Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Laboratório de Enzimologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-07-23T11:15:58Z No. of bitstreams: 1 2013_BrendaRabellodeCamargo.pdf: 1629534 bytes, checksum: 5c3f05b33b886b1d1c691fe38f9dab93 (MD5) / Approved for entry into archive by Leandro Silva Borges(leandroborges@bce.unb.br) on 2013-07-24T17:51:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_BrendaRabellodeCamargo.pdf: 1629534 bytes, checksum: 5c3f05b33b886b1d1c691fe38f9dab93 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-24T17:51:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_BrendaRabellodeCamargo.pdf: 1629534 bytes, checksum: 5c3f05b33b886b1d1c691fe38f9dab93 (MD5) / A busca por fontes de combustíveis renováveis tem ocupado o centro de discussões em função da necessidade da redução da poluição proveniente da queima de combustíveis fósseis e a uma adequação da matriz energética atual. No Brasil, a proposta é utilizar biomassa vegetal para a produção de bioetanol de segunda geração produzido a partir de resíduos agroindustriais (bagaço e palha de cana de açúcar e piolho de algodão), sendo que uma das etapas limitantes para esse fim é a hidrólise desta biomassa para produção de açúcares fermentáveis. A linhagem de Clostridium thermocellum (Isolado B8) isolada de rúmen de caprinos da raça Moxotó foi caracterizada como capaz de hidrolisar as biomassas citadas e de secretar enzimas e complexos enzimáticos (celulossomas) com atividade de carboximetilcelulase (CMCase) e xilanase. Estas atividades foram detectadas nos sobrenadantes das culturas e também nas frações de proteínas celulossomais, eluídas do substrato residual (FES) e recuperadas do sobrenadante por adsorção a celulose cristalina (FEC).. A fração de proteínas celulossomais eluídas dos substratos palha de cana de açúcar, bagaço de cana-de-açúcar e piolho de algodão, denominadas FES, apresentaram valores mais significativos de atividade de CMCase na faixa de pH de 5,0 a 7,0 e de xilanase de 6,0, e valores de temperatura ótima na faixa entre 65°C e 70°C para CMCase e xilanase. A fração de proteínas celulossomais de palha de cana apresentaram uma média de 80% de retenção da sua atividade de xilanase e CMCase quando incubadas a 70°C por 6 horas. As amostras FEC e FES das fontes de carbono utilizadas apresentaram perfis semelhantes de bandas protéicas pela análise de atividade em gel, sendo observadas 6 bandas com atividade de CMCase e 7 bandas com atividade de xilanase. As amostras FES das diferentes fontes de carbono fracionadas em coluna de exclusão molecular apresentaram perfis cromatográficos diferentes com relação ao volume de eluição dos picos protéicos com massa molecular estimada acima de 2 MDa, e em análise por DLS (Espalhamento de luz dinâmica) foi estimado uma proteína com a massa estimada de 6,5MDa para a amostra de bagaço de cana e palha de cana. Duas proteínas presentes na fração de palha de cana foram identificadas por espectrometria de massa: a proteína estrutural (CipA) e a exoglucanase (CelS). Estes resultados indicam o potencial de utilização do isolado B8 como fonte de atividades enzimáticas holocelulolíticas com propriedades cinéticas adequadas para aplicação industrial.O isolado B8 secreta celulossoma quando cultivado em diferentes fontes de carbono e estes apresentam constituições distintas podendo contribuir para o desenvolvimento de processo industrial para hidrólise enzimática destes resíduos. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The search for sources of renewable fuels has been at the center of discussions around the need of reducing pollution from the burning of fossil fuels and the adequacy of current energy matrix. In Brazil, the proposal is to use biomass for the production of second generation bioethanol produced from agricultural and industrial waste (sugar cane straw and bagasse,and cotton louse), and one of the limiting steps for this purpose is the hydrolysis of this biomass for production of fermentable sugars. The strain of Clostridium thermocellum (Isolated B8) isolated from the rumen of Moxotó goats was characterized as capable of hydrolyzing the biomass cited and secrete enzymes and enzyme complexes (Cellulosomes) with carboxymethylcellulase activity (CMCase) and xylanase. These activities were detected in the culture supernatants and also in cellulosomal protein fractions, eluted from the residual substrate (FES) and recovered from the supernatant by adsorption crystalline cellulose (FEC). The fraction eluted cellulosomal protein substrates of sugar cane straw, sugar cane bagasse and cotton louse, called FES, showed more significant CMCase activity at pH 5.0 to 7.0 and xylanase of 6.0 and optimum temperature values in the range between 65°C and 70°C for CMCase and xylanase. The protein fraction cellulosomal of straw showed a mean 80% retention of its CMCase and xylanase activities when incubated at 70°C for 6 hours. Samples FEC FES from the carbon sources used showed similar profiles of protein bands by activity gel analysis, were observed 6 bands with CMCase activity and 7 bands with xylanase activity. The samples FES of different carbon sources fractionated on a column of molecular exclusion showed different