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Produção e avaliação da proteína derivada (PPD) de Burkholderia mallei para o diagnóstico imuno-alérgico do mormo em equídeos

SILVA, Karla Patrícia Chaves da 13 July 2010 (has links)
Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-13T16:32:06Z No. of bitstreams: 1 Karla Patricia Chaves da Silva.pdf: 1396251 bytes, checksum: 8552def0e4e6ca947fd2a699f600a245 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-13T16:32:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karla Patricia Chaves da Silva.pdf: 1396251 bytes, checksum: 8552def0e4e6ca947fd2a699f600a245 (MD5) Previous issue date: 2010-07-13 / The objective this study produce and evaluate PPD-mallein with potential for application in the diagnosis of glanders from of the the production and purification of immunogenic proteins of B. mallei isolates from equines with glanders in Brazil. Were isolated and characterized phenotypically and by detecting the activity of proteases, polyphenol oxidases, esterases and determination of the resistance profile in vitro. Samples of B. mallei studied were susceptible to antimicrobial gentamicin, ciprofloxacin, norfloxacin, doxycycline and enrofloxacin and resistant to trimethoprim / sulfamethoxazole, amoxicillin and ampicillin. Was observed the activity of proteases, absence esterases polyphenyloxidase and bacterial growth resulted in toxic metabolites. For the production and purification of the protein partially mallein were used two strains of B. mallei Brazilian already characterized phenotypically and genotypically. Was inoculated broth samples Dorset-Henley to metabolize and get the bacterial proteins. Proteins were separated and precipitated with trichloroacetic acid and ammonium sulphate. The PPD-mallein were concentrated at 1.0 mg / mL and evaluation in guinea pigs previously sensitized with bacter were effective for identifying infection in animals truly positive and exclude the animals truly negative. Histological analysis of the application site of mallein revealed the development of Type IV hypersensitivity. Was evaluated the PPD-mallein about their power in five asinines with clinical signs, with bacteriological diagnosis and positive serology for glanders and five asinines negative in serology and bacteriology. The animals were tested according to the criteria established by paragraph IN nº24 regarding the diagnosis of glanders. After 48 hours of inoculation, there was swelling in the area of injection, presence of ocular discharge and tearing confirming the diagnosis of glanders. The other seronegative animals showed no inflammatory reaction at the site of inoculation of PPD-mallein. This immunogen produced and being tested in Brazil was effective being a new possibility for diagnosis and control of glanders in this country. / Objetivou-se nesse estudo produzir e avaliar PPD-maleína com potencial para aplicação no diagnóstico do mormo a partir da purificação de proteínas imunogênicas de Burkholderia. mallei isoladas de equídeos com mormo no Brasil. As bactérias foram isoladas e caracterizadas fenotipicamente por meio da detecção da atividade de proteases, polifenoloxidases e esterases, além da determinação do perfil de resistência à antimicrobianos in vitro. Para produção e purificação parcial da maleína foram utilizadas duas estirpes de B. mallei brasileiras fenotípica e genotipicamente caracterizadas. Inoculou-se as amostras em caldo Dorset-Henley para metabolizar e obter as proteínas bacterianas. As proteínas foram separadas e precipitadas com ácido tricloroacético e sulfato de amônia. As PPDs maleína foram concentradas em 1,0mg/mL e na avaliação realizada em cobaios previamente sensibilizados com a bactéria foram eficazes na identificação dos animais verdadeiros positivos e na exclusão dos verdadeiros negativos. Avaliou-se a PPD-maleína quanto a sua potência em cinco asininos com sinais clínicos e diagnóstico bacteriológico e sorológico positivo para o mormo e em cinco asininos negativos na sorologia e bacteriologia. As amostras de B. mallei estudadas foram sensíveis à gentamicina, ciprofloxacina, norfloxacina, doxiciclina e enrofloxacina, e resistentes a trimetoprim/sulfametoxazol, amoxacilina e ampicilina. Observou-se a atividade de proteases, ausência de esterases e polifenoloxidades e o crescimento bacteriano em meio de cultura resultou em metabólitos tóxicos. A análise histológica do local de aplicação da maleína, em cobaias, revelou o desenvolvimento de hipersensibilidade do tipo IV. Os asininos foram testados de acordo com os critérios estabelecidos pela IN nº24 do Ministério de Agricultura Pecuária e Abastecimento referente ao diagnóstico do mormo. Após 48 horas da inoculação, observou-se edema na área da injeção, presença de secreção ocular e lacrimejamento, confirmando-se o diagnóstico do mormo. Os outros animais sorologicamente negativos não apresentaram reação inflamatória no local de inoculação da PPD-maleína. Esse imunógeno produzido e em fase de teste no Brasil é uma nova alternativa para o diagnóstico e controle do mormo no país.
