Introdução: Os ependimomas são tumores gliais raros e compreendem o terceiro tumor do sistema nervoso central mais frequente na infância. Apesar dos avanços terapêuticos, cerca de 50% dos pacientes desenvolvem recidiva local e 40% dos pacientes vão ao óbito. Uma das causas do insucesso das terapias é a alta heterogeneidade do tumor e a inconsistência do diagnóstico histológico. Em 2015, foi publicada pela primeira vez a caracterização molecular de ependimomas, sendo descrito nove subgrupos tumorais com perfis clínicos, demográficos e moleculares distintos. Objetivo: Estabelecer e padronizar a classificação molecular em amostras de ependimomas pediátricos e correlacionar a classificação com dados clínicos dos pacientes. Casuística e Métodos: Foram estudados 65 casos de ependimomas, diagnosticados no período entre 2001 a 2016 e provenientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e de São Paulo e do Centro Infantil Boldrini-Campinas. Vinte e seis casos eram ependimomas supratentoriais, classificados com base na presença de fusões gênicas C11orf95-RELA, YAP1-MAMLD1 e YAP1-FAM118B utilizando RT-PCR seguida por sequenciamento de Sanger. Trinta e nove casos de fossa posterior foram classificados em Grupos A, B ou não A e B através do perfil de expressão proteica e gênica dos marcadores: LAMA2, NELL2 e TNC utilizando imuno-histoquímica e PCR quantitativo em tempo real, respectivamente. Resultados: Dentre os ependimomas supratentoriais foram identificadas três amostras primárias e cinco amostras recidivadas com presença de fusão RELA, média de idade de 7 anos (variação de 2,6-13,7 anos), predominância do sexo masculino e grau de ressecção cirúrgica completa. Já a fusão YAP1- MAMLD1 foi identificada em quatro casos, diagnosticados em crianças mais novas, média de idade de 0,9 anos (variação de 0,75-2 anos). Adicionalmente, foi encontrado um caso variante em ependimoma supratentorial, denominado fusão C11orf95-LOC-RELA. Dentre os casos de ependimoma de fossa posterior, foram identificadas 26 amostras primárias e sete recidivas sugestivas de pertencerem ao Grupo A (LAMA2+/ NELL2 -) e seis amostras do Grupo não-A e não-B (LAMA2 +/ NELL2 + e LAMA2 -/NELL2-). Entre os pacientes considerados Grupo A, 90% (24/28) apresentaram marcação positiva para TNC, indicando serem tumores de pior prognóstico. A expressão gênica de LAMA2 e NELL2 apresentou correlação negativa e os genes TNC e LAMA2 uma correlação positiva, p<0,01 e p<0,05, respectivamente. Em ependimoma de fossa posterior Grupo A, os pacientes submetidos às ressecções completa e incompleta apresentaram diferença significativa na sobrevida global (5 anos) de 71,2% ± 14,5% versus 21,4% ± 17,8%, p< 0,01 e na SLE (2 anos) 63,5% ± 14,8% versus 25% ± 15.3%, p <0.001. Conclusões: De acordo com os resultados obtidos foi possível estabelecer a classificação molecular em uma casuística brasileira, seguindo os padrões descritos na literatura. Dados gerados a partir dessa padronização serão de fundamental importância para melhoria da estratificação tumoral, contribuindo tanto para determinação de estratégicas terapêuticas subgrupo-específicas, quanto na busca de novos alvos terapêuticos. / Introduction: Ependymomas are rare glial cell-derived tumors and comprise the third most frequent central nervous system tumor in childhood. Despite the therapeutic advances, about 50% of patients develop local recurrence and 40% of patients go to death. One of the causes of the failure of the therapies is the high tumor heterogeneity and the inconsistency of the histological diagnosis. In 2015, the molecular characterization of ependymomas was published for the first time, and nine tumor subgroups with distinct clinical, demographic and molecular profiles were described. Aim: To establish and standardize molecular classification in pediatric ependymoma samples and to correlate the classification with clinical data of the patients. Methods: We studied 65 cases of ependymomas, diagnosed between 2001 and 2016, from the Clinics Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto and São Paulo and the Boldrini Children\'s Center-Campinas. Twenty-six cases were supratentorial ependymomas, classified based on the presence of gene fusions C11orf95- RELA, YAP1-MAMLD1 and YAP1-FAM118B using RT-PCR followed by Sanger sequencing. Thirty-nine posterior fossa cases were classified into Groups A, B or non A and B through the protein and gene expression profile of the markers: LAMA2, NELL2 and TNC using immunohistochemistry and quantitative real-time PCR, respectively. Results: Among the supratentorial ependymomas, three primary samples and five relapsed samples with RELA fusion, mean age of 7 years (range of 2.6-13.7 years), male predominance, and degree of complete surgical resection were identified. The YAP1-MAMLD1 fusion was identified in four cases, diagnosed in younger children, mean age 0.9 years (range of 0.75-2 years). In addition, a variant case was found in supratentorial ependymoma, called fusion C11orf95- LOC-RELA. Twenty-six primary samples and seven recurrences suggestive of Group A (LAMA2 + / NELL2-) and six non-A and non-B Group samples (LAMA2 + / NELL2 + and LAMA2 - / NELL2-). Among the patients considered Group A, 90% (24/28) presented positive staining for TNC, indicating that tumors had a worse prognosis. The gene expression of LAMA2 and NELL2 presented negative correlation and the TNC and LAMA2 genes had a positive correlation, p <0.01 and p <0.05, respectively. In the group A posterior fossa ependymoma, patients submitted to complete and incomplete surgical presented a significant difference in overall survival (5 years) of 71.2% ± 14.5% versus 21.4% ± 17.8%, p <0 , 01 and in SLE (2 years) 63.5% ± 14.8% versus 25% ± 15.3%, p <0.001. Conclusions: According to the results obtained, it was possible to establish the molecular classification in a Brazilian cohort, following the standards described in the literature. Data generated from this standardization will be of fundamental importance for the improvement of tumor stratification, contributing both to the determination of subgroup-specific therapeutic strategies and to the search for new therapeutic targets.

Orientador: Helder Tedeschi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T14:04:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_MarcosJulianodos_M.pdf: 1157265 bytes, checksum: d4e3bca14a9db06599e52397627cd980 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os ependimomas intramedulares são tumores de crescimento lento que acarretam déficits neurológicos progressivos e pode levar os pacientes a dependência funcional. Embora a remoção microcirúrgica seja o tratamento de escolha para a lesão, questionamento existe sobre se pacientes com apenas sinais clínicos leves devem ser submetidos a ressecções cirúrgicas radicais. Este estudo avaliou, segundo a escala funcional de McCormick, a evolução pós-operatória de uma série de vinte pacientes submetidos à ressecção microcirúrgica total para ependimomas intramedulares. A ressecção completa foi atingida em 19 dos 20 pacientes (95%), somente 1 paciente apresentou piora clínica (5%). Nos pacientes com independência funcional pré-operatória, com McCormick grau I e II, não houve piora clínica e todos os tumores foram ressecados completamente. No subgrupo de pacientes grau II, a média do status funcional pós-operatória apresentou melhora estatisticamente significativa. Nenhum paciente com grau IV melhorou após o tratamento cirúrgico. O tratamento cirúrgico foi eficaz para ressecar completamente os tumores sem agregar déficits neurológicos na maioria dos pacientes. Nos pacientes com McCormick graus I e II pré-operatório a cirurgia deve ser indicada no momento do diagnóstico / Abstract: Intramedullary ependymomas are slow-growing lesions that progressively lead to neurological compromise and functional dependence. Although surgical excision is the treatment of choice for such lesions, there is questioning as to whether patients with only subtle clinical findings should be subjected to radical surgical resections. This study has evaluated according to the McCormick functional scale the surgical outcome of a series of twenty patients with intramedullary ependymomas submitted to microsurgical resection. Total surgical resection was achieved in 19 of the 20 patients (95%). Only one patient experienced clinical worsening (5%). Patients classified as McCormick grade I and II who were independent pre-operatively remained so in the post-operative period and had their tumors completely removed. In grade II patients there was a significant improvement in their post-operative status. None of the grade IV patients improved after surgical treatment. Surgical treatment has proven to be efficient in completely removing tumors without adding neurological deficits in most patients. In patients McCormick grades I and II pre-operatively surgery should be indicated early in the diagnosis / Mestrado / Neurologia / Mestre em Ciências Médicas

