Orientador: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Daniela Alonso Bocchini Martins / Banca: José Roberto Ernandes / Banca: João Cláudio Thoméo / Banca: Patricia Gomes Cardoso / Resumo: A investigação biotecnológica acompanhada da aplicação das enzimas, combinada com o uso da engenharia genética tem sido realizada em micro-organismos para a produção de enzimas para fins industriais. Entre estas enzimas, as fitases microbianas, que catalisam a hidrólise do fitato (mio-inositol hexaquisfosfato) a mio-inositol e fosfato inorgânico, têm sido amplamente utilizadas na alimentação animal. Neste contexto, o fungo R. microsporus var. microsporus foi selecionado como bom produtor de fitases, com maiores níveis de produção encontrados na Fermentação por Biofilmes (FB) (261,30 U/mg), utilizando bagaço de cana de açúcar como fonte de carbono adicional. A morfologia do biofilme sobre suporte inerte foi analisada por MEV observando-se múltiplas hifas interligadas formando um conjunto ordenado na presença de inúmeros canais que permitem a troca eficiente de nutrientes e oxigenação. A fitase extracelular obtida foi purificada 4,18 vezes com recuperação de 4,78%, obtendo-se uma única banda de 34 kDa em SDS PAGE 12%. A temperatura ótima de atividade para a enzima purificada foi de 55ºC e o pH ótimo 4,5, sendo estável entre 30 °C e 40 °C por 120 min. Apresentou baixa estabilidade ao pH com atividade residual acima de 50% entre pH 3,0 e 5,0 por 60 min. A fitase foi ativada por íons Ca2+ e inibida por K+. A enzima foi capaz de hidrolisar fitato de sódio (Km de 0,72 mM e Vmax de 94,55 U/mg). O extrato bruto contendo fitase foi seco em Spray Dryer com diferentes adjuvantes (farelo de milho, farelo de soja, fubá, amido e maltodextrina). O farelo de soja possibilitou a maior recuperação da atividade fitásica (60%), assim como o fubá (59,5%). Considerando o uso destes dois adjuvantes, o pH ótimo de atividade para a fitase contida no extrato seco foi 4,5 e 8,5, respectivamente e a temperatura ótima de atividade de 45-50 °C. Quando utilizado fubá, a estabilidade foi mantida... / Abstract: Biotechnological research, and the application of enzymes in combination with the use of genetic engineering has been carried out in microorganisms for the production of enzymes for industrial purposes. Among these enzymes, microbial phytases, which catalyze the hydrolysis of phytate (myo-inositol hexakisphosphate) to myo-inositol and inorganic phosphate, have been widely used in animal feed. In this context, the fungus R. microsporus var. microsporus was selected as a good producer of the phytase with higher production levels when grown on Biofilm Fermentation (FB) (261,30 U/mg), using sugarcane bagasse as carbon additional source. The morphology of biofilms on inert support was examined by SEM observing interconnected hyphae forming an ordered array in the presence of many channels which enables efficient exchange of nutrients and oxygen. The extracellular phytase was purified 4.18 fold with 4.78% recovery. A single protein band was obtained in 6% PAGE and confirmed by 12% SDS-PAGE as a single protein band with 34 kDa. The optimum temperature for activity was 55 °C and the optimum pH 4.5. It was completely stable at temperatures between 30 °C and 40 °C for 120 min had low pH with a residual activity of over 50% between pH 3.0 and 5.0 for 60 min. The enzyme was activated by Ca2+ and inhibited by Zn2+. The enzyme was able to hydrolyze sodium phytate with a Km=0.72 mM, Vmax= 94.55 U/mg of protein. The crude extract containing phytase was dried using Spray Dryer with different adjuvants. Soybean meal and corn meal allowed the best recovery of phytase activity 60% and 59.5%, respectively. Considering the use of these two adjuvants, the optimum pH of activity for phytase in the dry extract was 4.5 and 8.5, respectively, and the optimum of temperature of 45-50 °C. When used corn meal, the stability was maintained above 90% at pH 2.5-10.0 for 60 min. The dry phytase (corn meal) was applied to the feed... / Doutor

Orientador: Valéria de Carvalho Santos Ebinuma / Coorientador: Ariela Veloso de Paula / Coorientador no exterior: Jose M. Palomo / Banca: Tales Alexandre da Costa e Silva / Banca: Marcdelo Chuei Matsudo / Banca: Fernando Masarin / Banca: Ana Lúcia Martiniano Nasser / Resumo: As lipases são enzimas amplamente aplicadas em processos industriais. Sua obtenção por fungos filamentosos apresenta algumas vantagens em relação às outras fontes e por isso estudos de incremento de sua produção vêm sendo realizados. Aliado ao processo de obtenção, técnicas de imobilização de enzimas podem melhorar sua estabilidade em relação à temperatura e pH, e diminuir custos associados à sua aplicação devido à possibilidade de reaproveitamento da enzima imobilizada nos processos biocatalíticos. Objetivo: este trabalho teve como objetivo estudar a produção de lipases pela cepa Aspergillus sp. DPUA 1727, a imobilização