chromatographic profiles with respect to the elution volume of the protein peaks with estimated molecular weight above 2 MDa. Pooled fractions analyzed by DLS (dynamic light scattering) peaks were detected consisting of high molecular weight proteins, with the estimated mass of 6.5 MDa for the sample of bagasse and cane straw. Two proteins present in the fraction of straw were identified by mass spectrometry: the structural protein (CipA) and exoglucanase (CelS). These results indicate the potential use of isolated B8 as a source of xylanases and CMCases activities with kinetic properties suitable for industrial applying. The isolated B8 releases cellulosome when grown on different carbon sources and these have different constitutions and could contribute to the development of industrial processes for Enzymatic hydrolysis of these residues.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-07-25T13:26:24Z No. of bitstreams: 1 2013_GilvanCaetanoDuarte.pdf: 4660619 bytes, checksum: ebcfd427e9b15fe76b95d88e4051d7f7 (MD5) / Approved for entry into archive by Leandro Silva Borges(leandroborges@bce.unb.br) on 2013-07-25T21:05:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_GilvanCaetanoDuarte.pdf: 4660619 bytes, checksum: ebcfd427e9b15fe76b95d88e4051d7f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-25T21:05:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_GilvanCaetanoDuarte.pdf: 4660619 bytes, checksum: ebcfd427e9b15fe76b95d88e4051d7f7 (MD5) / Piolho de algodão sujo, piolho de algodão limpo e pó de filtro são resíduos da indústria têxtil e representam fontes de matérias-primas renováveis com elevados percentuais de holocelulose. A degradação destes resíduos requer a atividade de holocelulases produzidas por Aspergillus oryzae, reconhecido pelos elevados títulos de hemicelulases, especialmente xilanases, quando cultivado em biomassa lignocelulósica residual como fonte de carbono. Este trabalho objetivou utilizar os resíduos da indústria têxtil no cultivo submerso de A. oryzae e produção de holocelulases, além de purificar, caracterizar e submeter estas enzimas à hidrólise de substratos lignocelulósicos. A suplementação dos meios de cultivo com os resíduos pré-tratados, (NH4)2SO4 0,16%, e o estabelecimento do período de 6 dias de cultivo aumentaram a produção de xilanases por A. oryzae. Por consequência, uma xilanase (Xyl-O1) de 21,5 kDa foi purificada da fração ultrafiltrado do extrato bruto (EB) de A. oryzae e apresentou atividade catalítica máxima a 50°C e pH 6,0, termoestabilidade a 50°C por 6 h quando em presença de L-cisteína 20 mmol.L-1, especificidade em hidrolisar ligações glicosídicas β(1-4) internas de substratos solúveis, com eficiência máxima de 33% para hidrólise de xilana de bétula e liberação de xilobiose como produto predominante. A partir da fração concentrado do EB de A. oryzae, outras isoenzimas com atividade de xilanase foram purificadas e identificadas como Xyl-O2 (21,5 kDa) e Xyl-O3/Xyl-O4 (35,3 e 33,1 kDa, respectivamente). Em adição, uma endoglicanase (Cel-O1) foi parcialmente purificada e apresentou massa molecular entre 40 e 45 kDa. A caracterização da amostra contendo as isoenzimas Xyl-O3/Xyl-O4 revelou maior atividade catalítica a 60°C e no intervalo de pH 5,0 a 7,0 quando diluídas em tampão tris-HCl. A amostra ainda permaneceu 100% termoestável a 40°C por 24 h. As holocelulases produzidas por A. oryzae apresentaram maior atividade de hidrólise sobre o bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor, com 0,398 mg.mL-1 de açúcar redutor (AR) liberado. As amostras enzimáticas de ultrafiltrado do EB de A. oryzae e de Xyl- O1 purificada promoveram a hidrólise das polpas de celulose (PC), com 0,168 mg.mL-1 de AR liberado pela amostra Xyl-O1 purificada sobre a PC branca. A liberação de cromóforo a 237 nm e do produto xilobiose resultaram da atividade das amostras enzimáticas sobre as PC. A. oryzae cultivado em resíduos da indústria têxtil produziu elevados títulos de hemicelulases, principalmente xilanases. A caracterização enzimática destas isoenzimas, purificadas ou parcialmente purificadas, revelaram propriedades catalíticas que as tornam alvos potenciais de aplicação nas biorefinarias. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Dirty cotton, clean cotton and filter powder are textile residues and represent sources of renewable raw materials with high percentages of holocellulose. The degradation of these residues requires the holocellulase activities produced by Aspergillus oryzae recognized by high titers of hemicellulases, xylanases especially when grown on lignocellulosic biomass waste as a carbon source. This study aimed to use the textile industry residue in submerged cultivation of A. oryzae and production of holocelulases. In addition, purify and characterize these enzymes undergo hydrolysis of lignocellulosic substrates. Supplementation of culture medium with the pretreated residues, 0.16% (NH4)2SO4 and setting the period of 6 days cultivation increased the production of xylanases by A. oryzae. Consequently, a xylanase (Xyl-O1) of 21.5 kDa was purified from ultrafiltrate fraction of A. oryzae crude extract (CE) and showed maximal catalytic activity at 50°C and pH 6.0. It was thermostable at 50°C for 6 h in