Le feu bactérien des Maloideae est provoqué par Erwinia amylovora, gamma-protéobactérie dont le pouvoir pathogène repose un système de sécrétion de type trois (T3SS). Des travaux antérieurs ont révélés que des mutants hrp de régulation de ce système (hrpL, hrpS), avirulents, sont capables de protéger la plante d'une infection par la souche sauvage. Nous avons d'abord voulu savoir si la protection est due à une induction de défenses chez la plante. L'étude de l'expression de gènes de défense dépendants des voies de l'acide salicylique, de l'acide jasmonique, de l'éthylène et des phénylpropanoïdes montre qu'aucune de ces voies n'est particulièrement induite par les mutants de régulation. Puis après avoir écarté l'hypothèse d'un effet direct des mutants sur la souche sauvage, nous avons recherché des différences au niveau protéique et surtout transcriptomique entre ces bactéries par des démarches avec et sans a priori (gènes-cibles vs cDNAAFLP). Les résultats montrent que HrpS et HrpL sont capables de réguler différentiellement d'autres gènes que les gènes hrp : HrpL régule négativement les gènes flagellaires, le chimiotactisme et un gène du GSP, et positivement un gène du T1SS et une OMP ; HrpS régule négativement le quorum sensing et positivement un gène potentiellement impliqué dans la synthèse de l'éthylène. Nous avons particulièrement approfondi le système flagellaire d'E. amylovora. Une analyse bioinformatique a révélé que cette bactérie possède deux systèmes flagellaires, secrétant deux flagellines distinctes (32 vs 50 KDa). La flagelline de 32 KDa, réprimée par HrpL, ne joue pas de rôle majeur dans la protection et ne possède pas l'épitope flg22 impliqué dans l'immunité des plantes. Si notre travail n'élucide pas complètement l'origine de la protection conférée par les mutants de régulation, il apporte des informations nouvelles sur E. amylovora et sur la régulation de certains de ses gènes au cours de l'interaction avec son hôte.

El fuego bacteriano, causado por Erwinia amylovora, es una enfermedad muy importante a nivel comercial y económico porque afecta a plantas de la familia de las rosáceas y es especialmente agresiva en manzano (Pyrus malus) y peral (Pyrus communis), así como en plantas ornamentales (Crataegus, Cotoneaster o Pyracantha). Esta enfermedad está distribuida por todo el mundo en zonas climáticas templadas de Amércia del Norte, Nueva Zelanda, Japón, Israel, Turquí y Europa. En España, el fuego bacteriano fue detectado por primera vez en 1995 en el norte del País (Euskadi) y más tarde en nuevos focos aparecidos en otras áreas. La enfermedad puede ser controlada comercialmente mediante la aplicación de pesticidas quimicos (derivados de cobre, antibioticos). Sin embargo, muchos de los productos químicos presentan baja actividad o causan fitotoxicidad, y la estreptomicina, el producto más eficaz, esta prohibido en muchos países, incluyendo España. Por tanto, en ausencia de apropiados agentes químicos, el control biológico se contempla como una buena alternativa. En el presente trabajo, un agente de control biológico, Pseudomonas fluorescens EPS62e, ha sido seleccionada de entre 600 aislados de las especies P. fluorescens y Pantoea agglomerans obtenidos de flores, frutos y hojas de plantas de la familia de las rosáceas durante una prospección llevada a cabo en varias áreas geográficas de España. La cepa ha sido seleccionada por su capacidad de suprimir la infecciones producidas por E. amylovora frutos inmaduros, flores y brotes de peral en condiciones de ambiente controlado, presentando unos niveles de control similares a los obtenidos mediante el control químico usando derivados de cobre o antibióticos. La cepa además ha mostrado la capacidad de colonizar y sobrevivir en flores y heridas producidas en frutos inmaduros en condiciones de ambiento controlado pero también en flores en condiciones de campo. La exclusión de E. amylovora medinate la colonización de la superficie, el consumo de nutrientes, y