Ependimomas são tumores gliais raros. Podem ser encontrados em qualquer localização do sistema nervoso central e, apesar de histologia similar, parecem apresentar alterações genômicas distintas. As variáveis clínicas são intercorrelacionadas e, geralmente, incapazes de predizer o curso da doença. O objetivo do presente estudo foi analisar a expressão aumentada de genes e proteínas em ependimomas e correlacionar com dados clínicos dos pacientes. Foram estudados casos de pacientes com ependimoma submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo, no período entre 1996 e 2011 (33 amostras de tecido congelado para análise de expressão gênica por PCR quantitativo em tempo real e 149 amostras com tecido incluído em parafina, correspondentes a 121 casos devido a recidivas, para análise de proteína por imuno-histoquímica de tissue microarrays). As reações de imuno-histoquímica foram analisadas semiquantitativamente e graduadas com um índice de marcação calculado pelo produto da porcentagem de núcleos marcados pela intensidade de marcação. Oitenta e um casos eram adultos (média de 27,2 anos). Havia 60 casos intracranianos e 61 intramedulares, dos quais 10 eram mixopapilares, 92 grau II e 19 grau III. Ressecção completa foi possível em 62% dos casos e recidiva foi confirmada em 41,1%. Observou-se menor tempo para recidiva em crianças e tumores intracranianos, supratentoriais (p < 0,001 em ambos), histologia anaplásica e ressecções incompletas (p < 0,05 em ambos). Os seguintes genes foram selecionados em dados públicos de SAGE e literatura: ARMC3, CCND1, CHST5, DNALI1, FGFRL1, GNA13, IGF2, MSX1, NOTCH1 e RSPH3. ARMC3, RSHL3, CHST5 e DNALI1 apresentaram maiores níveis de expressão em ependimomas intramedulares (p < 0,05), e FGFRL1, NOTCH1 e CCND1 nos casos supratentoriais (p < 0,01). IGF2 apresentou maiores níveis de expressão em crianças e CHST5 em adultos (p < 0,05 em ambos). Foram observados maiores níveis de expressão de FGFRL1 (p < 0,05), CCND1 e IGF2 (p < 0,01 em ambos) em casos com histologia anaplásica. Nenhum dos genes analisados apresentou impacto no tempo livre de progressão ou na sobrevida. A expressão da proteína codificada por CCND1, ciclina D1, também foi avaliada por imuno-histoquímica, por ser uma proteína com expressão aumentada em diversos tipos de neoplasias e não ter ainda um valor prognóstico bem estabelecido em ependimomas. Houve correlação entre expressão de ciclina D1 a nível de mRNA e da proteína (p < 0,0001). As correlações entre ciclina D1 e histologia anaplásica e localização supratentorial foram confirmadas pela análise proteica (p < 0,0001 em ambos). Adicionalmente, foi também observada maior expressão de ciclina D1 em pacientes mais jovens (p < 0,01). A maior expressão de ciclina D1 em tumores com localização supratentorial foi independente do grau histológico e da idade do paciente. Recidiva foi mais frequente em casos com maiores níveis de expressão de ciclina D1 (p < 0,05), embora uma maior correlação com tempo livre de progressão foi observada apenas em casos com ressecção completa (p < 0,001). Os ependimomas apresentaram expressão gênica diferencial de acordo com idade, localização do tumor e grau histológico nesse estudo. A determinação dos níveis da expressão de ciclina D1 pode ser útil para guiar o seguimento e tratamento dos casos supratentoriais com ressecções completas / Ependymomas are rare glial cell-derived tumors. They can be found in any central nervous system localization and despite the histological similarity, they seem to display distinct genomic abnormalities. Clinical variables are intercorrelated and they are usually unable to predict the disease course. We aimed to analyze increased gene and protein expression in ependymomas and to correlate with patients\' clinical data. We studied patients with ependymoma submitted to surgical resections at Hospital das Clinicas, University of São Paulo, from 1996 to 2011 (33 fresh-frozen samples for gene expression analysis by quantitative real-time PCR and 149 formalin-fixed, paraffin-embedded samples, relative to 121 patients due to relapses, for protein analysis by tissue microarray immunohistochemistry). Immunohistochemical reactions were analyzed semi-quantitatively and scored with a labeling index (LI) calculated as the product of the percentage of the positively stained nuclei by the intensity of staining. Eighty-one