El fuego bacteriano, causado por Erwinia amylovora, es una enfermedad muy importante a nivel comercial y económico porque afecta a plantas de la familia de las rosáceas y es especialmente agresiva en manzano (Pyrus malus) y peral (Pyrus communis), así como en plantas ornamentales (Crataegus, Cotoneaster o Pyracantha). Esta enfermedad está distribuida por todo el mundo en zonas climáticas templadas de Amércia del Norte, Nueva Zelanda, Japón, Israel, Turquí y Europa. En España, el fuego bacteriano fue detectado por primera vez en 1995 en el norte del País (Euskadi) y más tarde en nuevos focos aparecidos en otras áreas. La enfermedad puede ser controlada comercialmente mediante la aplicación de pesticidas quimicos (derivados de cobre, antibioticos). Sin embargo, muchos de los productos químicos presentan baja actividad o causan fitotoxicidad, y la estreptomicina, el producto más eficaz, esta prohibido en muchos países, incluyendo España. Por tanto, en ausencia de apropiados agentes químicos, el control biológico se contempla como una buena alternativa. En el presente trabajo, un agente de control biológico, Pseudomonas fluorescens EPS62e, ha sido seleccionada de entre 600 aislados de las especies P. fluorescens y Pantoea agglomerans obtenidos de flores, frutos y hojas de plantas de la familia de las rosáceas durante una prospección llevada a cabo en varias áreas geográficas de España. La cepa ha sido seleccionada por su capacidad de suprimir la infecciones producidas por E. amylovora frutos inmaduros, flores y brotes de peral en condiciones de ambiente controlado, presentando unos niveles de control similares a los obtenidos mediante el control químico usando derivados de cobre o antibióticos. La cepa además ha mostrado la capacidad de colonizar y sobrevivir en flores y heridas producidas en frutos inmaduros en condiciones de ambiento controlado pero también en flores en condiciones de campo. La exclusión de E. amylovora medinate la colonización de la superficie, el consumo de nutrientes, y la interacción entre las células del patógeno y del agente de biocontrol es la principal causa de la inhibición del fuego bacteriano por la cepa EPS62e. Estas características constituyen aspectos interesantes para un desarrollo efectivo de la cepa EPS62e como un agente de biocontrol del fuego bacteriano en condiciones comerciales. / Fire blight, caused by Erwinia amylovora is a serious disease of rosaceous plants with great commercial and economic interest that is distributed over the world. Disease may be controlled commercially by the application of chemicals (copper compounds, antibiotics). Many chemical agents have low activity or cause phytotoxicity, and streptomycin, the most effective antibiotic, is not approved for use in many countries, including Spain. Therefore, in the absence of suitable chemical control agents, biological control could provide a useful alternative. In the present work, a biological control agent, Pseudomonas fluorescens EPS62e, has been selected among 600 isolates of P. fluorescens and Pantoea agglomerans obtained from flowers, fruits and leaves of rosaceous plants in a survey performed through several geographic areas of Spain. This strain has been selected for its capacity to suppress immature fruit, blossom and shoot infections caused by E. amylovora, under controlled environment conditions, providing control levels similar to chemical control with copper or antibiotic compounds. The strain has also shown the capacity to colonize and survive well in flowers and wounds on immature fruit under controlled environment conditions but also in flowers under natural conditions. Pre-emptive exclusion of the pathogen E. amylovora by surface colonization and nutrients depletion, and cell-to-cell interaction appear to be the main mechanisms of biocontrol. These characteristics constitute interesting traits for an effective development as a fire blight biological control agent under commercial conditions.

La soca EPS125 ha mostrat ser un efectiu agent de control biològic de diferents patògens fúngics de postcollita en diferents fruits. Degut a la seva elevada eficàcia, es va plantejar desenvolupar aquesta soca comercialment i per aquest motiu en el present treball es plantejà complementar la informació necessària pel seu registre. D'acord amb els resultats obtinguts mitjançant proves fenotípiques i genotípiques, la soca EPS125 queda inclosa dins l'espècie Pantoea agglomerans (Enterobacter agglomerans-Erwinia herbicola). En relació a la utilització de fonts de carboni, en el perfil i contingut d'àcids grassos cel·lulars i en el polimorfisme en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica (MRFLP), la soca EPS125 mostrà trets característics que la diferencien d'altres soques. Els dos marcadors moleculars (125.2 i 125.3) específics per la soca EPS125 dissenyats en el present treball mostraren ser semiespecífics per la seva detecció mitjançant la tècnica PCR i Real Time PCR. Quedant pendent l'anàlisi d'especificitat de l'ús combinat dels dos marcadors moleculars en una reacció PCR multiplex. P. agglomerans EPS125 ha mostrat ser molt efectiva en el control de Penicillium expansum en poma amb una dosi efectiva mitjana de 2.7x105 a 7x105 ufc/ml, i una ratio de 25-101 cèl·lules de la soca EPS125 per inactivar una espora del patogen segons el model de saturació hiperbòlica. Segons les aproximacions fenotípiques i estudis genotípics realitzats, sembla que els mecanismes de biocontrol utilitzats per la soca EPS125 contra P. expansum en poma estan directament relacionats amb la capacitat de formació de biofilm per aquesta soca. / Strain EPS125 has shown effectiveness against a wide range of fungal pathogens in a large variety of fruit. However, to develop this strain as commercial biopesticide an extensive characterization is essential. For this reason, the objective of this PhD thesis was to complete the necessary information for its future registration.According to morphological and biochemical tests, strain EPS125 pertain to Pantoea agglomerans (Enterobacter agglomerans-Erwinia herbicola) species. This strain showed typical traits different from other bacteria in relation to the ability to use several carbon sources, the fatty acid profiles and the macrorestriction fragment length polymorphism (MRFLP) pattern. The two DNA molecular markers of P. agglomerans EPS125 (125.2 and 125.3) obtained in the present work were semispecific in the detection of strain EPS125 by means of PCR and Real Time PCR. However, the combined use of the two primer sets in a multiplex PCR reaction would be specific. P. agglomerans EPS125 was highly effective against P. expansum in apple fruit having a median effective dose from 2.7x105 to 7x105 cfu/ml and a ratio of 101 and 25 EPS125 cells to inactivate one pathogen spore according to the hyperbolic saturation model. Biocontrol mechanisms used by P. agglomerans EPS125 against P. expansum in apple fruit may be related with the ability of biofilm formation by this strain as show phenotypic approaches and genotypic studies.