the presence of 20 mmol.L-1 L-cysteine. Xyl-O1 showed specificity in hydrolyze the internal glycosidic bonds β(1-4) in soluble substrates, with maximum efficiency of 33% for the hydrolysis of birchwood xylan and release of xylobiose as the predominant product. From the concentrated fraction of A. oryzae CE, other isoenzymes with xylanase activity were purified and identified as Xyl-O2 (21.5 kDa) and Xyl-O3/Xyl-O4 (35.3 and 33.1 kDa respectively). In addition, an endoglucanase (Cel-O1) was partially purified and presented molecular weight between 40 and 45 kDa. The characterization of the sample containing Xyl- O3/Xyl-O4 isoenzymes showed a higher catalytic activity at 60°C and in the pH range from 5.0 to 7.0 when diluted in Tris-HCl buffer. The sample still remained 100% thermostable at 40°C for 24 h. The holocellulases produced by A. oryzae showed greater activity on the hydrolysis of steam-exploded sugarcane bagasse, with 0.398 mg.mL-1 of reducing sugar (RA) released. Enzymatic samples of ultrafiltrate from A. oryzae CE and purified Xyl-O1 promoted hydrolysis of paper pulps (PP), with 0.168 mg.mL-1 of RA released by purified Xyl-O1 on white PP. The release of chromophore at 237 nm and xylobiose product resulted from the enzymatic activity of the samples on the PP. A. oryzae grown in the textile industry waste produced high titers of hemicellulases, mainly xylanases. The enzymatic characterization of these enzymes purified or partially purified revealed catalytic properties which make them potential targets for application of the biorefineries.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-23Bitstream added on 2014-06-13T20:56:19Z : No. of bitstreams: 1 luizonfilho_ra_me_sjrp.pdf: 2226610 bytes, checksum: 7ef836fc66e512e96ee4f8432117e475 (MD5) / O termo zeólitas abrange a classe dos alumino silicatos hidratados de metais alcalinos ou alcalino-terrosos. A enzima lipase de Thermomyces lanuginosus foi imobilizada em zeolitas, produzindo um catalisador heterogêneo com potencial aplicação para a produção de biodiesel. Dois tipos de zeolita foram sintetizados: zeolita gismondina (GIS/Na) e um novo material zeolitico com topologia faujasítica (FAU/Co e FAU/Cu). A zeolita gismondina foi submetida ao processo de troca iônica com os cátions divalentes Ni 2+ , Co 2+ , Mg 2+ , Sr 2+ , Mn 2+ e Ca 2+ (GIS/Ni, GIS/Co, GIS/Mg, GIS/Sr, GIS/Mn e GIS/Ca) e a zeólita com topologia faujasítica foi submetida ao processo de troca iônica com NH4 + (FAU/Co.NH 4 e FAU/Cu.NH 4 ) e posteriormente calcinada a 500 o C (FAU/Co.H + e FAU/Cu.H + ). Estes materiais foram utilizados como suporte sólido para a imobilização enzimática, dando origem aos complexos zeolita-enzima: GIS/Ni/ENZ, GIS/Co/ENZ e FAU/Co.NH 4 /ENZ por exemplo. Foram utilizados dois métodos diferentes de imobilização. Em um deles, foi feito um pré-tratamento da lipase com o substrato (óleo de soja) e em outro a enzima foi imobilizada sem o pré-tratamento com o substrato. Foram feitos experimentos de transesterificação de triglicerídeos para a produção de biodiesel utilizando como catalisador da reação as zeolitas puras, a enzima pura e os complexos zeolita-enzima. Os catalisadores com topologia faujasitica (FAU/Co e FAU/Cu) atuando em condições experimentais de 100 o C, razão molar óleo:álcool de 1:50 por 12 horas fornecem bons rendimentos de ésteres (90%). Os catalisadores GIS/Ni/ENZ e FAU/Co.NH 4 /ENZ (imobilização com pré tratamento da enzima) apresentaram os maiores valores de atividade enzimática e bons rendimentos de ésteres etílicos. A mesma quantidade de enzima (0,4 mg) foi utilizada em sua forma livre e imobilizada... / The term zeolites comprehend the class of hydrated alkaline or earth alkaline metals alumino silicates. Thermomyces lanuginosus lipase enzyme was immobilized on zeolites, producing a heterogeneous catalyst with potential application on biodiesel production. Two types of zeolite were synthesized: gismondina zeolite (GIS/Na) and a new faujasite like zeolitic material: (FAU/Co e FAU/Cu). Gismondine zeolite was ion exchanged with divalent cations Ni 2+ , Co 2+ , Mg 2+ , Sr 2+ , Mn 2+ e Ca 2+ (GIS/Ni, GIS/Co, GIS/Mg, GIS/Sr, GIS/Mn e GIS/Ca) and the faujasite like zeolite was ion exchanged with NH4 + (FAU/Co.NH 4 e FAU/Cu.NH 4 ) and after this it was calcined at 500 o C (FAU/Co.H + e FAU/Cu.H + ). These materials were used as solid support for enzymatic immobilization originating the zeolite-enzyme complexes: GIS/Ni/ENZ, GIS/Co/ENZ and FAU/Co.NH 4 /ENZ for example. Two different methods of immobilization were used. In one of them the lipase was pretreated with the substrate (soybean oil) and in the other one the enzyme was immobilized without the pretreatment with substrate. Triglycerides transesterification experiments to biodiesel production were carried out using pure zeolite, pure enzyme and the zeolite-enzyme complexes as reaction catalyst. When used with experimental conditions of 100 o C, oil:alcohol molar ratio of 1:50 faujasite like catalyst performed good ester yield (90%). GIS/Ni/ENZ and FAU/Co.NH4 /ENZ catalysts (immobilization with pretreated enzyme) showed higher enzymatic activity values and good ethylic esters yield. The same amount of enzyme (0,4 mg) was used in its free and immobilized form in the transesterification reaction (45 o C, oil:alcohol molar ratio of 1:5 for 48 hours). Comparing transesterification reaction esters yield for the free enzyme (51,9%) and for the GIS/Ni/ENZ (70,3%) and FAU/Co.NH4 /ENZ (58,4%) catalysts, was possible... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Banca: Saulo Santesso Garrido / Banca: Maristela de Freitas Sanches Peres / Resumo: As enzimas são importantes catalisadores de reações biológicas, sendo que as de origem microbiológicas tem recebido atenção especial devido à facilidade de obtenção ou até mesmo na síntese de enzimas geneticamente modificadas. O uso desses catalisadores biológicos na indústria vem aumentando com o avanço de estudos e pesquisas de suas propriedades e melhoramento dos processos em que são empregados. A álcool desidrogenase (ADH) é uma enzima de uso industrial e biotecnológico importante para quantificação de etanol em biocombustíveis e em bebidas, onde, em comparação com outros métodos, têm mostrado ser o mais eficaz. A melhora da estabilidade da enzima é feita pelo processo de imobilização. Alguns métodos de imobilização são mais comumente aplicados devido à facilidade de preparo e/ou imobilização da enzima no suporte, como por exemplo, o suporte alginato-quitosana. Os suportes alginato-quitosana e glixil-agarose foram utilizados neste trabalho para se tentar melhorar a estabilidade da ADH. O objetivo principal deste estudo foi o de encontrar um método mais eficaz para imobilizar a ADH e avaliar sua estabilidade frente a pH, temperatura, variação de concentração de substrato, adição de sais metálicos ao ensaio, entre outros. Os resultados mostraram que houve interferência do pH na estabilidade das esferas de alginato-quitosana impossibilitando seu uso neste ensaio e quando imobilizada em suporte glioxil-agarose apresentou estabilidade maior em maiores temperaturas e pH, mas não demonstrou boa estabilidade quando estocada. / Abstract: Enzymes are important catalysts of biological reactions, and the microbiological origin has received special attention due to the ease of obtaining or even in the synthesis of genetically modified enzymes. The use of these biological catalysts in the industry is increasing with the advancement of studies and research of its properties and improving processes in which they are employed. The alcohol dehydrogenase (ADH) is an enzyme of industrial use and biotechnological important for quantitation of ethanol in biofuels and beverages, which in comparison with other methods, have shown to be most effective. The improvement of the enzyme stability is made by the immobilization process. Some methods of immobilization are most commonly applied because of the ease of preparation and/or immobilization of the enzyme on the support, for example, alginate-chitosan support. The supports alginate-chitosan and glyoxyl-agarose were used in this study to try to improve the stability of ADH. The aim of this study was to find a more effective method to immobilize the ADH and evaluate its stability against pH, temperature, variation of substrate concentration, addition of metal salts in the assay, among others. The results showed that there was interference of pH on the stability of alginate-chitosan beads precluding their use in this assay and when immobilized on glyoxyl agarose support was more stable at higher temperatures and pH, but showed good stability when stored. / Mestre

Orientador: José Geraldo Nery / Banca: Eleni Gomes / Banca: Leandro Martins / Resumo: O termo zeólitas abrange a classe dos alumino silicatos hidratados de metais alcalinos ou alcalino-terrosos. A enzima lipase de Thermomyces lanuginosus foi imobilizada em zeolitas, produzindo um catalisador heterogêneo com potencial aplicação para a produção de biodiesel. Dois tipos de zeolita foram sintetizados: zeolita gismondina (GIS/Na) e um novo material zeolitico com topologia faujasítica (FAU/Co e FAU/Cu). A zeolita gismondina foi submetida ao processo de troca iônica com os cátions divalentes Ni 2+ , Co 2+ , Mg 2+ , Sr 2+ , Mn 2+ e Ca 2+ (GIS/Ni, GIS/Co, GIS/Mg, GIS/Sr, GIS/Mn e GIS/Ca) e a zeólita com topologia faujasítica foi submetida ao processo de troca iônica com NH4 + (FAU/Co.NH 4 e FAU/Cu.NH 4 ) e posteriormente calcinada a 500 o C (FAU/Co.H + e FAU/Cu.H + ). Estes materiais foram utilizados como suporte sólido para a imobilização enzimática, dando origem aos complexos zeolita-enzima: GIS/Ni/ENZ, GIS/Co/ENZ e FAU/Co.NH 4 /ENZ por exemplo. Foram utilizados dois métodos diferentes de imobilização. Em um deles, foi feito um pré-tratamento da lipase com o substrato (óleo de soja) e em outro a enzima foi imobilizada sem o pré-tratamento com o substrato. Foram feitos experimentos de transesterificação de triglicerídeos para a produção de biodiesel utilizando como catalisador da reação as zeolitas puras, a enzima pura e os complexos zeolita-enzima. Os catalisadores com topologia faujasitica (FAU/Co e FAU/Cu) atuando em condições experimentais de 100 o C, razão molar óleo:álcool de 1:50 por 12 horas fornecem bons rendimentos de ésteres (90%). Os catalisadores GIS/Ni/ENZ e FAU/Co.NH 4 /ENZ (imobilização com pré tratamento da enzima) apresentaram os maiores valores de atividade enzimática e bons