cases were adults (mean 27.2 years). There were 60 intracranial and 61 spinal cases, of which 10 tumors were myxopapillary, 92 were grade II and 19 were grade III. Gross total resection was achieved in 62% of cases and relapse was confirmed in 41.4% of cases. We observed a shorther time to relapse in children and supratentorial intracranial tumor localization (p<0.001 for both), anaplastic histology and incomplete resections (p<0.05 for both). The following genes were selected based on public SAGE database and literature: ARMC3, CCND1, CHST5, DNALI1, FGFRL1, GNA13, IGF2, MSX1, NOTCH1 and RSPH3. ARMC3, RSHL3, CHST5 and DNALI1 presented higher expression levels in intramedullary ependymomas (p < 0.05) and FGFRL1, NOTCH1 and CCND1 in supratentorial cases (p < 0.01). IGF2 presented higher expression levels in pediatric cases and CHST5 in adults cases (p < 0.05 in both). Higher expression levels of FGFRLI1 (p < 0.05), CCND1 and IGF2 (p < 0.01 for both) were observed in anaplastic histology cases. None of the genes impacted in progression free survival or overall survival of patients. The expression of protein codified by CCND1, cyclin D1, was also evaluated by immunohistochemistry, because its overexpression has been related with several types of neoplasias and its prognostic value has not yet been fully established in ependymomas. There was a correlation of cyclin D1 expression at mRNA and protein levels (p < 0.0001). Correlations between cyclin D1 and anaplastic histology and supratentorial localization were confirmed by protein analyses (p < 0.0001 for both parameters). Additionally, high expression of cyclin D1 was observed in younger patients (p < 0.01). The higher cyclin D1 expression in supratentorial tumor localization was independent of histological grade and age of patient. Relapse was more frequent in cases with higher cyclin D1 expression levels (p < 0.05) although correlation with progression free survival was just observed in gross total resection cases (p < 0.001). Ependymomas presented differential gene expression according to age, tumor localization and histological grade in our study. Determination of cyclin D1 expression levels may be useful to guide follow-up and treatment in supratentorial cases with gross total resection

Ependimomas são tumores gliais raros. Podem ser encontrados em qualquer localização do sistema nervoso central e, apesar de histologia similar, parecem apresentar alterações genômicas distintas. As variáveis clínicas são intercorrelacionadas e, geralmente, incapazes de predizer o curso da doença. O objetivo do presente estudo foi analisar a expressão aumentada de genes e proteínas em ependimomas e correlacionar com dados clínicos dos pacientes. Foram estudados casos de pacientes com ependimoma submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo, no período entre 1996 e 2011 (33 amostras de tecido congelado para análise de expressão gênica por PCR quantitativo em tempo real e 149 amostras com tecido incluído em parafina, correspondentes a 121 casos devido a recidivas, para análise de proteína por imuno-histoquímica de tissue microarrays). As reações de imuno-histoquímica foram analisadas semiquantitativamente e graduadas com um índice de marcação calculado pelo produto da porcentagem de núcleos marcados pela intensidade de marcação. Oitenta e um casos eram adultos (média de 27,2 anos). Havia 60 casos intracranianos e 61 intramedulares, dos quais 10 eram mixopapilares, 92 grau II e 19 grau III. Ressecção completa foi possível em 62% dos casos e recidiva foi confirmada em 41,1%. Observou-se menor tempo para recidiva em crianças e tumores intracranianos, supratentoriais (p < 0,001 em ambos), histologia anaplásica e ressecções incompletas (p < 0,05 em ambos). Os seguintes genes foram selecionados em dados públicos de SAGE e literatura: ARMC3, CCND1, CHST5, DNALI1, FGFRL1, GNA13, IGF2, MSX1, NOTCH1 e RSPH3. ARMC3, RSHL3, CHST5 e DNALI1 apresentaram maiores níveis de expressão em ependimomas intramedulares (p < 0,05), e FGFRL1, NOTCH1 e CCND1 nos casos supratentoriais (p < 0,01). IGF2 apresentou maiores níveis de expressão em crianças e CHST5 em adultos (p < 0,05 em ambos). Foram observados maiores níveis de expressão de FGFRL1 (p < 0,05), CCND1 e IGF2 (p < 0,01 em ambos) em casos com histologia anaplásica. Nenhum dos genes analisados apresentou impacto no tempo livre de progressão ou na sobrevida. A expressão da proteína codificada por CCND1, ciclina D1, também