da referida enzima em suporte octil-sepharose, sua caracterização na forma livre e imobilizada e a aplicação da enzima imobilizada na obtenção de ésteres. Métodos: a produção da enzima foi realizada por 96 horas em cultivo submerso, avaliando-se diferentes fontes de carbono (óleos de soja, oliva, semente de uva e de algodão) como substratos indutores da produção enzimática. Posteriormente, estudou-se a imobilização da enzima em suporte octil-sepharose® por adsorção através de interação hidrofóbica, após o meio fermentado ter sido submetido à 4 ciclos de extração do óleo residual da fermentação com n-hexano. O processo de imobilização da enzima foi realizado em cascata em 4 ciclos com a finalidade de sobrecarga da enzima no suporte. Os testes de estabilidade foram feitos por 24 horas, nas temperaturas de 30 à 70ºC e pH de 3 a 9 com a enzima livre e imobilizad... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Lipases are enzymes widely applied in industrial processes. They can be obtained by filamentous fungi which presents some advantages in relation to other sources and for this reason, studies aiming to increase its production have been performed. Moreover, the process of enzyme immobilization can improve the enzyme stability in relation to temperature and pH, and reduce the costs associated with its application due to the possibility of immobilized enzyme reuse in biocatalytic processes. The objective of this work was to study the production of lipases by Aspergillus sp. DPUA 1727, the immobilization of lipases produced in octyl-sepharose support and make the enzyme characterization in its free and immobilized form. Furthermore, the immobilized enzyme was applied to obtain the ester isoamyl propionate. Methods: the enzyme production was carried out for 96 hours in submerged culture, with different carbon sources (soybean, olive, grape seed, and cotton oils) as substrates. Subsequently, the enzyme immobilization in octyl-sepharose® support by adsorption through hydrophobic interaction was studied ( to this experiment the fermented medium was submitted to 4 cycles to extract the residual oil with n-hexane). The enzyme immobilization process was carried out in cascade employing 4 cycles with the purpose of overloading the enzyme in the support. Stability studies were done for 24 hours, at temperatures from 30 to 70ºC and pH from 3 to 9 with the enzyme-free and immobilized. As the last step of this work, the immobilized enzyme was applied in the preparation of the ester isoamyl propionate. Results: In the production stage, the best condition to obtain the enzyme... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Maurício Boscolo / Coorientador: Roberto da Silva / Banca: Vanildo Del Bianchi / Banca: Milla Alves Baffi / Resumo: A aceitação de bebidas destiladas deriva principalmente de pequenas concentrações de numerosos compostos flavorizantes incluindo alcoóis superiores (óleo fúsel), ésteres, aldeídos, acetais, ácidos, cetonas, lactonas, fenóis voláteis, monoterpenos e norisoprenóides. Dentro deste contexto, para a melhora da qualidade da aguardente de cana-de-açúcar faz-se necessário pesquisas em aplicações tecnológicas e biotecnológicas que visem acentuar o sabor e o aroma, além do desenvolvimento de metodologias de analítica. Assim, neste trabalho foi analisado 21 variedades de cana-de-açúcar, sendo que na variedade SP813250 foi encontrado alta concentração do aldeído 2,6-decadienal, composto de aroma desagradável na produção de bebidas destiladas, e as variedades RB855536, RB987935 e RB975952 produziu grande diversidade e quantidade de voláteis favoráveis ao aroma de bebidas alcóolicas o que leva a inferir que estas variedades possam ser melhor indicadas para a produção de aguardente de cana e além disto, foi possível constatar que maior quantidade de voláteis foram obtidos na casca e nos nódulos da planta. Após a etapa de seleção variáveis para catálise enzimática foram indicadas pelo delineamento fatorial fracionado as seguintes condições: (i) o extrato do fungo Thermoascus aurantiacus, (ii) aplicação pós-fermentação alcoólica, (iii) Brix 16°, (iv) agitação de 200 rpm. Para a fase de otimização foram variados a concentração de extrato enzimático e tempo de aplicação assim, verificou-se aumento da concentração de terpenóides e norisoprenóides como limoneno, terpineol, isoeugenol, 4-alildimetoxibenzeno, α-ionona e linalol em função do tempo de hidrólise e da concentração de β-glicosidase. Nerolidol, 2,6,10,10-tetrametil-1-oxa-espiro-(4,5)-dec-6-eno e β-damascenona tiveram aumento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The acceptance of liquor derives primarily numerous small concentrations of flavor compounds including higher alcohols (fuel oil), esters, aldehydes, acetals, acids, ketones, lactones, phenols volatile monoterpenes and norisoprenóides. Within this context, to improve the quality of sugar cane-sugar is necessary technological