En este trabajo se abordaron estudios sobre el metabolismo del Fe y su desregulación, centralizados en la identificación y caracterización funcional de proteínas como Hepcidina, Ferroportina (FPN) y Eritropoyetina (Epo) en tejidos que forman parte del ciclo del Fe. Para el desarrollo de esta Tesis, se diseñaron y desarrollaron Modelos Animales de disfunción para reproducir situaciones fisiopatológicas específicas que comprometen el eritrón y la biodisponibilidad del Fe. Para el estudio de FPN y prohepcidina se utilizaron los siguientes modelos: anemia post-esplenectomía, anemia hemolítica aguda, hipoxia normobárica, sobrecarga de Fe, inflamación y un modelo acoplado, donde coexistieron dos situaciones disfuncionales específicas: exceso de Fe seguido hipoxia. En todos los casos, se aplicó un diseño experimental, metodoló-gico y estadístico adecuado. Los estudios realizados en alta demanda como en la anemia hemolítica, mostraron cambios adaptativos en FPN revelando su localización intracelular y su redistribución a la membrana para exportar Fe. En hipoxia, los cambios en la expresión de FPN y su localización en membrana respondieron a la demanda de Fe eritropoyética y su relación directa con Epo reflejó la ausencia de inhibición de hepcidina. En exceso de Fe, la regulación negativa de hepcidina sobre FPN se evidencia por la disminución en su expresión en el SRE y en duodeno. La coexistencia de estímulos antagónicos como exceso de Fe e hipoxia, permitieron analizar las interacciones específicas entre hepcidina-FPN-Epo y la coordinación de señales para la expresión simultánea de hepcidina y Epo: la señal Fe", predominó sobre hepcidina e indujo disminución de FPN en el SRE y en riñón; la señal hipoxia predominó sobre Epo y modificó la expresión de FPN duodenal. Los estudios de inflamación aguda (Turpentina) mostraron síntesis de prohepci-dina y degradación de FPN en el SRE reflejando que la señal regulatoria fue hepcidina. En duodeno FPN fue estimulada por la hipoferremia. En la inflamación inducida con Brucella abortus en ratones WT y KO para hepcidina, se observó que la respuesta de FPN duodenal a la inflamación aguda depende-ría del Fe, y en inflamación crónica, respondería a hepci-dina. En el SRE la regulación de FPN en inflamación aguda y crónica no dependería sólo de hepcidina. Los ensayos de inflamación en macrófagos medulares con ligandos de recep-tores tipo Toll-like (TLRs), mostraron regulación dual de FPN vía TLR-2, 4,5 y vía hepcidina de origen autocrino. / This work was based on different studies concerning iron metabolism and its deregulation which were focused on the identification and functional characterization of proteins such as Hepcidin, Ferroportin (FPN), and Erythropoietin (Epo) present in tissues involved in the iron cycle. For the deve-lopment of this Thesis, we designed and developed Dysfunctional Animal Models to reproduce specific physio-pathological situations that compromise the erythron and iron availability. To study FPN and prohepcidin we used the follo-wing models: Post-splenectomy anemia, acute hemolytic anemia, normobaric hypoxia, iron overload, inflammation, and a coupled model, where two specific and dysfunctional situations coexisted, i.e, iron overload followed by hypoxia. In all cases, a proper experimental, statistical and methodology design was applied. Studies in high demands such as hemolytic anemia showed adaptative changes in FPN, exhibiting its intracellular localization and redistribution to the membrane for iron exportation. In hypoxia, changes in FPN expression and its membrane localization responded to erythropoietic iron demand, and its direct relation with Epo showed the absence of hepcidin inhibition. In iron overload, the negative regulation of hepcidin on FPN can be seen by its decrease in the RES and duodenum. The coexistence of opposite stimuli such as iron overload and hypoxia allowed us to analyze the specific interactions between hepcidin-FPN-Epo and signal coordination for the simultaneous expression of hepcidin and Epo: Hepcidin depends on "iron" signal, causing a decrease in FPN in the RES and in kidney; Epo depends on "hypoxia" signal and changed the expression of duodenal FPN. Studies of acute inflammation (Turpentine) demons-trated prohepcidin synthesis and FPN degradation in the RES, showing that the regulatory signal was "hepcidin." Duodenal FPN was induced by "hypoferremia." In B. abortus induced inflammation in WT and KO mice it was observed that duodenal FPN response to acute inflammation would depend on "iron," and in chronic inflammation, it would respond to "hepcidin. FPN regulation in RES in acute and chronic inflammation would depend not only on hepcidin. Inflammation tests in bone marrow macrophages with ligands of Toll-like receptors (TLRs) showed dual FPN regulation by TLR-2, 4, 5, and by autocrine derived hepcidin.

