No description available.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19607号 / 医博第4114号 / 新制||医||1015(附属図書館) / 32643 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 前川 平, 教授 中畑 龍俊, 教授 江藤 浩之 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Erythroid Krüppel-like factor (EKLF or KLF1) is a transcription factor with roles in embryonic and adult erythropoiesis. KLF1 knockout mouse embryos die due to severe anemia. Dominant human mutations in KLF1 can cause hereditary persistence of fetal hemoglobin. We show that KLF1 positively regulates β-globin and Bcl11A gene expression using KLF1 knockdown in in vitro-differentiated CD34+ human umbilical cord blood cells. -globin expression appears dependent on KLF1; it is increased with modest KLF1 knockdown but not in cells with low KLF1. KLF2 mRNA amounts are usually increased in KLF1 knockdown. KLF1 knockdown in CD34+ cells results in reduced colony forming ability. Interestingly, the expression of certain proliferation and cell cycle genes is reduced due to KLF1 knockout in mouse or knockdown in human erythroid cells. In conclusion, KLF1 is an important regulator of the β-globin locus and has roles in proliferation and cell cycle.

Red blood cell (RBC) transfusion is the major treatment for patients suffering from trauma or severe anaemias, and life-long transfusion may be needed to alleviate symptoms and maintain body functioning. However, with a relatively low portion of people are donating, shortage in blood supply is becoming a life-threatening issue in the aging society. Among attempts to identify novel sources for transfusion medicine, human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are currently the most promising candidate, which is capable of producing donor-independent, pathogen-free and immunologically compatible RBCs. Currently, hESC-derived erythropoiesis in vitro is considered to mimic the very primitive yolk sac haematopoiesis, indicated by a low or absent level of β globin production and incomplete enucleation. Thus these cells are not mature enough to be used in transfusion medicine. The aim of this PhD project was to overexpress a key erythroid transcription factor, Erythroid Krüppel-like factor (EKLF or KLF1) in an inducible manner to improve the maturation of hESC-derived erythroid cells. EKLF is a member of the Krüppel-like factor family, which is characterized by three C2H2 type zinc finger motifs. EKLF expression in vivo is highly restricted to erythroid cells in yolk sac, fetal liver, spleen and the bone marrow, although recently a low-level of expression was found in haematopoietic precursors. Published reports demonstrate that EKLF can 1) activate β globin expression by binding to the CACCC box in its promoter or by altering β-like globin locus chromatin structure; 2) exert a role in MEP (common progenitor for erythrocytes and megakaryocytes) stage by favouring erythroid differentiation against megakaryocyte differentiation; 3) promote enucleation by affecting the DNase II-alpha expression in the central macrophage of a fetal liver erythroblastic island; 4) act as an instructive factor for lineage commitment towards erythroid fate in HSCs. In this project, 1) We tested and evaluated a feeder-free, serum-free differentiation system for deriving erythroid cells from hESCs; 2) We constructed constitutive and inducible EKLF expression vectors and validated them in K562 cells; 3) We generated hESC lines carrying these EKLF expression vectors and assessed their effects on erythrocyte production and maturation. We found that our differentiation system was capable of generating haematopoietic progenitors (HPCs) and erythroid cells at high efficiency. Using this differentiation system, we concluded that enhanced expression of EKLF upregulated adult β globin expression selectively, without altering expressions of other globins. This finding provides hints for the development of novel approaches to “reprogramme” hESCs towards a certain fate and overexpression of EKLF in this differentiation system may be beneficial for resolving issues in future transfusion medicine.