research and biotechnological applications aimed accentuate the flavor and aroma, and the development of analytical methodologies. Thus, this study was analyzed 21 varieties of cane sugar, and the variety SP813250 found high concentration of aldehyde 2,6-decadienal, unpleasant aroma compound in the production of distilled spirits, and the varieties RB855536, RB987935 and RB975952 produced great diversity and quantity of volatile friendly aroma of alcohol which leads to the inference that these varieties may be better suited for the production of sugar cane and in addition, it was found that greater amounts of volatiles were obtained from the bark and nodules of the plant. After the selection stage variables for enzymatic catalysis are indicated by fractional factorial design with the following conditions: (i) the extract of the fungus Thermoascus aurantiacus, (ii) applying post-alcoholic fermentation, (iii) 16° Brix, (iv) stirring 200 rpm. For the optimization phase were varied concentration of enzyme extract and application time thus found to increase the concentration of norisoprenóides as limonene and terpenoid, terpineol, isoeugenol, 4-alildimetoxibenzeno, α-ionone and linalool as a function of hydrolysis time and the concentration of β-glucosidase. Nerolidol, 2,6,10,10-tetramethyl-1-oxa-spiro-(4,5)-dec-6-ene and β-damascenone concentration had increased proportionately enzymatic activity leading... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: Clicar acesso eletrônico abaixo / Abstract: Click electronic access below / Orientador: João Cláudio Thoméo / Coorientador: Eleni Gomes / Banca: Teresa Cristina Zangiorolami / Banca: Beatriz Vahan Kilikian / Banca: Roberta da Silva / Banca: Vanildo Luiz Del Bianchi / Doutor

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Heloiza Ferreira Alves do Prado / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Resumo: A ciclomaltodextrina glucanotransferase (EC 2.4.1.19) é uma enzima capaz de formar ciclodextrinas a partir do amido. As ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos, os quais os principais tipos são α-, β- e γ-CD, que apresentam 6, 7 e 8 unidades de glicose interligadas por ligações α-1,4. Duas bactérias alcalofílicas Bacillus sp subgrupo alcalophilus E16 e Paenibacillus campinasensis H69-3 foram estudadas por apresentarem boa produção de CGTase, ambas foram isoladas de amostras de solo. A atividade enzimática foi estudada utilizando os métodos já pré-determinados em estudos anteriores, como dextrinizante, CD-fenolftaleína e determinação de proteína. Para alcançar a purificação foram utilizados os processos de ultrafiltração e purificação por gel filtração em resina Sephadex G-75. A partir desses processos obteve-se resultados significativos, para o extrato purificado produzido por Bacillus sp subgrupo alcalophilus E16, obteve-se um fator de purificação de 35,4 vezes, um rendimento de 34.1 % e atividade específica de 13.10 U/mg, enquanto o extrato purificado de Paenibacillus campinasensis H69-3 resultou em um fator de purificação de 94.5 vezes, um rendimento de 33.2 % e a atividade específica de 23.64 U/mg. Foram feitos ensaios quanto a produção de ciclodextrinas utilizando o extrato bruto concentrado da CGTase por ultrafiltração produzida por Paenibacillus campinasensis H69-3, no perfil de hidrólise de diferentes amidos a 1.0%, a enzima atuou convertendo o amido em β-CD de melhor forma nos amidos de arroz e de mandioca, enquanto que na concentração de 2.5 % a melhor conversão se deu nos amidos de milho e mandioca. Quanto à dextrinização dos amidos, as concentrações de 1.0 % e 2.5 % apresentaram o mesmo perfil de hidrólise, sendo os amidos de mandioca, solúvel e batata apresentaram melhor conversão, quando comparadas aos amidos de arroz e milho. A dextrinização do amido foi mais efetiva na ... / Abstract: The cyclomaltodextrin glucanotransferase ( EC 2.4.1.19 ) is an enzyme able to form cyclodextrin from starch . Cyclodextrins are cyclic oligosaccharides , which are the main types α - , β - and γ - CD which have 6, 7 and 8 glucose units connected by α - 1, 4 bonds. Two bacterial alkalophilic Bacillus sp subgroup alcalophilus E16 and Paenibacillus campinasensis H69 -3 was studied due to their good CGTase production, both of which were isolated from soil samples. The enzymatic activity was studied using the methods already pre-determined in previous studies, as dextrinizante, CD-phenolphthalein and protein determination. To achieve the purification and ultrafiltration processes were used for purification gel filtration resin Sephadex G-75. From these processes significant results were obtained for the purified extract produced by Bacillus sp subgroup alcalophilus E16 gave a purification factor of 35.4 times, a yield of 34.1% and a specific activity of 13.10 U / mg , while the purified extract of Paenibacillus campinasensis H69-3 resulted in a purification factor of 94.5 times , a