la interacción entre las células del patógeno y del agente de biocontrol es la principal causa de la inhibición del fuego bacteriano por la cepa EPS62e. Estas características constituyen aspectos interesantes para un desarrollo efectivo de la cepa EPS62e como un agente de biocontrol del fuego bacteriano en condiciones comerciales. / Fire blight, caused by Erwinia amylovora is a serious disease of rosaceous plants with great commercial and economic interest that is distributed over the world. Disease may be controlled commercially by the application of chemicals (copper compounds, antibiotics). Many chemical agents have low activity or cause phytotoxicity, and streptomycin, the most effective antibiotic, is not approved for use in many countries, including Spain. Therefore, in the absence of suitable chemical control agents, biological control could provide a useful alternative. In the present work, a biological control agent, Pseudomonas fluorescens EPS62e, has been selected among 600 isolates of P. fluorescens and Pantoea agglomerans obtained from flowers, fruits and leaves of rosaceous plants in a survey performed through several geographic areas of Spain. This strain has been selected for its capacity to suppress immature fruit, blossom and shoot infections caused by E. amylovora, under controlled environment conditions, providing control levels similar to chemical control with copper or antibiotic compounds. The strain has also shown the capacity to colonize and survive well in flowers and wounds on immature fruit under controlled environment conditions but also in flowers under natural conditions. Pre-emptive exclusion of the pathogen E. amylovora by surface colonization and nutrients depletion, and cell-to-cell interaction appear to be the main mechanisms of biocontrol. These characteristics constitute interesting traits for an effective development as a fire blight biological control agent under commercial conditions.

Pseudomonas fluorescens EPS62e es va seleccionar com a agent de biocontrol del foc bacterià per la seva eficàcia en el control de Erwinia amylovora. En aquest treball es van desenvolupar mètodes de traçabilitat que van permetre la seva detecció específica i quantificació. Mitjançant les tècniques RAPD i U-PCR es van obtenir fragments d'amplificació diferencial per EPS62e que es van seqüenciar i caracteritzar com marcadors SCAR per dissenyar una PCR en temps real. La PCR a temps real es va utilitzar simultàniament amb mètodes microbiològics per estudiar l'adaptabilitat epifítica de EPS62e en pomera i perera. L'ús combinat de mètodes microbiològics i moleculars va permetre la identificació de tres estats fisiològics de EPS62e: la colonització activa, l'entrada en un estat de viable però no cultivable, i la mort cel·lular. Aquest treball mostra que EPS62e està ben adaptada a la colonització de flors a camp, encoratjant la seva utilització dins d'una estratègia de control biològic contra el foc bacterià. / Pseudomonas fluorescens EPS62e was selected as a reliable biological control agent of fire blight for its high efficacy controlling Erwinia amylovora infections. In the present work, monitoring methods which allowed EPS62e specific detection and quantification were developed. RAPD and U-PCR fingerprints were used to obtain differential amplified fragments from EPS62e that were sequence characterized as SCAR markers. A real-time PCR was developed on the basis of the strain-specific SCAR markers, and was used simultaneously with microbiological methods to study the environmental fate of EPS62e in apple and pear orchards. The combined use of both microbiological and molecular methods permitted the identification of three physiological states for EPS62e, which consisted of active colonization, survival and entry into a viable but nonculturable state, and cell death. The present work shows that EPS62e is well adapted for blossom colonisation in the field, and encourages its utilisation in a fire blight.