L’érythropoïèse constitue un processus continu et ordonné au cours duquel des progéniteursérythroides commis prolifèrent et se différencient en globules rouges. Au cours d’un criblage visant à identifierdes gènes dont l’expression est régulée au cours de la différenciation terminale, nous avons identifié ISG15comme un gène dont l’expression est induite dans les stades tardifs de la différenciation érythroïde. ISG15appartient à la famille des protéines apparentées à l’ubiquitine et est conjuguée directement à des résidus Lysinede protéines cibles. La séquence des évènements moléculaires qui président à la modification de résidus Lysinedes protéines par ISG15 (ISGylation) est très semblable à ceux mis en oeuvre dans l’ubiquitination des protéines.Nous avons montré que l’expression d’ISG15 et des enzymes liées au processus d’ISGylation Ube1L, UbcM8 etHerc6 est induite au cours de l’érythropoièse in vivo et aussi dans des érythroblastes en culture induits à sedifférencier en réponse à l’Epo. Grâce à ce système de culture in vitro, nous avons montré que l’induction de cesgènes est majoritairement indépendante de la voie de signalisation IFN, et partiellement dépendante de la voie designalisation Epo. La comparaison de l’érythropoïèse dans des souris contrôles et des souris dans lesquelles legène ISG15 a été inactivé (ISG15-/-), montre une diminution du nombre de progéniteurs BFU-E et CFU-E dansla moelle osseuse avec une augmentation des BFU-E/CFU-E dans la rate des animaux ISG15-/-. Nous avonsaussi montré que les érythroblastes ISG15-/- sont inhibés dans leur différenciation terminale, à la fois in vivo et invitro. A l’inverse, la surexpression d’ISG15 dans les érythroblastes se révèle faciliter la différenciationérythroide. Au niveau moléculaire, nous avons montré que des acteurs importants de la différenciation érythroidepeuvent être ISGylés, comme par exemple STAT5, Globine, PLCγ et ERK2. En ce qui concerne plusprécisément STAT5, nous avons montré que son ISGylation est induite au cours de la différenciation et avonscherché à identifier les conséquences de son ISGylation. Dans le contexte d’une protéine de fusion, STAT5ISGylée se lie mieux à son site de liaison à l’ADN, une propriété associée avec une régulation positive de TfR etBCL-XL, deux gènes précédemment décrits comme étant régulés par STAT5 dans les érythroblastes. L’ensemblede ces résultats établit un nouveau rôle pour ISG15 au cours de la différenciation érythroide, en plus de sesfonctions anti-virales bien caractérisées / Erythropoiesis is an orderly continuous process during which committed erythroid progenitorcells proliferate and differentiate into mature red blood cells. In a search for genes that are deregulated duringthis differentiation process, we have identified ISG15 as being induced during the late stages of erythroiddifferentiation. ISG15 belongs to the ubiquitin-like protein family and is covalently linked to target proteins bythe enzymes of the ISGylation machinery. Using both in vivo and in vitro differentiating erythroblasts, we haveshown that expression of ISG15 as well as the ISGylation process related enzymes Ube1L, UbcM8 and Herc6are induced during erythroid differentiation. Moreover, using in vitro differentiating erythroblasts, we haveshown that the induction of these genes is mostly independent of IFN signaling, while it is partially dependent onEpo signaling in these cells. Our analysis of the ISG15 deficient mice have shown a decreased number of BFUE/CFU-E in the bone marrow, associated with an increased number of these cells in the spleen of these animals,a phenotype reminiscent of stress erythropoiesis. While ISG15-/- bone marrow and spleen-derived erythroblastsshowed a less differentiated phenotype both in vivo and in vitro, over-expression of ISG15 in erythroblasts wasfound to facilitate erythroid differentiation. At the molecular level, we have shown that important effectors oferythroid differentiation can be ISGylated, including STAT5, Globin, PLCγ and ERK2. Attempt to identify theconsequences of ISGylation has only been performed for STAT5. When studied in the context of a fusionprotein, ISGylated STAT5 was found endowed with a higher capacity to bind DNA, a property associated withup-regulation of TfR and Bcl-XL, two genes previously described as being regulated by STAT5 during erythroiddifferentiation. This establishes a new role for ISG15, in addition to its well-characterized anti-viral functions,during erythroid differentiation.

Thesis (Ph.D. )--University of Tennessee Health Science Center, 2008. / Title from title page screen (viewed on October 7, 2008 ). Research advisor: Paul A. Ney, M.D. Document formatted into pages (xi, 122 p. : ill.). Vita. Abstract. Includes bibliographical references (p. 78-110).

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 1997. / "May 1997." Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 147-162). Also available on the Internet.

京都大学 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13534号 / 論医博第2274号 / 新制||医||1065(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 滝田 順子, 教授 伊藤 貴浩, 教授 江藤 浩之 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Une des complications importantes d’un traitement intensif de chimio/radio-thérapie est l’aplasie de la moelle osseuse qui peut persister longtemps même après une greffe de cellules souches. Le PBI-1402 est un petit lipide qui a été associé à la diminution de l’apoptose des neutrophiles induite par des agents cytotoxiques. Nos travaux ont démontré que la culture in vitro de progéniteurs hématopoiétiques humains en présence de PBI-1402 induit une augmentation significative du nombre de progéniteurs érythroides (PEryth) (p<0,05). En évaluant la sensibilité des PEryth à l’érythropoietine (Epo), nous avons démontré que le PBI-1402 n’a pas d’effet sensibilisateur et que les cellules répondent de façon similaire aux cellules contrôles. De plus, la combinaison de l’Epo et du « stem cell factor » avec le PBI-1402 permet de prolonger et d’augmenter l’activation d’ERK1/2 (p<0,05), un important signal mitogène. Cet effet est associé à une inhibition de l’activation de la phosphatase MKP-1 dans les cellules exposées au PBI-1402. Nous démontrons aussi la capacité du PBI-1402 à amplifier la prolifération des PEryth et sa capacité à réduire la durée et l’intensité de l’anémie dans un modèle in vivo murin. Des souris ayant reçu une dose létale d’irradiation et subi une transplantation syngénique de moelle osseuse, ont été traitées oralement avec le PBI-1402 pendant 14 jours. Ces souris démontrent une réduction significative de l’anémie post-transplantation versus les souris contrôle (p<0,05). De plus, la moelle osseuse des souris traitées au PBI-1402 présente un nombre de BFU-E et CFU-E plus élevé comparativement au contrôle. Ces résultats démontrent donc le potentiel du PBI-1402 à réduire l’anémie post-transplantation et accélérer la reconstitution érythroïde. / One of the most important complications of intensive radiotherapy or chemotherapy is cytopenia, which can persist for significant amount of time even after stem cell transplantation. PBI-1402, a small lipid, was previously shown to be associated with decreased neutrophil apoptosis caused by cytotoxic agents. Our work has shown that day primary human hematopoietic cell in vitro culture in the presence of PBI-1402 resulted in an increased number of erythroid progenitors (p<0,05). Dose-response experiments evaluating sensitivity to erythropoietin (Epo) of cells exposed to PBI-1402 indicated that PBI-1402 did not have a sensitizing effect and that both treated and control cells respond similarly to Epo. In addition, PBI-1402, used in combination with stem cell factor (SCF) and Epo, enhanced and prolonged ERK1/2 phosphorylation (p<0.05), a signalling pathway important for erythroid progenitor cell proliferation. This effect was associated with a decrease of the phosphatase MKP-1 activation in PBI-1402 exposed cells. This translated into and increased proliferation of erythroid progenitors as well as a reduced duration and level of anemia in an in vivo murine transplantation model. Lethally irradiated mice that received syngeneic stem cell transplantation were treated orally with PBI-1402 for 14 days. These mice demonstrated a significant reduction in post-transplantation anemia in a dose dependent manner compared to control (vehicle)(p<0.05). Moreover, PBI-1402-treated mice harboured significantly higher numbers of BFU-E and CFU-E in bone marrow compared to control (p<0.05). These results demonstrate that PBI-1402 treatment significantly reduced transplantation-induced anemia with concomitant acceleration in erythroid recovery.