yield of 33.2 % and specific activity of 23.64 U / mg . Tests were made for the production of cyclodextrins using concentrated crude extract by ultrafiltration CGTase produced by Paenibacillus campinasensis H69 3, hydrolysis of starches from different profile than 1.0 % , the enzyme acted converting starch into β- CD best in rice starch and tapioca , whereas a concentration of 2.5 % and better conversion is given cassava and corn starch . As for dextrinizing the starch, the concentrations of 1.0% and 2.5% showed the same profile hydrolysis , and cassava starches , potato and soluble showed better conversion, when compared to starches of rice and corn. Dextrinisation of starch was more effective at 1.0% concentration , because practically all starch was hydrolyzed at a concentration of 2.5% was slower hydrolysis , for 24 hours, the starches in the study were ... / Mestre

LOBO, Marina Duarte Pinto. Caracterização bioquímica, biológica e estrutural de uma quitinase recombinante de chromobacterium violaceum. 2012. 155 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-20T13:15:13Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_mdplobo.pdf: 6869513 bytes, checksum: 8d02e390f0ef45b4615dca68d8af1c3c (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-26T19:58:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_mdplobo.pdf: 6869513 bytes, checksum: 8d02e390f0ef45b4615dca68d8af1c3c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T19:58:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_mdplobo.pdf: 6869513 bytes, checksum: 8d02e390f0ef45b4615dca68d8af1c3c (MD5) Previous issue date: 2012 / Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, saprophytic, non-pathogenic and free living bacterium. The complete sequencing of its genome has revealed many genes encoding products of biotechnological interest. Among these products are several chitinases. Chitinases, enzymes capable of degrading chitin, an insoluble polymer of β(1,4)-linked N-acetyl-β-D-glucosamine (GlcNAc), are of great biotechnological interest, because they can be used to convert chitin in useful derivatives as well as being exploited for the control of fungi and insects that cause damages in crops. This study aimed to carry out the biochemical, biological and structural characterization of a recombinant chitinase, belonging to family GH18, from C. violaceum ATCC 12472. The ORF CV2935 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vectors pET303/CT-His and pPICZαA, for expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. In both systems, the enzyme was secreted into the culture medium, in its soluble and functional form, and purified to homogeneity by affinity chromatography on a chitin matrix followed by size-exclusion chromatography on Superdex75 matrix. The yields of pure chitinase expressed in E. coli and P. pastoris were 2.6 and 44 mg per liter of culture, respectively. The recombinant chitinase produced in both microrganisms showed optimal activity at pH 3.0 and it was active after treated at temperatures up to 60 °C. The enzyme produced in P. pastoris (45 kDa) was N-glycosylated as revealed by Schiffʼs reagent and digestion with N-glycosidase F. Moreover, the glycosylated chitinase was found to be slightly more thermostable than the enzyme produced in E. coli (43 kDa). The rCV2935 showed hydrolytic activity against colloidal chitin, crab shell, and synthetic substrates containing p-nitrophenol. It was also able to hydrolyse glycol-chitin in SDS-PAGE and showed low chitosanase activity. The fluorescence spectra revealed that the proteins were produced in their folded conformation. The crystal structure of the recombinant chitinase produced in P. pastoris was determined by X-ray crystallography at a resolution of 2.1Ǻ. Its catalytic domain adopts an (β/α)8 triose-phosohate isomerase (TIM) barrel fold, and the residues essential for catalysis are conserved. The recombinant chitinase reduced the growth of the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani, and bioassays with cowpea weevil Callosobruchus maculatus showed that the rCV2935 possibly interfered with the insect feeding, which resulted in decreased weight of adults. The biochemical, biological and structural studies of rCV2935 may be useful for biotechnological application of this enzyme. / Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa, saprófita, não patogênica e de vida livre. O seqüenciamento completo do genoma dessa espécie revelou muitos genes codificando produtos com potenciais aplicações em diversas áreas. Dentre esses produtos, estão várias quitinases. Quitinases, enzimas capazes de degradar a quitina, um biopolímero de N-acetil-β-D-glucosamina bastante insolúvel, são de grande interesse biotecnológico, podendo ser utilizadas para converter quitina em derivados úteis, e também para o controle de fungos e insetos que causam danos em culturas agrícolas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar bioquímica, biológica e estruturalmente uma quitinase recombinante (CV2935), da família 18 das glicosídeo hidrolases, de C. violaceum ATCC 12472. A ORF codificando a proteína CV2935 foi amplificada por reação em cadeia da polimerase (PCR) e clonada nos vetores pET303/CT-His e pPICZαA, para expressão em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. Em ambos os sistemas, a enzima foi secretada para o meio de cultura, na sua forma solúvel e funcional, sendo purificada a homogeneidade por cromatografia de afinidade em matriz de quitina, seguida de cromatografia de exclusão molecular em matriz de Superdex75. Os rendimentos da quitinase pura, expressa em E. coli e P. pastoris, foram 2,6 e 44 mg por litro de cultura, respectivamente. A quitinase produzida em ambos os microorganismos mostrou atividade ótima em pH 3,0 e foi ativa quando tratada a temperaturas de até 60 °C. A enzima produzida em P. pastoris (45 kDa) foi N-glicosilada, como revelado por coramento com reagente de Schiff e digestão com N-glicosidase F, mostrando-se ligeiramente mais termoestável do que a enzima não glicosilada, produzida em E. coli (43 kDa). A rCV2935 apresentou atividade hidrolítica (endoquitinásica) frente a quitina coloidal, matriz de carapaça de caranguejo obtida comercialmente, glicol-quitina (em gel SDS-PAGE), substratos sintéticos solúveis contendo p-nitrofenol, além de apresentar pequena atividade quitosanásica. Os espectros de fluorescência revelaram que as proteínas foram produzidas na sua conformação enovelada. A enzima teve sua estrutura cristalográfica resolvida a uma resolução de 2.1Å e seu domínio catalítico apresentou um dobramento do tipo barril (β/α)8 (barril TIM) e resíduos essenciais para catálise conservados, características essas, comuns às proteínas da mesma família. A quitinase recombinante retardou o crescimento do fungo fitopatogênico Rhizoctonia solani, e, em bioensaios com o caruncho Callosobruchus maculatus, a rCV2935 possivelmente interferiu com a alimentação do inseto, o que acarretou na diminuição do peso dos mesmos. Os estudos bioquímicos, biológicos e estruturais da rCV2935 poderão ser úteis para aplicação biotecnológica dessa enzima.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-11-16T17:20:59Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 764514 bytes, checksum: aa9d645c1f4fe618a50dce6c80ef334e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-16T17:20:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 764514 bytes, checksum: aa9d645c1f4fe618a50dce6c80ef334e (MD5) Previous issue date: 2006-11-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A fosfatase alcalina (ALP) é uma enzima naturalmente presente no leite. Suas concentrações variam de acordo com a raça do animal, alimentação, período de lactação, produtividade e ao longo das estações do ano. A ALP é inativada pelas temperaturas de pasteurização, assim, a avaliação da atividade residual desta enzima é utilizada na indústria de laticínios para determinar a eficiência do tratamento térmico aplicado aos produtos lácteos. Todavia, trabalhos sobre a atividade desta enzima em manteiga são escassos, principalmente no Brasil, onde esta análise não é um procedimento obrigatório na avaliação da qualidade de manteiga, como ocorre nos Estados Unidos e em países da Europa. De acordo com a Food and Drug Administration (FDA), o limite máximo permitido de atividade residual da ALP em leite e produtos lácteos pasteurizados é de 350,0 mU/Kg de produto, pelo método fluorimétrico. Neste trabalho, os valores médios encontrados para a atividade desta enzima no creme cru padronizado (entre 40,0 e 41,0% de gordura) durante o verão, o outono e o inverno, pelo método fluorimétrico, foram de 17.264.214 + 2.554.645, 17.719.500 + 5.476.910 e 14.196.714 + 1.375.055 mU/L, respectivamente. Foram analisadas amostras de manteigas comerciais quanto às quantidades residuais da ALP, avaliou-se a sensibilidade e o limite de detecção do método rápido de Scharer, visual e espectrofotométrico, em comparação com o método fluorimétrico e modificou-se o método rápido de Scharer, obtendo-se uma nova metodologia, de alta sensibilidade e de custo mais acessível para determinação da atividade residual da ALP em manteiga. Dentre as vinte amostras de manteigas comerciais analisadas, quatro (20%) apresentaram resultado positivo para atividade residual da ALP, sendo duas da marca A e as outras duas das marcas B e E. Duas amostras da marca E apresentaram reativação da enzima, não confirmando assim o resultado positivo inicial. Para a avaliação da sensibilidade do método rápido de Scharer, manteigas foram fabricadas a partir de creme pasteurizado adicionado de quantidades de 0,000%; 0,010%; 0,015%; 0,025%; 0,050% e 0,100% (v/v) de creme cru. Por meio do método visual foi possível detectar apenas concentrações a partir de 0,050% de creme cru, não apresentando sensibilidade condizente com o método fluorimétrico. O