PROPÓSITO: Determinar y comparar la concentración de somatostatina (SST) intravítrea en pacientes con edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética proliferativa (RDP), enfermedad oclusiva venosa retiniana (OVR) y pacientes controles. Determinar y comparar la concentración de eritropoyetina (EPO) intravítrea en pacientes con EMD, RDP, OVR y pacientes controles.MATERIAL Y MÉTODOS: Se obtuvieron muestras vítreas, séricas y plasmáticas de pacientes con edema macular secundario a OVR, EMD, RDP, membrana epiretiniana, agujero macular y desprendimiento regmatógeno retiniana (controles). La EPO y la SST se midieron por radioinmnoensayo. RESULTADOS: No se encontraron diferencias entre los grupos en la concentración de EPO sérica (Concentración sérica: OVR: 8.9 mU/mL [7-20.8]; EMD: 12.4 mU/mL[7.8-46.7]; RDP: 9,33 mU/mL [3-16]; controls: 8.6 mU/mL [4.1-19], P=ns). No se encontraron diferencias en la concentración de EPO intravítrea ajustada entre pacientes con OVR y controles (OVR: 69 mU/mL [27-800] vs. controles: 50 mU/mL [13-107], P=0,095). No se hallaron diferencias entre la concentración intravítrea de EPO entre los pacientes con RDP y EMD (RDP: 528,74 mU/mL [156-1859] vs. EMD: 578,63 mU/mL [41-2780], P=0,833). La concentración intravítrea de EPO ajustada fue superior en los pacientes con EMD y RDP que en los pacientes con OVR y controles y las diferencias fueron estadisticamente significativas (P<0,05). No se encontraron diferencias en la concentración de SST intravítrea ajustada entre pacientes con OVR y controles (OVR: 715,8 pg/mL [49-1367] vs. controles: 735,26 pg/mL [102-2024] P=0,973). No se encontraron diferencias en la concentración intravítrea de SST ajustada entre pacientes con RDP y EMD ( RDP: 119,59 pg/mL [14-377] vs. EMD: 88,97 pg/mL [21-232]P=0,601). La concentración intravítrea de SST fue significativamente superior en los pacientes con OVR y controles con respecto a los pacientes con EMD y RDP (p<0,05).CONCLUSIONES: En los pacientes con EMD y RDP encontramos una disminución en la concentración de SST intravítrea que no encontramos en los pacientes con OVR. La EPO intravítrea se encontró aumentada en los pacientes con EMD y RDP pero no en los pacientes con OVR. La SST y la EPO demostraron tener una implicación patogénica en el EMD y en la RDP cosa que no ocurrió en el EM secundario a OVR. / PURPOSE: To determine the levels of somatostatin (SST) and Erythropoietin (EPO) in the vitreous fluid of patients with diabetic macular edema (DME), proliferative diabetic retinopathy (PDR), macular edema secondary to retinal vein occlusion (RVO) and controls subjects.METHODS: Vitreous, serum and plasma samples were obtained from patients with macular edema secondary to RVO, DME, PDR, idiopathic epiretinal membrane, macular hole and rhegmatogenous retinal detachment (controls). EPO and SST were measured by radioimmunoassay (RIA).RESULTS: No differences were found between the groups in serum EPO levels. (Serum concentrations: RVO: 8.9 mU/mL [7-20.8]; DME: 12.4 mU/mL[7.8-46.7]; PDR: 9,33 mU/mL [3-16]; controls: 8.6 mU/mL [4.1-19], P=ns). No differences were found in intravitreal EPO levels between patients with RVO and controls. (Intravitreal concentrations: RVO: 69 mU/mL [27-800] vs. controls: 50 mU/mL [13-107], P=0,095). No differences were found in intravitreal EPO levels between patients with RDP and DME (Intravitreal concentrations: DPR: 528,74 mU/mL [156-1859] vs. DME: 578,63 mU/mL [41-2780], P=0,833). Intravitreal EPO concentration was significantly higher in patients with DME and RDP than in patients with RVO or controls (P<0,05). No differences were found in intravitreal SST levels between patients with RVO and controls (Intravitreal concentrations: RVO: 715,8 pg/mL [49-1367] vs. controls: 735,26 pg/mL [102-2024] P=0,973). No differences were found in intravitreal SST levels between patients with PDR and DME (Intravitreal concentrations: PDR: 119,59 pg/mL [14-377] vs. EMD: 88,97 pg/mL [21-232]P=0,601).Intravitreal SST concentration was significantly higher in patients with RVO and controls than in patients with DME and PDR (p<0,05).CONCLUSIONS: Intravitreal SST levels are elevated in patients with macular edema secondary to RVO and control subjects compared to patients with DME and PDR. Intravitreal EPO levels are not elevated in patients with macular edema secondary to RVO compared to control subjects whereas patients with DME and PDR have high levels of this factor in the vitreous. These results suggest that EPO and SST could be involved in the pathogenesis of diabetic retinopathy but not in macular edema secondary to RVO.

Las hormonas recombinantes eritropoyetina (EPO) y hormona de crecimiento (GH), prácticamente iguales a las endógenas y de corta vida media en circulación, son de difícil detección directa en el control antidopaje. Se determinaron los valores poblacionales de los biomarcadores indirectos EPO, receptor soluble de la transferrina, insulin-like growth factor-I (IGF-I) y procolágeno tipo III péptido (P-III-P), en poblaciones seleccionadas de deportistas, y el efecto del ejercicio y los distintos tipos de entrenamiento sobre su concentración sérica. La comparación de resultados obtenidos mediante distintos ensayos demostró la necesidad de una validación exhaustiva previa a su utilización. A excepción del P-III-P, los biomarcadores séricos propuestos para la detección de rhEPO y rhGH no se encuentran directamente afectados por el nivel atlético, el ejercicio o la distinta carga de entrenamiento realizada a lo largo de la temporada deportiva. La edad es la principal influencia sobre las concentraciones séricas de IGF-I y P-III-P. / Direct detection of recombinant peptidic hormones erythropoietin (EPO) and growth hormone (GH), very similar to endogen molecules and with a short half life in blood, is difficult in antidoping control. The main objective of this work is to determine indirect biomarkers' values of EPO, soluble transferrin receptor, insulin-like growth factor-I (IGF-I) and procollagen type III peptide (P-III-P), in selected populations of athletes, and the effect of exercise and different types of training on their concentration in serum. The comparison of results obtained by the different assays showed the need of extensive validation of the analytical techniques before their use in the antidoping field. Excepting P-III-P, proposed biomarkers for the detection of rhEPO and rhGH abuse are not directly influenced by the athletic level, exercise or different training workload along the sport season. Age is the main factor affecting IGF-I and P-III-P concentrations in serum.