Une des complications importantes d’un traitement intensif de chimio/radio-thérapie est l’aplasie de la moelle osseuse qui peut persister longtemps même après une greffe de cellules souches. Le PBI-1402 est un petit lipide qui a été associé à la diminution de l’apoptose des neutrophiles induite par des agents cytotoxiques. Nos travaux ont démontré que la culture in vitro de progéniteurs hématopoiétiques humains en présence de PBI-1402 induit une augmentation significative du nombre de progéniteurs érythroides (PEryth) (p<0,05). En évaluant la sensibilité des PEryth à l’érythropoietine (Epo), nous avons démontré que le PBI-1402 n’a pas d’effet sensibilisateur et que les cellules répondent de façon similaire aux cellules contrôles. De plus, la combinaison de l’Epo et du « stem cell factor » avec le PBI-1402 permet de prolonger et d’augmenter l’activation d’ERK1/2 (p<0,05), un important signal mitogène. Cet effet est associé à une inhibition de l’activation de la phosphatase MKP-1 dans les cellules exposées au PBI-1402. Nous démontrons aussi la capacité du PBI-1402 à amplifier la prolifération des PEryth et sa capacité à réduire la durée et l’intensité de l’anémie dans un modèle in vivo murin. Des souris ayant reçu une dose létale d’irradiation et subi une transplantation syngénique de moelle osseuse, ont été traitées oralement avec le PBI-1402 pendant 14 jours. Ces souris démontrent une réduction significative de l’anémie post-transplantation versus les souris contrôle (p<0,05). De plus, la moelle osseuse des souris traitées au PBI-1402 présente un nombre de BFU-E et CFU-E plus élevé comparativement au contrôle. Ces résultats démontrent donc le potentiel du PBI-1402 à réduire l’anémie post-transplantation et accélérer la reconstitution érythroïde. / One of the most important complications of intensive radiotherapy or chemotherapy is cytopenia, which can persist for significant amount of time even after stem cell transplantation. PBI-1402, a small lipid, was previously shown to be associated with decreased neutrophil apoptosis caused by cytotoxic agents. Our work has shown that day primary human hematopoietic cell in vitro culture in the presence of PBI-1402 resulted in an increased number of erythroid progenitors (p<0,05). Dose-response experiments evaluating sensitivity to erythropoietin (Epo) of cells exposed to PBI-1402 indicated that PBI-1402 did not have a sensitizing effect and that both treated and control cells respond similarly to Epo. In addition, PBI-1402, used in combination with stem cell factor (SCF) and Epo, enhanced and prolonged ERK1/2 phosphorylation (p<0.05), a signalling pathway important for erythroid progenitor cell proliferation. This effect was associated with a decrease of the phosphatase MKP-1 activation in PBI-1402 exposed cells. This translated into and increased proliferation of erythroid progenitors as well as a reduced duration and level of anemia in an in vivo murine transplantation model. Lethally irradiated mice that received syngeneic stem cell transplantation were treated orally with PBI-1402 for 14 days. These mice demonstrated a significant reduction in post-transplantation anemia in a dose dependent manner compared to control (vehicle)(p<0.05). Moreover, PBI-1402-treated mice harboured significantly higher numbers of BFU-E and CFU-E in bone marrow compared to control (p<0.05). These results demonstrate that PBI-1402 treatment significantly reduced transplantation-induced anemia with concomitant acceleration in erythroid recovery.