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Produção da proteína P26 do vírus da anemia infecciosa eqüina em levedura Pichia pastoris

COUTINHO, Luciana Cavalcanti de Arruda 22 February 2011 (has links)
Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-14T17:39:52Z No. of bitstreams: 1 Luciana Cavalcanti Arruda Coutinho.pdf: 1249795 bytes, checksum: d8c5b0923169bdb4b101bcf96c920d9f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-14T17:39:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana Cavalcanti Arruda Coutinho.pdf: 1249795 bytes, checksum: d8c5b0923169bdb4b101bcf96c920d9f (MD5) Previous issue date: 2011-02-22 / Equine Infectious Anemia (EIA) is an important lentivirose in horses, characterized by a chronic and degenerative profile, causing many economic losses. It is considered that animals exposed to the virus and underwent serological evidence, when considered positive, remain so throughout life, which justifies the great concern and disease surveillance. The aim of this study was to use Pichia pastoris yeast cells for protein production of p26 gag region of Equine Infectious Anemia Virus (EIAV) for diagnostic purposes. The p26 gene of EIAV was optimized through the codon usage strategy to be expressed in cells of the Pichia pastoris yeast. The insert was cloned into pPICZαA expression vector after appropriate enzymatic digestion. P. pastoris transformed with the construction pPICZαAp26 were induced to express the p26 recombinant protein under the regulation of AOX1 promoter by adding methanol to the culture medium. The p26 recombinant protein was identified by RT-PCR and Dot blotting assay using anti-His antibody. Further studies are needed to optimize bioprocesses involved in this system in order to obtain a stable, purified and useful antigen for diagnostic purposes. / A Anemia Infecciosa Equina (AIE) é uma importante lentivirose em equídeos, caracterizada por causar um quadro crônico e degenerativo, trazendo muitos prejuízos econômicos. Considera-se que animais expostos aos vírus e submetidos à prova sorológica, quando considerados positivos, assim permanecerão por toda vida, fato que justifica a grande preocupação e vigilância da doença. Neste trabalho objetivou-se utilizar células da levedura Pichia pastoris para produção da proteína p26 da região gag do vírus da anemia infecciosa equina (VAIE) para fins de diagnóstico. O gene da proteína p26 do VAIE foi sintetizado e otimizado por meio da utilização de códons preferenciais para ser expresso em célula da levedura Pichia pastoris. O inserto foi subclonado em vetor de expressão pPICZαA após digestão enzimática apropriada. Células de P. pastoris transformadas com a construção pPICZαAp26 foram induzidas a expressarem a proteína recombinante p26 sob regulação do promotor AOX1 através da adição de metanol ao meio de cultura. A análise quanto à produção da proteína recombinante e sua identificação foram realizadas através de RT-PCR e Dot blotting utilizando anticorpo anti-His.
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Pesquisa de aglutininas anti Leptospira spp em equinos na região da zona da mata e ilha de Fernando de Noronha no estado de Pernambuco

SOUZA, Natália Matos 20 February 2012 (has links)
Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-20T16:38:14Z No. of bitstreams: 1 Natalia Matos Souza.pdf: 205714 bytes, checksum: 59b167a505e1216282eec9736dde0f7d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T16:38:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Natalia Matos Souza.pdf: 205714 bytes, checksum: 59b167a505e1216282eec9736dde0f7d (MD5) Previous issue date: 2012-02-20 / This study was aimed to research Leptospira spp agglutinins in horses in the region of the forest area and Fernando de Noronha island in the state of Pernambuco; identifying highest areas of leptospirosis incidence; identifying the serovars that occur more frequently in the studied areas; relating clinical signs with the agglutinins presence in blood serum of equines; observing the reproductive disorders connection with the agglutinins presence in the equines blood serum; relating the presence of rodents and seropositive animals; observing the occurrence of anti leptospiras antibodies at different age groups. It was collected blood from 328 equines of both genders, aging beyound 6 months. After material centrifugation the serum was analyzed by LANAGRO/PE through the microscopic agglutination test. Of the 328 collected samples were found 84 reagents animals in the microscopic agglutination test for leptospirosis. Among which 12 (1.5%) foals, 20 (25.64%) young, 42 (31.11%) adults and 10 (28.57%) senile. Of the 84 reagents animals 