Currently there is no control of bacterial wilt disease, Erwinia tracheiphila, in susceptible cucurbit crops, once infection of the plant occurs. Conventional and organic production systems rely on insecticide applications to kill the vectors, striped and spotted cucumber beetles, Acalymma vittatum and Diabrotica undecimpunctata, respectively, prior to transmission of the pathogen which indirectly controls the disease to some extent. Physical barriers such as row covers are used to exclude the vectors from plants prior to flowering; however, pollination requirements expose plants to potential infection. Experimental field plots were developed to test various enhanced organic production systems in an effort to increase productivity of the "Athena" variety cantaloupe melon crop, Cucumis melo, which is highly susceptible to bacterial wilt infection. The rotations included enhanced duration row cover applications as well as season long covering of the crop and application of bumble bee hives for pollination. The most successful enhanced production method included the removal of row covers and application of organic pesticides during flowering and recovering the crop until the end of the season. In this scenario, reduction in the cost of pesticide application and reduced risk due to less exposure to infection are the key enhancements to the system. During pollination, the melon plants are at risk of infection from bacterial wilt because organic production methods cannot include systemic insecticides. Only shorter residual contact insecticides are available, thus exposing the melon plants to vectors after the contact insecticide becomes ineffective. Application of an off-label biocontrol bacterium, Pseudomonas fluorescens A506, found in the organically certified product BlightBan®A506, was found to significantly increase control of Erwinia tracheiphila infection in plants, thereby allowing for increased productivity. Additionally, development of a Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR, primer set and probe improve the detection of Erwinia tracheiphila in melon plants. This new primer set was tested against numerous related and associated pathogens to document the specificity of this particular screening test.

La bactérie Erwinia amylovora est responsable de la maladie du feu bactérien des Maleae (pommier, poirier...). Le pouvoir pathogène de cette bactérie dépend d'une seringue moléculaire appelé système de sécrétion de type 3 (SSTT). Ce SSTT permet à la bactérie d'injecter des effecteurs dans les cellules de la plante. Parmi les effecteurs injectés, DspA/E est l'effecteur indispensable au pouvoir pathogène d'E. amylovora. Cet effecteur est à lui seul capable de provoquer la mort des cellules chez le pommier et le tabac et permet à la bactérie de se multiplier de manière transitoire chez A. thaliana. L'objectif de ce travail de thèse était de comprendre la fonction de DspA/E dans la cellule végétale et d'identifier des facteurs végétaux impliqués dans la toxicité de DspA/E. Afin de répondre à cette question, des plantes transgéniques exprimant DspA/E sous contrôle d'un promoteur inductible à l'estradiol ont été construites.Dans un premier temps, la caractérisation phénotypique des lignées exprimant DspA/E a été effectuée. Les résultats obtenus montrent que DspA/E est toxique lorsqu'il est exprimé in planta (il provoque la mort des cellules, inhibe la germination, la croissance racinaire et la traduction) et permet la multiplication in planta d'un mutant dspA/E. Un crible de mutants suppresseurs de la toxicité de l'effecteur DspA/E a été effectué sur une lignée transgénique exprimant DspA/E dans le but d'identifier un ou plusieurs gènes impliqués dans la toxicité de DspA/E. Ce crible suppresseur a permis d'identifier un candidat potentiel impliqué dans la photo-respiration, la glycolate oxydase 2 (GOX2). L'analyse fonctionnelle réalisée sur le mutant gox2-2 a permis de montrer que le gène GOX2 est un régulateur positif des réponses de défense d'A. thaliana en réponse à l'infection par E. amylovora.Enfin, la caractérisation du stress oxydant a permis de montrer que plusieurs formes actives de l'oxygène (H2O2 et O2.-) s'accumulent au cours de l'interaction entre A. thaliana et E. amylovora. Ceci a permis également de comprendre le rôle de DspA/E sur ce stress oxydant. Nos résultats suggèrent que la glycolate oxydase 2 participerait à l'induction du stress oxydant en perturbant le métabolisme des sucres.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniversitet, 2008. / Härtill 4 uppsatser.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 9 février 2006). Bibliogr.