rendimentos de ésteres etílicos. A mesma quantidade de enzima (0,4 mg) foi utilizada em sua forma livre e imobilizada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The term zeolites comprehend the class of hydrated alkaline or earth alkaline metals alumino silicates. Thermomyces lanuginosus lipase enzyme was immobilized on zeolites, producing a heterogeneous catalyst with potential application on biodiesel production. Two types of zeolite were synthesized: gismondina zeolite (GIS/Na) and a new faujasite like zeolitic material: (FAU/Co e FAU/Cu). Gismondine zeolite was ion exchanged with divalent cations Ni 2+ , Co 2+ , Mg 2+ , Sr 2+ , Mn 2+ e Ca 2+ (GIS/Ni, GIS/Co, GIS/Mg, GIS/Sr, GIS/Mn e GIS/Ca) and the faujasite like zeolite was ion exchanged with NH4 + (FAU/Co.NH 4 e FAU/Cu.NH 4 ) and after this it was calcined at 500 o C (FAU/Co.H + e FAU/Cu.H + ). These materials were used as solid support for enzymatic immobilization originating the zeolite-enzyme complexes: GIS/Ni/ENZ, GIS/Co/ENZ and FAU/Co.NH 4 /ENZ for example. Two different methods of immobilization were used. In one of them the lipase was pretreated with the substrate (soybean oil) and in the other one the enzyme was immobilized without the pretreatment with substrate. Triglycerides transesterification experiments to biodiesel production were carried out using pure zeolite, pure enzyme and the zeolite-enzyme complexes as reaction catalyst. When used with experimental conditions of 100 o C, oil:alcohol molar ratio of 1:50 faujasite like catalyst performed good ester yield (90%). GIS/Ni/ENZ and FAU/Co.NH4 /ENZ catalysts (immobilization with pretreated enzyme) showed higher enzymatic activity values and good ethylic esters yield. The same amount of enzyme (0,4 mg) was used in its free and immobilized form in the transesterification reaction (45 o C, oil:alcohol molar ratio of 1:5 for 48 hours). Comparing transesterification reaction esters yield for the free enzyme (51,9%) and for the GIS/Ni/ENZ (70,3%) and FAU/Co.NH4 /ENZ (58,4%) catalysts, was possible... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Valter de Albuquerque Pedrosa / Coorientador: Luciana Francisco Fleuri / Banca: Maria José Queiroz de Freitas Alves / Banca: Haroldo Yukio Kawaguti / Resumo: As lipases, também chamadas de glicerol éster hidrolases, são enzimas que fazem parte do grupo das serina hidrolases, tendo como substrato, triglicerídeos. O modo de ação das lipases assemelha-se ao das esterases, realizando a hidrólise das ligações ésteres-carboxílicas de acilgliceróis, formando ácidos graxos e glicerol. Processos de bioconversão enzimática têm sido bastante utilizados na produção, transformação e valorização de matérias-primas. Avanços na tecnologia enzimática, como a imobilização de enzimas, possibilitaram a modificação das propriedades cinéticas e da estabilidade destas moléculas contribuindo com o aumento no potencial de aplicações das mesmas. O presente trabalho teve por objetivo estudar diferentes métodos de imobilização de lipases em suportes de sílica, bem como os efeitos deste procedimento, visando melhorar a funcionalidade das enzimas e o maior rendimento econômico nos processos industriais. Os métodos de imobilização escolhidos para os estudos foram: adsorção física, ligação covalente e encapsulação. O processo de imobilização de lipase em Celite (adsorção física) foi otimizado levando em conta o pH, porcentagem da concentração enzima:suporte e temperatura ótimos de atividade enzimática. Também se utilizou Celite como suporte para a imobilização de lipase por ligação covalente, onde se obteve os melhores resultados com atividade enzimática 20% a 40 ºC e eficiência de imobilização de 50%. A celite foi ativada com 3-aminopropiltrietoxisilano e glutaraldeído. Por último, foi avaliada a possibilidade de encapsulação da lipase utilizando o precursor tetraetilortossilicato (TEOS). Os resultados obtidos nesta última metodologia não se mostraram satisfatórios. Logo, com os dados obtidos, podemos dizer que uma boa manutenção da atividade catalítica depende do tipo de retenção (química ou física) e da força de interação ... / Abstract: Lipases, also known as glycerol ester hydrolases , are enzymes that belong to the group of serine hydrolases. The mode of action of lipases is very similar to esterase group, performing the hydrolysis of carboxylic esters of glycerides - forming fatty acids and glycerol. The enzymatic bioconversion processes have been widely used in manufacturing, processing and recovery of raw materials. Advances methodology for immobilization of enzyme have allowed the modification of the kinetic properties and stability of these molecules contributing to the increase in the potential applications of the same. The present work is aimed to study different methods of immobilization of lipases in silica supports, and the effects of this procedure to improve the functionality of enzymes. The immobilization methods chosen for the studies were: physical adsorption, covalent bonding and encapsulation process. The process of immobilization of lipase on Celite (by physical adsorption) was optimized taking into account several parameters such as: pH, the enzyme concentration:support and temperature for enzyme activity. Celite was also used as a support for the immobilization of lipase by covalent bond, where best results were obtained with 20% enzymatic activity at 40 ° C and immobilization efficiency of 50%. The celite was activated with 3-aminopropyltriethoxysilane and glutaraldehyde. Finally, we have studied the possibility of encapsulation of lipase using the precusor tetraethylorthosilicate (TEOS). The results of this last methodology were not satisfactory. These results show that to maintain a good catalytic activity depends on the type of immobilization chose (chemical or physical) and the strength of the interaction between the enzyme and support, which can cause structural distortions in the protein, leading maintenance or a decrease in catalytic activity / Mestre