69.04% (58) are female and 30.95% (26) are male; 3.75% (3) are Campolina, 2,3% (2) are mestizos, 37,71% (30) are of the breed Quarter horse and 58,33% (49) are Mangalarga Marchador. Among the studied counties Aldeia stood out to present the highest percentage of reagent animals with 32,31% (65) subsequently Pombos with 28,2% (22), Palmares with 23,81% (5), Bonanza with 22,36% (17), Paudalho with 22% (11) and finally Escada with 14,3%(4). The only studied county that did not present any reagent animal was Itambé. Among the 27 researched serovars by the microscopic seroagglutination test for Leptospirosis diagnostic, 10 were found in reagent animals, which, in order of occurrence Icterohaemorrhagiae (58), Shermani (26), Panama (15), Copenhageni (10), Batavie (3), Hardjo (2), Australis (1), Pyrogenes (1), Cynopteri (1) e Canicola (1). In this study 3 of 16 analyzed samples, 10 were considered reagent and 6 were considered non-reagent. 62,5% of samples were positives to the serovar Icterohaemorrhagiae, 37,7% were considered positive to serovar Copenhageni. Realizing this study it’s possible to conclude that leptospirosis in equines occurs in endemic way at the studied area, considering that of 328 analyzed samples 84 (25,62%) were positives to the test. The presence of rodents was very important to the appearance of condition as proved how it was related in all visited property. From this study it was possiblited trace an epidemiologic profile of the leptospirosis in equines belonging to Zona da Mata and Fernando de Noronha island of the state of Pernambuco. Knowing the risk factors involving this condition and which may be useful to treat and prevent, however it’s still needed a extensive study to determinate the reason of the occurrence of certain serovars in some studied regions. / Objetivou-se com esse trabalho realizar uma pesquisa de aglutininas anti Leptospira spp em equinos na região da zona da mata e ilha de Fernando de Noronha no Estado de Pernambuco; identificar áreas de maior ocorrência da leptospirose; identificar os sorovares que ocorrem com maior frequência nas áreas estudadas; relacionar os sinais clínicos com a presença de aglutininas no soro sanguíneo dos equinos; relacionar a presença de roedores com a presença de animais soropositivos; observar a ocorrência de anticorpos anti leptospiras nas diferentes faixas etárias. Coletou-se sangue de 328 equinos de ambos os sexos, com idade a partir dos seis meses. Após centrifugação do sangue o soro foi analisado pelo teste de soro aglutinação microscópica, com ponto de corte na diluição de 1:100. Das 328 amostras examinadas constatou-se que 84 (25,6%) animais foram reagentes para aglutinação anti-Leptospira spp. Dentre os quais 12 (1,5%) potros, 20 (25,64%) jovens, 42 (31,11%) adultos e 10 (28,57%) senis. Dos 84 animais reagentes 69,04% (58) são fêmeas e 30,95% (26) são machos; 3,57% (3) são da raça Campolina, 2,3% (2) são mestiços, 35,71% (30) são da raça Quarto de Milha e 58,33% (49) são da Raça Mangalarga Marchador. Dentre as regiões estudadas Aldeia se destacou por apresentar o maior percentual de animais reagentes, com 32,31% (65), em seguida Pombos com 28,2% (22), Palmares com 23,81% (5), Bonanza 22,36% (17), Paudalho 22% (11) e por fim, Escada com 14,3% (4). Dentre os 27 sorovares pesquisados 10 foram mais prevalentes, em ordem de maior ocorrência, Icterohaemorrhagiae (58), Shermani (26), Panama (15), Copenhageni (10), Batavie (3), Hardjo (2), Australis (1), Pyrogenes (1), Cynopteri (1) e Canicola (1). Na ilha de Fernando de Noronha das 16 amostras analisadas 10 foram consideradas reagentes e 6 foram consideradas não reagentes. Considerando os sorovares mais prevalentes 62,5% das amostras foram positivas para o sorovar Icterohaemorrhagiae, 37,5% foram positivas para o sorovar Copenhageni. Com a realização desse estudo foi possível concluir que a leptospirose na espécie equina ocorre de forma endêmica nas áreas estudadas. Acredita-se que a presença de roedores foi importante no aparecimento da afecção haja vista que foi relatada sua presença em todas as propriedades visitadas, todavia necessita-se de maiores estudos para verificar a participação destes animais na transmissão da leptospirose aos equinos. A partir desse trabalho pode-se traçar um perfil soro epidemiológico da leptospirose em equinos na Zona da Mata e na ilha de Fernando de Noronha no Estado de Pernambuco, que pode ser útil para realização de tratamento e da prevenção desta enfermidade, todavia, ainda é preciso estudos mais aprofundados para determinarmos o porque da ocorrência de determinados sorovares em algumas regiões estudadas.

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