Le but de cette thèse était d’évaluer le potentiel antimicrobien de 21 sels organiques et inorganiques pour contrôler la pourriture molle de la pomme de terre, causée par les bactéries Erwinia carotovora subsp. carotovora et Erwinia carotovora subsp. atroseptica. Les résultats obtenus ont montré que 11 sels ont complètement inhibé la croissance bactérienne in vitro, parmi lesquels le carbonate de sodium, le métabisulfite de sodium, le phosphate de sodium tribasique, le lactate d’aluminium, le chlorure d’aluminium, le bicarbonate de sodium, l’acétate d’ammonium, le di-hydroxy acétate d’aluminium, le sorbate de potassium et le benzoate de sodium se sont avérés bactéricides. Appliqués sur les tubercules de pomme de terre, seuls le chlorure d’aluminium, le métabisulfite de sodium et dans une moindre mesure le benzoate de sodium ont permis de réduire la sévérité de la maladie, et ce de façon curative et préventive. Il semble à la lumière des résultats obtenus, que l’effet inhibiteur des sels observé in vitro résulte de la capacité d’ionisation de l’eau (faible pKa ou pKb) de leurs constituants, ainsi que de leur lipophilicité (dans le cas du benzoate de sodium et du sorbate de potassium). Cette capacité d’ioniser l’eau des ions serait cependant altérée par le pouvoir tampon du tubercule. Pour leur part, les sels efficaces contre la maladie disposeraient de caractéristiques spécifiques leur permettant de demeurer actifs dans le tissu. Des études ultrastructurales ont montré que le chlorure d’aluminium provoque le bris de l’enveloppe bactérienne, une disparition des vésicules extracellulaires et une agrégation du cytoplasme, phénomènes non observés chez les bactéries traitées avec le métabisulfite de sodium. Enfin, l’évaluation de l’effet de certains sels sur la qualité des tubercules a montré d’une part que la perte de poids a été généralement plus importante chez les tubercules traités au chlorure d’aluminium ou au métabisulfite de sodium, et d’autre part que l’application des sels organiques, particulièrement de benzoate de sodium, a favorisé une augmentation du contenu en sucres solubles chez les tubercules. Cette étude démontre que le chlorure d’aluminium et le métabisulfite de sodium pourraient être mis à profit pour la conservation de la pomme de terre. / The objective of this thesis was to evaluate the antimicrobial potential of 21 organic and inorganic salts to control Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc) and Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), two bacteria responsible for soft rot development in stored potato tubers. The results have shown that eleven salts (at 0.2 M) have completely inhibited the bacterial growth in vitro, among which sodium carbonate, sodium metabisulfite, trisodium phosphate, aluminum lactate, aluminum chloride, sodium bicarbonate, ammonium acetate, aluminum di-hydroxy-acetate, potassium sorbate and sodium benzoate were bactericidal. On potato tubers, only aluminum chloride, sodium metabisulfite and to a lesser extent sodium benzoate have markedly controlled the disease severity, during both curative and preventive applications. Based on the obtained results, it appears that the inhibitory effect of salts in vitro relates to the water ionization capacity (low pKa or low pKb) of their constituent ions, as well as their lipophilicity. However, the effect was dampened in vivo, presumably due to the buffering capacity of tuber tissue and Donnan effect which could lead to generation of less effective ionic species. It is likely that those salts effective in vivo exhibit other properties contributing to their effectiveness. Ultrastructural studies on Eca showed that aluminum chloride caused rupture of bacterial envelope, and cytoplasmic aggregation, which were not observed in the bacteria treated with sodium metabisulfite. These observations suggest that a part of the toxic effect of aluminum chloride originates from alterations of the bacterial envelope, whereas rapid bacterial death caused by sodium metabisulfite occurs intracellularly through interaction with biomolecules, facilitated by the diffusion of SO2. Finally, evaluation of the effect of salts on tuber quality revealed that tuber weight loss was generally higher with aluminum chloride and sodium metabisulfite treatments, while the organic salts, particularly sodium benzoate, increased sugar content of the tubers. It was concluded that aluminum chloride and sodium metabisulfite can be profitably used to fight potato storage soft rot.