El inmunosupresor FK506 (Tacrolimus, Prograf) ha incrementado la tasa de supervivencia del trasplante de órganos. FK506 ejerce su acción inmunosupresora mediante la inhibición de la fosfatasa calcineurina en células T activadas. Desgraciadamente, la terapia con FK506 está asociada con efectos no terapéuticos indeseados, entre los que destaca la diabetes, que implican otras dianas distintas de calcineurina. Para identificar estas dianas hemos estudiado la toxicidad celular de FK506 en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. FK506 aumentó la sensibilidad de la levadura a estrés osmótico de un modo independiente de calcineurina y las proteínas de unión a FK506. FK506 también indujo un fuerte ayuno de aminoácidos y la activación de la ruta de control general de nutrientes (GCN). La prototrofía de triptófano o el exceso de triptófano eliminó la toxicidad de FK506, lo que muestra que el ayuno de triptófano media este efecto. La mutación de los genes GCN3 y 4 alivió parcialmente la toxicidad de FK506, lo que sugiere que la activación de la ruta GCN por FK506 también está implicada en la tolerancia osmótica. FK506 reforzó la fosforilación de la kinasa Hog1p dependiente de estrés osmótico pero sin inducción de un reportero dependiente de Hog1p. Interesantemente, la interrupción del gen GCN2 suprimió la hiperfosforilación de Hog1p dependiente de FK506 y restauró la actividad del reportero dependiente de Hog1p. A la inversa, la interrupción del gen HOG1 afectó a la activación de Gcn2p y traducción de un reportero GCN4-lacZ dependientes de FK506. Esto pone de manifiesto la existencia de una interacción funcional entre las kinasas Gcn2p y Hog1p. En conjunto estos datos demuestran que tanto el ayuno de aminoácidos como la activación de la ruta GCN inducidos por FK506 contribuyen a la sensibilidad celular a estrés osmótico y revelan un bucle regulador positivo entre las rutas GCN y HOG. Dada la naturaleza conservada de estas rutas, este mecanismo de toxicidad de FK506 / Rodríguez Hernández, CJ. (2006). Identificación de nuevos mecanismos moleculares del inmunosupresor FK506 en Saccharomyces cervisiae [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1849

Beta-lapachona ( -lap) es un agente antitumoral que induce apoptosis selectivamente en células tumorales. El mecanismo preciso de citotoxicidad de -lap no es aún completamente comprendido. Aquí reportamos que -lap produce un retraso en la progresión del ciclo celular en la transición G1/S, aumenta la fosforilación de la quinasa de control Rad53p y disminuye la supervivencia celular en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. Además, -lap induce la fosforilación de histona H2A en la posición serina 129. Estas respuestas de control de ciclo son reguladas por las quinasas Mec1p y Tel1p. Mec1p se requiere para la fosforilación de Rad53p/histona H2A y supervivencia celular tras tratamiento con -lap en cultivos asincrónicos, pero no para el retraso en la transición G1/S. La mutación tel1 aumenta la sensibilidad a -lap en una cepa defectiva en mec1, y compromete las respuestas de los puntos de control de ciclo. La fosforilación de Rad53p y el retraso en G1/S son completamente dependientes de un complejo Mre11p-Rad50p-Xrs2p (XMR) funcional, y mutantes en el complejo XMR son extremadamente sensibles al tratamiento con -lap. Finalmente, XRS2 y TEL1 trabajan epistáticamente respecto a la sensibilidad a -lap y Xrs2p se fosforila en un modo dependiente de Tel1p tras el tratamiento. El tratamiento con -lap también genera la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la cual es bloqueada eficientemente por dicumarol, un inhibidor de NADH deshidrogenasas (NADH-DH). El tratamiento con dicumarol no afecta a la viabilidad ni a las respuestas de control activadas por la droga. Identificamos un mutante, defectivo en la NADH-DH mitocondrial Nde2p, que es resistente a la toxicidad de -lap. -lap induce la producción de ROS en este mutante, sin afectar la viabilidad o la progresión de ciclo. El mutante nde2 presenta un retraso en la entrada en fase S del ciclo celular, e hipersensibilidad a agentes que dañan el ADN. Nuestros datos indican que Nde2p es un determ / Menacho, MA. (2007). Mecanismos moleculares involucrados en la citotoxicidad del agente antitumoral beta-lapachona [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1877