método espectrofotométrico foi mais sensível, sendo capaz de detectar a concentração de creme cru correspondente ao limite estabelecido, mas que não correspondia à concentração de creme cru e à quantidade de fenol/g de amostra preconizadas por alguns autores como indicativos de pasteurização ineficiente (0,1% de contaminação com creme cru e 1,0 μg de fenol/g de amostra, respectivamente). O desenvolvimento da nova metodologia baseou-se na realização de modificações no método rápido de Scharer. Utilizou-se alíquotas de 0,5 mL de fase aquosa para a análise da atividade da ALP, em substituição à alíquota de 0,5 g de manteiga, utilizada no método convencional. A fase aquosa foi obtida a partir da fusão da manteiga a 45 oC e subseqüente centrifugação a 1200 x g por 10 minutos. Nas amostras avaliadas, foi possível distinguir visualmente as manteigas com atividade igual ou próxima a 350,0 mU/Kg (coloração esverdeada) das manteigas pasteurizadas (coloração amarela) e dos controles negativo e de interferentes. Na análise espectrofotométrica, obteve-se um valor médio para a atividade residual da ALP de 0,115 μg de fenol por amostra (0,5 g de manteiga) de manteiga, pelo método rápido de Scharer convencional e 0,385 μg de fenol por amostra (0,5 mL de fase aquosa), pelo novo método desenvolvido. Estes valores sugerem que a sensibilidade do método convencional foi aumentada em, aproximadamente, 3,3 vezes. O método modificado apresentou limite de detecção da atividade da ALP de acordo com os limites estabelecidos pela FDA, e constitui uma alternativa de custo mais acessível para a determinação de baixas concentrações residuais desta enzima em manteiga. / The alkaline phosphatase (ALP) is enzyme naturally present in the milk. It s concentration depends the animal breed, feed, period of lactation, yield, season the year. In this work, mediums values for the activity this enzyme in the padronized raw cream (40,0% to 41,0% of fat) during the summer, the fall and the winter using the fluorimetric was 17.264.214 + 2.554.645, 17.719.500 + 5.476.910 and 14.196.714 + 1.375.055 mU/L, respectively. The analyses of ALP is used in the dairy industry to determine efficient the pasteurization. However, scientific works about this enzyme in cream are scarce, mainly in Brazil, where his analyses isn t an obliged procedure for assessment the quality butter, how happen in another countries. According to Food and Drug Administration (FDA), the maximum residual of ALP in pasteurized milk and dairy products by the fluorimetric method must be below 350 mU/Kg. There have been analyzed residual ALP, the sensitivity and the limit of detection of commercial butter samples, by visual Scharer and spectrophotometric method to compared with fluorimetric method and new method with high sensitivity was developed and its cost is smaller for determination residual ALP butter. Of the 20 samples commercials butter four (20%) presented positive resulted residual ALP, two was brand A and another two is brand B and E. Two samples of brand E presented enzyme s reactivation, didn t have confirm the initial positive resulted. In the assessment of sensitivity method Scharer s rapid visual, butters were obtained by addition in different proportions: 0,000%; 0,010%; 0,015%; 0,025%; 0,050% and 0,100% (v/v) of raw cream. The visual method was able to detect only concentrations by addition 0,050% raw cream, doesn t presented sensitivity in accordance with method fluorimetric. The spectrophotometric method was more sensitive, because detect concentration of raw cream corresponding detection limit, but it doesn t corresponded the concentration of raw cream and magnitude phenol/g of sample recognized by several authors that indicated incorrectly pasteurized using this method (0,1% of contamination with raw cream and 1,0 μg phenol/g by sample, respectively). The development new method consists in modification in the fast method of Scharer. There have been used 0,5 ml of water phase for analyses ALP, in replacement to the aliquot 0,5 g butter, used in the conventional method. The water phase was obtained by butter fusion 45 °C and followed centrifugation 1200 x g for 10 minutes. In the six repetitions, was possible distinguish visually butter with equal activity or near a 350 mU/Kg ( limits butters ) by pasteurized butters and controls negative and interferents. In the analyses spectrophotometric, it got a value medium residual ALP 0, 115 μg phenol for sample (0,5g of butter), using the conventional method Scharer s rapid and 0,385 μg de phenol for sample (0,5 mL water phase), using the new method development. These values suggest sensitivity conventional method was increase approximately 3,3 times. The modified method presented limit detection of ALP in accordance with establishment FDA so it is an alternative with lower costs for detection the lower residuals levels this enzyme in butter. / Não foi localizado o cpf do autor.