Orientador: Crispin Humberto Garcia-Cruz / Banca: Ozair Souza / Banca: Fernanda Maria Pagane Guereschi Ernandes / Resumo: Muitos países estão considerando razoável, e necessário, a curto e médio prazo, um constante investimento no estudo de formas, economicamente viáveis, de obtenção de fontes renováveis de energia, com grande destaque para a produção de etanol. O aproveitamento da matéria vegetal desperta grande interesse dos pesquisadores, cientistas e industriais, devido ao fato da mesma ser encontrada em grandes quantidades em vários tipos de resíduos. Por exemplo, só no Brasil, anualmente, tem-se uma geração de 83.537 toneladas de cascas de banana que poderiam ser transformados em etanol. As bactérias alcoólicas da espécie Zymomonas mobilis apresentam atributos tecnológicos que potencializam o seu emprego na fermentação alcoólica. Entretanto, quando sacarose é empregada na fermentação, o rendimento do etanol diminui devido à formação de subprodutos, como levana. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da hidrólise ácida e enzimática de cascas de banana e das condições de fermentação para a produção de etanol e levana, pelo micro-organismo Z. mobilis CCT 4494. Foi avaliado o efeito das variações de pH inicial, temperatura, tempo de incubação e concentração do substrato adicionado aos meios de fermentação (meio sintético e meio com hidrolisado de cascas de banana). Aplicou-se a metodologia de superfície de resposta, seguindo um planejamento fatorial do tipo 2 4-1 , de acordo com o modelo proposto por Box e Hunter. As cascas de banana secas, submetidas à hidrólise ácida por 15 min a 120ºC, seguida de hidrólise enzimática realizada por 24 h, pH 5,5 e temperatura de 50ºC, resultaram em maior concentração de açúcares totais (72,8 mg/mL). A síntese de levana e etanol foi proporcional ao aumento da concentração de açucares totais presente nos meios fermentativos, favorecendo a produção destes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Many countries are considering reasonable and necessary in a short and medium term, a constant investment in the study of ways, economically viable, to obtain renewable energy sources, most notably for the ethanol production. The use of plant material attracts great interest from researchers, scientists and industrialists due to the fact that it is found in large quantities in various types of waste. For example, only in Brazil, annually, there is a generation of 83.537 tons of banana peels that could be converted into ethanol. The alcoholic bacteria of the species Zymomonas mobilis present technological attributes that enhance their use in alcoholic fermentation. However, when sucrose is used in the fermentation medium, ethanol yield decreases due to the formation of by-products such as levan. The objective of this work was to study the effect of the acid and enzymatic hydrolysis of banana peels and the fermentation conditions for the production of ethanol and levan by Z. mobilis CCT 4494. The effect of pH, temperature, time and substrate concentration added to the fermentation media (synthetic media and media containing banana peels hydrolyzate) was evaluated. The response surface methodology was employed, following a 2 4-1 factorial planning, according to the model proposed by Box and Hunter. The dried banana peels, subjected to acid hydrolysis by 15 min at 120°C and enzymatic hydrolysis performed for 24 h at pH 5.5 and 50°C showed better performance in total sugars (72,8 mg/mL). The synthesis of levan and ethanol was proportional to the increase in the total sugars concentration present in the fermentation media, and the production of these was favored in substrate concentration of 250 g/L. The highest yields of ethanol in the synthetic medium (90,2 mg/mL) and in the medium with banana peel... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Adriane Maria Ferreira Milagres / Banca: Heloisa Ferreira Alves do Prado / Resumo: A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é uma enzima microbiana que converte o amido em ciclodextrinas (CDs). Estes compostos são moléculas cíclicas, formadas por monômeros de D-glicoses unidas por ligações glicosídicas do tipo a-1,4. As CDs podem ser uma alternativa para controlar o escurecimento de batatas e frutas devido a sua capacidade de formar complexo de inclusão com substratos da reação de escurecimento. Alimentos contendo amido, quando adicionados da CGTase são também, potencialmente capazes de sofrer a ação da enzima formando CD localmente. Esse trabalho teve por finalidade estudar a aplicação direta da enzima CGTase em batatas e a aplicação de ciclodextrina comercial em batatas, maçãs, bananas e pêras visando controlar as reações de escurecimento enzimático ou não enzimático, destes alimentos. A formação de complexos com ciclodextrina foi determinada por calorimetria diferencial de varredura (DSC). Este trabalho mostrou pela primeira vez que tanto a CGTase produzida por Bacillus clausii E16 quanto a CGTase comercial (Toruzyme., Novozymes), foram capazes de controlar o escurecimento químico de batata e enzimático de batata e maçã. A utilização da CD mostrou efeito similar a ação das CGTases para batata e maçã, reduzindo dessa forma o escurecimento enzimático causado pela enzima polifenoloxidase. Pode-se inferir que ocorreu a produção da CD pela ação da CGTase em presença do substrato natural (amido de batata e maçã) e por conseqüência sua ação complexante junto aos agentes responsáveis pelo escurecimento, inibindo assim a efetivação das reações. Essa possível encapsulação foi demonstrada pela análise de DSC referente à diminuição do pico da amostra de batata tratada com CGTase. / Abstract: The cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is a microbial enzyme that converts starch to cyclodextrins (CDs). These compounds are cyclical molecules, formed by D-glucose monomers linked by a-1,4-glycosidic linkages type. The CDs can be an alternative to control the potato and fruits browning due its capacity to form complexes of inclusion with substrate of the browning reaction. Foods containing starch, when added of the CGTase are also potentially able to the action from the enzyme, then forming CD. This work had the purpose to study the direct application of the CGTase enzyme in potatoes and the commercial cyclodextrin application in potatoes, apples, bananas and pears aiming to control the browning enzymatic or no enzymatic reactions of these foods. The cyclodextrin complexes formation was determined by differential scanning calorimetry (DSC). This work showed for the first time that as the CGTase produced for Bacillus clausii E16 as the commercial CGTase (Toruzyme., Novozymes), were capable to control the chemical browning of potato and enzymatic browning of potato and apple. The use of the CD showed to similar effect to the action of CGTases for potato and apple, reducing in both the enzymatic browning caused by polyphenoloxidase enzyme. It can be concluded that the production of CD occurred by CGTase action in presence of the natural substrate (starch of potato and apple) and for consequence it’s action to form complexes next to the responsible agents for the browning, thus inhibiting effectively the reactions. This possible encapsulation was demonstrated by analysis of DSC referring to the reduction of the peak of the potato sample treated with CGTase. / Mestre

Resumo: A degradação da lignina ocorre através de um processo oxidativo que envolve enzimas extracelulares como as ligninases (MnP, LiP e lacase) produzidas, principalmente por fungos basidiomicetos. Os caminhos atuais da biotecnologia indicam que tais fungos denominados “de fungos de degradação branca” sejam eficientes na degradação de corantes sintéticos. Foram estudadas cinco linhagens de basidiomicetos quanto a produção das ligninases em de fermentação em estado sólido (FES). Todos os fungos analisados (Inonotus rickii, Dacryopinax elegans, Pycnoporus sanguineus, Chaetocalathus liliputianus e Lentinus strigellus) mostraram-se bons produtores de MnP. Nenhum dos microrganismos apresentaram níveis significantes de LiP. As espécies L. strigellus e P. sanguineus produziram quantidades consideráveis de lacase. Esses dois últimos fungos foram selecionados em função de sua capacidade de produção de MnP e lacase, e o farelo de trigo foi o melhor meio para a produção das duas enzimas. A MnP e lacase produzida tanto por L. strigellus quanto por P. sanguineus apresentaram pH ótimo ácido. A temperatura ótima para a MnP de ambos os fungos foi de 40°C. Para a lacase de L. strigellus a temperatura ótima ficou entre 50°C e 55°C, para a de P. sanguineus entre 60°C e 70°C. A MnP produzida pelos dois fungos mantiveram-se estável em toda a faixa de pH estudada. A lacase de L. strigellus apresentou estabilidade em pH 7,0 e a de P. sanguineus, 7,5. A temperatura de estabilidade para a MnP de L. strigellus ficou entre 15°C e 25°C e para a enzima de P. sanguineus entre 35°C e 45°C. Todos os corantes estudados sofreram descoloração por essas enzimas, especialmente o Laranja II (cerca de 74%), Azul Cibacron 3GA (cerca de 85%), Azul Brilhante Remazol R (cerca de 87%) e o Cristal Violeta (cerca de 65%) / Abstract: Lignin degradation occurs through an oxidative process that involves extracellular enzymes such as ligninases (MnP, Lip and laccase) produced specially by basidiomycete fungi. Current biotechnological studies indicate that these fungi, known as “white rot fungi”, may be efficient on the degradation of synthetic dyes. Five strains of basidiomycetes were studied regarding the production of ligninases through solid state fermentation (SSF). All of the fungi tested (Inonotus rickii, Dacryopinax elegans, Pycnoporus