foi avaliada por imuno-histoquímica, por ser uma proteína com expressão aumentada em diversos tipos de neoplasias e não ter ainda um valor prognóstico bem estabelecido em ependimomas. Houve correlação entre expressão de ciclina D1 a nível de mRNA e da proteína (p < 0,0001). As correlações entre ciclina D1 e histologia anaplásica e localização supratentorial foram confirmadas pela análise proteica (p < 0,0001 em ambos). Adicionalmente, foi também observada maior expressão de ciclina D1 em pacientes mais jovens (p < 0,01). A maior expressão de ciclina D1 em tumores com localização supratentorial foi independente do grau histológico e da idade do paciente. Recidiva foi mais frequente em casos com maiores níveis de expressão de ciclina D1 (p < 0,05), embora uma maior correlação com tempo livre de progressão foi observada apenas em casos com ressecção completa (p < 0,001). Os ependimomas apresentaram expressão gênica diferencial de acordo com idade, localização do tumor e grau histológico nesse estudo. A determinação dos níveis da expressão de ciclina D1 pode ser útil para guiar o seguimento e tratamento dos casos supratentoriais com ressecções completas / Ependymomas are rare glial cell-derived tumors. They can be found in any central nervous system localization and despite the histological similarity, they seem to display distinct genomic abnormalities. Clinical variables are intercorrelated and they are usually unable to predict the disease course. We aimed to analyze increased gene and protein expression in ependymomas and to correlate with patients\' clinical data. We studied patients with ependymoma submitted to surgical resections at Hospital das Clinicas, University of São Paulo, from 1996 to 2011 (33 fresh-frozen samples for gene expression analysis by quantitative real-time PCR and 149 formalin-fixed, paraffin-embedded samples, relative to 121 patients due to relapses, for protein analysis by tissue microarray immunohistochemistry). Immunohistochemical reactions were analyzed semi-quantitatively and scored with a labeling index (LI) calculated as the product of the percentage of the positively stained nuclei by the intensity of staining. Eighty-one cases were adults (mean 27.2 years). There were 60 intracranial and 61 spinal cases, of which 10 tumors were myxopapillary, 92 were grade II and 19 were grade III. Gross total resection was achieved in 62% of cases and relapse was confirmed in 41.4% of cases. We observed a shorther time to relapse in children and supratentorial intracranial tumor localization (p<0.001 for both), anaplastic histology and incomplete resections (p<0.05 for both). The following genes were selected based on public SAGE database and literature: ARMC3, CCND1, CHST5, DNALI1, FGFRL1, GNA13, IGF2, MSX1, NOTCH1 and RSPH3. ARMC3, RSHL3, CHST5 and DNALI1 presented higher expression levels in intramedullary ependymomas (p < 0.05) and FGFRL1, NOTCH1 and CCND1 in supratentorial cases (p < 0.01). IGF2 presented higher expression levels in pediatric cases and CHST5 in adults cases (p < 0.05 in both). Higher expression levels of FGFRLI1 (p < 0.05), CCND1 and IGF2 (p < 0.01 for both) were observed in anaplastic histology cases. None of the genes impacted in progression free survival or overall survival of patients. The expression of protein codified by CCND1, cyclin D1, was also evaluated by immunohistochemistry, because its overexpression has been related with several types of neoplasias and its prognostic value has not yet been fully established in ependymomas. There was a correlation of cyclin D1 expression at mRNA and protein levels (p < 0.0001). Correlations between cyclin D1 and anaplastic histology and supratentorial localization were confirmed by protein analyses (p < 0.0001 for both parameters). Additionally, high expression of cyclin D1 was observed in younger patients (p < 0.01). The higher cyclin D1 expression in supratentorial tumor localization was independent of histological grade and age of patient. Relapse was more frequent in cases with higher cyclin D1 expression levels (p < 0.05) although correlation with progression free survival was just observed in gross total resection cases (p < 0.001). Ependymomas presented differential gene expression according to age, tumor localization and histological grade in our study. Determination of cyclin D1 expression levels may be useful to guide follow-up and treatment in supratentorial cases with gross total resection