Made available in DSpace on 2016-04-01T17:54:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-09. Added 1 bitstream(s) on 2016-04-01T18:00:30Z : No. of bitstreams: 1 000859578.pdf: 2407454 bytes, checksum: 8f8cd1ebd5ec7774fbfb7c2dd87ffc81 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Em conjunto com outras enzimas que degradam amido, as α-amilases e CGTases são incluídas na família 13 glicosilhidrolases caracterizada por uma conformação (α/β)8-barril. As amilases são grupo importante de enzimas industriais, representando cerca de 25% do mercado mundial de enzima.. Foram isoladas linhagens bacterianas de áreas do Cerrado que apresentaram alta produção de amilases em estudos anteriores. Devido ao interesse em ampliar os conhecimentos de α-amilases e CGTase com potencial de aplicação industrial, no presente trabalho, propôs-se realizar estudos de análises físico-químicas e do efeito da fonte de carbono, na produção de α-amilase das linhagens microbianas A-1.2 e A-18 e de CGTase produzida por Paenibacillus campinasensis H69-3 utilizando na fermentação submersa os amidos solúvel, trigo, milho, batata e mandioca; farelo de trigo e mandioca; Maizena e Arrozina como diferentes fontes de carbono alternativas Além disso, propôs-se aperfeiçoar os estudos de produção de amilases pela linhagem microbiana A-1.2 por meio da otimização dos constituintes nutricionais do meio de cultivo em que cada um dos ensaios do planejamento fatorial foi executado em triplicata e dessa forma, consideraram-se as médias dos resultados obtidos dessas repetições. Iniciar estudos de biologia molecular com a CGTase produzida por P. campinasensis H69-3 buscando estratégias para a clonagem e expressão da CGTase em hospedeiro heterólogo (Escherichia coli). As linhagens A-1.2 e A-18 tiveram as fontes de carbono amido solúvel, amido de mandioca, amido de milho e farelo de mandioca como os substratos que maximizaram a produção da enzima por ambas as linhagens, e o tempo de fermentação com maiores atividades foi entre 72 e 96 horas. O perfil de produção ao longo do tempo da CGTase de P. campinasensis H69-3 indicou o amido solúvel, amido de mandioca e a Maizena como as fontes de carbono que propiciaram as mais altas... / Together with other enzymes that degrade starch, α-amylases and CGTases are included in the family 13 glycosylhydrolases, characterized by a conformation (α/β)8-barrel. Amylases are an important group of industrial enzymes, accounting for approximately 25% of the world enzyme market. Bacterial strains from the Cerrado areas, which have shown a high production of amylase in the previous studies, have been isolated. Due to the interest in expanding the knowledge of α-amylase and CGTase with potential for industrial application, the present work proposes to conduct studies of physical and chemical analysis and the effect of carbon source on the production of α-amylase of A-1.2 and A-18 microbial strains, as well as CGTase produced by Paenibacillus campinasensis H69-3 in submerged fermentation using the soluble starch, wheat, corn, potato and cassava; wheat bran and cassava; Maizena and Arrozina like various alternative sources of carbon. Furthermore, it proposes enhancing the amylase study of the microbial strain A-1.2 by optimizing the nutritional components of the culture medium in which each of the factorial design experiments has been carried out in triplicate, and thus considering the average results of these repetitions. To initiate molecular biology studies with CGTase produced by P. campinasensis H69-3 searching strategies for the cloning and expression of the CGTase in a heterologous harbourer (E. coli). The A-1.2 and A-18 strains were the carbon sources of soluble, cassava and corn starch, and cassava bran as the substrate that maximized the enzyme production by both strains. And the fermentation time with higher levels of activity was between 72 and 96 hours. The production profile over the CGTase P. campinasensis H69-3 time has indicated the soluble and cassava starch and Maizena as carbon source that provided the highest enzymatic activities. The 72 hours period of time has been more appropriate in enzymatic tests, ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-26Bitstream added on 2014-06-13T20:02:38Z : No. of bitstreams: 1 umszaguez_ma_dr_sjrp.pdf: 902792 bytes, checksum: b0f717f2c2e97d5d325e55a97eb71c85 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Clicar acesso eletrônico abaixo / Click electronic access below