The ability of a genetically-engineered <i>Erwirzia carotovora</i> subsp. <i>carotovora</I> (Ecc) strain to transfer recombinant chromosomal DNA or plasmids to wildtype Ecc or <i>Pseudomonas fluorescens</i> was tested on filters, within soil microcosms, and <i>in planta</i>. Ecc was engineered by chromosomal insertion of a disarmed <i>endo</i>-pectate lyase gene marked with a 1.4kb DNA fragment conferring kanamycin resistance. Plasmids RPI and pBR322 were introduced separately into engineered Ecc clones. These strains served as donors in genetic transfer experiments. No transfer of the inserted kan marker or of pBR322 was observed under any experimental condition. In filter matings, RPI was transferred to wildtype Ecc at a frequency of 3.6 X 10⁻² transconjugants per donor (TPD) and to P. <i>fluorescens</i> at a frequency of 2.4 X 10⁻⁵ TPD. In matings conducted in potato tubers inoculated using sewing needles, the respective frequencies were 4.0 X 10⁻³ and 2.0 X 10⁻³, while matings on potato slices yielded frequencies of 4.7 X 10⁻² and 2.3 X 10⁻². In soil microcosms, the maximum transfer frequencies observed were 2.3 X 10³ and 8.4 X 10⁻⁵ TPD. / Master of Science

In the realm of tree fruit cultivation, the management of various diseases affecting pome fruits like apples and pears is crucial for sustaining production. This study amalgamates findings from three distinct disease investigations to propose an integrated approach to their management. Firstly, in pursuit of mitigating shoot blight severity caused by Erwinia amylovora and preventing fire blight cankers on pear trees, a two-year evaluation was conducted. The study assessed the efficacy of preventive treatments, including foliar spray and trunk injection applications of Giant Knotweed Extract (RSE) alongside antibiotics. Results highlighted the effectiveness of RSE in controlling both shoot blight severity and canker incidence, offering a sustainable alternative to antibiotics. Secondly, in addressing the bitter rot of apples caused by Colletotrichum spp., eighteen fungicide treatments were evaluated over two years, focusing on newer fungicide options to mitigate fungicide resistance development. Fungicides such as Omega, Aprovia, Ferbam, Captan, Ziram, and Cabrio were proven reliable management tools, complementing the existing effective fungicides that growers heavily depend on. Lastly, the emergence of European canker (Neonectria ditissima) on cider apple cultivars was investigated. Molecular analysis confirmed the presence of N. ditissima as the causal agent, posing a significant threat to cider apple production. Koch's postulates were fulfilled through various tests, proving the pathogenicity of N. ditissima. Further research avenues, including genome sequencing were conducted to enhance understanding and control of a devastating pathogen like N. ditissima. Integrating findings from these studies proposes a comprehensive management strategy incorporating preventive spray programs, alternative fungicides, and pathogen identification to combat these diseases effectively, ensuring sustainable production of apples and pears in orchards. This holistic approach offers growers a multifaceted toolkit to manage diseases effectively, safeguarding apple and pear orchards' productivity and economic viability. / Master of Science in Life Sciences / In the world of growing apples and pears, keeping diseases under control is crucial for keeping orchards thriving and productive. We conducted studies on three endemic and emerging diseases aiming to create a well-rounded approach to managing them. First, we looked into ways to reduce the impact of shoot blight and fire blight cankers on pear trees caused by a devastating bacterium Erwinia amylovora. We tested the efficacy of preventive spray applications of plant extract of giant knotweed alongside antibiotics and found more sustainable alternatives to antibiotics that effectively control this disease. Next, we studied bitter rot disease in apples caused by many different species of fungi in Colletotrichum genus. We determined the efficacy of eighteen different biorational and synthetic fungicide spray programs over two years to find new options that can help prevent fungicide resistance development against currently available fungicides in the market. Several fungicides showed promise in managing this disease including Omega, Aprovia, Ferbam, Captan, Ziram and Cabrio, adding to the effective materials that growers already rely on. Lastly, we investigated the emergence of European canker on cider apple trees. This disease, caused by a fungus Neonectria ditissima, poses a serious threat to cider production. We confirmed the pathogen's identity and its capability of causing the disease in controlled experiments. We propose a comprehensive strategy for managing these diseases by including preventive spray applications of alternative materials and classic fungicides, combined with accurately identifying the pathogens. Our holistic approach provides growers with a range of tools to effectively protect their orchards, ensuring sustainable production of both apples and pears.