sanguineus, Chaetocalathus liliputianus e Lentinus strigellus), proved to be good MnP producers. None of the microorganisms produced significant amounts of LiP. The species L. strigellus e P. sanguineus produced considerable amounts of laccase. These last two were selected due to their ability to produce MnP and laccase, and wheat bran was the best medium for the production of both enzymes. .MnP and laccase from L. strigellus and P. sanguineus acted optimally in acid pH. Optimum temperature for MnP activity from both fungi was 40°C. Optimum temperature for laccase from L. strigellus was between 50°C e 55°C, and from P. sanguineus was between 60°C e 70°C. MnP from both fungi maintained stability through the whole pH range studied. Laccase from L. strigellus was stable in pH 7,0 and from P. sanguineus in pH 7,5. MnP from L. strigellus remained stable in temperatures between 15°C and 25°C and from P. sanguineus between 35°C e 45°C. The enzymes were effective in the decoloration of all the dyes tested, specially Orange II (approximately 74%), Cibacron Blue 3GA (approximately 85%), Remazol Brilliant Blue R (approximately 87%) and Crystal Violet (approximately 65%) / Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Maurício Boscolo / Banca: Valquíria Barco Damiano / Banca: Érika Barbosa Neves Graminha / Mestre

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Inês Conceição Roberto / Banca: Haghuvir Arni / Resumo: A glucoamilase é uma enzima importante na produção enzimática de xarope de glicose a partir do amido. Neste processo o amido é primeiramente dextrinizado pela ação da a-amilase a aproximadamente 100°C. Em seguida, a suspensão de dextrinas é resfriada a uma temperatura próxima de 55°C para a sacarificação, pela ação da glucoamilase. A característica de alta termoestabilidade para essa enzima é fundamental para agilizar o processo e reduzir custos operacionais. O presente estudo visou à obtenção, caracterização físico-química, bem como a cinética de termoinativação das glucoamilases mutantes de Aspergillus awamori expressa em Saccharomyces cerevisiae. O gene da glucoamilase sofreu alterações através da técnica de PCR mutagênico, e os clones expressando glucoamilases mais termoestáveis foram selecionados e avaliados. A glucoamilase selvagem apresentou temperatura ótima de atividade a 58°C, as enzimas mutantes apresentaram atividades ótimas a 68°C para a linhagem M1, e 65°C para a linhagem M2. As glucoamilases mutantes M1 e M2 também apresentaram maior termoestabilidade que a enzima selvagem. As temperaturas de desnaturação térmicas na ausência de substrato por 1 hora foram 45, 50 e 55°C para as enzimas, selvagem, M1 e M2, respectivamente. Todas as enzimas apresentaram atividade ótima no pH 3,5 - 4,0, sendo que os mutantes M1 e M2 também exibiram maior estabilidade à variação de pH, retendo acima de 80% da atividade na faixa de pH 5,5 a 10,0. A meia vida (t1/2) a 70°C foi de 8,1 minutos para a glucoamilase mutante M2, 3,8 minutos para o mutante M1 e 3 minutos para a glucoamilase selvagem. A termoinativação das enzimas seguiram uma cinética de primeira ordem. A energia de desnaturação foi de 262,8 e 252,9 KJ mol-1 para os mutantes M2 e M1 respectivamente, e de 234,3 KJ mol-1 para... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Glucoamylase is an important enzyme for the production of glucose syrup made from starch. In this process, starch is initially dextrinized by the action of a a-amylase at approximately 100ºC. Secondly, the dextrins suspension is cooled down to a temperature near 55ºC for the saccharification, by the action of an glucoamylase. High thermostability is a fundamental characteristic for this enzyme to accelerate the process and to reduce operational costs. This work had the purpose of studying physicochemical characteristics as well as thermoinactivation kinetics of mutants glucoamylases of Aspergillus awamori expressed in Saccharomyces cerevisiae. Glucoamylases gene was modified through mutagenic PCR technique and the clones which produced more thermostable glucoamylases were selected and evaluated. The wild glucoamilase exhibited optimum temperature at 58ºC, the mutants from strain M1 and M2 acted optimally at 68ºC and 65ºC, respectively. The mutants M1 and M2 also exhibited higher thermostability when compared to the wild enzyme. Thermic denaturation temperatures in the absence of substrate for 1 hour were 45, 50 and 55ºC for the wild, M1 and M2 enzymes, respectively. All enzymes showed optimum activity at pH 3.5 – 4.0, and the mutants M1 and M2 also exhibited higher stability towards pH variation, maintaining 80% of activity in pH from 5.5 to 10.0. Half life (t1/2) at 70ºC was 8.1 minutes for mutant M2, 3.8 minutes for mutant M1 and 3 minutes for wild glucoamylase. The enzymes thermoinactivation followed a first order kinetics. Denaturation energy was 262.8 and 252.9 KJ mol-1 for mutants M2 and M1 respectively, and 234.3 KJ mol-1 for the wild enzyme. Thermodynamic parameter of thermoinactivation, .G was lower for wild glucoamylase showing a higher denaturation for the enzyme. All enzymes revealed similar activity profile on different substrates, of which corn starch was the best substrate for hydrolysis for all glucoamylases tested. / Mestre