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-24Bitstream added on 2014-08-27T15:57:05Z : No. of bitstreams: 1 000778079.pdf: 2078209 bytes, checksum: f253bd93ea489feb471ed9cad8e18c13 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A conversão enzimática dos polissacarídeos da biomassa é um fator chave no desenvolvimento de bioetanol de segunda geração. A recalcitrância da lignocelulose para a degradação enzimática e o custo elevado de enzimas hidrolíticas necessárias para a despolimerização de polissacarídeos encontrados na parede celular da planta são barreiras significativas para a produção em larga escala e para a comercialização de biocombustíveis e bioprodutos derivados da biomassa vegetal. A fim de aumentar rapidamente a produção de biocombustíveis celulósicos e bioprodutos, existe a necessidade de desenvolver coquetéis enzimáticos mais eficientes e de menor custo para a conversão de biomassa em açúcares fermentáveis. Nesse contexto, o estudo de enzimas degradadoras da parede celular é essencial. No presente trabalho a enzima endo-1,4-?-D-glucanase de Aspergillus terreus (ATEG_09894) foi clonada para expressão em A. nidulans. O teste de expressão mostrou a expressão solúvel da proteína. Sua identidade foi confirmada por espectrometria de massas. O pH ótimo e a temperatura ótima para sua atividade enzimática foram de 5,0 e 55ºC, respectivamente. A desnaturação térmica mostrou que a partir de 60ºC a enzima começa a perder estrutura. Interessantemente a enzima apresenta atividades ?-glucanase e xiloglucanase, tendo preferência por ?-glucano. A caracterização estrutural mostrou que ATEG_09894 foi expressa corretamente e os resultados de SEC e SAXS mostram que a proteína é monomérica em solução e o modelo de sua estrutura tridimensional indica que a superfície eletrostática da molécula contribui para um monômero estável. Os dados apresentados nesse trabalho são importantes pois identificam peculiaridades da enzima ATEG_09894, que atua na degradação da biomassa, sugerem os determinantes de sua seletividade enzimática e apresenta a degradação, não usual, de ?-glucanos... / The enzymatic conversion of polysaccharides from biomass is a key factor in the development of second generation bioethanol. The recalcitrance of lignocellulose to enzymatic degradation and the high cost of hydrolytic enzymes necessary for the depolymerization of polysaccharides found in plant cell wall are significant barriers to large-scale production and commercialization of biofuels and bioproducts derived from plant biomass. In order to rapidly increase the production of biofuel and byproducts cellulosic, a need exists to develop more efficient and lower cost enzymatic cocktails for the conversion of biomass into fermentable sugars. In this context, the study of cell wall degrading enzymes is essential. In this work the enzyme endo-1,4-?-D-glucanase from Aspergillus terreus (ATEG_09894) was cloned for expression in A. nidulans. The expression test showed the expression of a soluble protein. Its identity was confirmed by mass spectrometry. The optimum pH and optimum temperature for the enzyme activity were 5.0 and 55 ºC, respectively. The thermal denaturation showed that above 60 ºC the enzyme starts to lose structure. Interestingly, the enzyme has ?-glucanase and xiloglucanase activities, preferring ?-glucan. Structural characterization showed that ATEG_09894 was expressed correctly folded and the results of SEC and SAXS show that the protein is monomeric in solution and the model of its three dimensional structure indicates that the electrostatic surface molecule contributes to a stable monomer. The data presented in this study are important because they identify peculiarities of ATEG_09894, which acts in the degradation of biomass, suggest the determinants of its selectivity and enzymatic degradation presents, unusual, of ?-glucans and xyloglucans, promising feature for degradation of lignocellulosic material