the risk estimates changes along pest generations. The risk estimates considering input Normal distribution for FreqInicial are similar to those ones obtained considering Triangular distribution if their variances are equal. The use of Uniform distribution instead the Normal or Triangular due to lack of information about FreqInicial, leads to super estimation of risk estimates for the initial generations and sub estimation for the generations after the generation for which the critical frequency is achieved. The sensitivity analysis of FreqR to FreqInicial or DFRes allows to estimate the generation after which the FreqR estimates become independent of changes in the particular parameter. The uncertainty analysis allows to estimate the pest generation after which the resistance risk is higher than 0.99, independently of the FreqInicial input distribution.