Submitted by Andre Moraes Queiroz (andre.moraesqueiroz@ufpe.br) on 2015-04-14T15:24:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Regina Elisabety Oliveira Folha.pdf: 2918360 bytes, checksum: 1a7e68f1ca5dfdac7826122b071a2c7f (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T15:24:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Regina Elisabety Oliveira Folha.pdf: 2918360 bytes, checksum: 1a7e68f1ca5dfdac7826122b071a2c7f (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / CNPq; FACEPE; CAPES / O pinhão-manso é uma espécie vegetal com grande potencial para produção de biodiesel a partir de óleo extraído das sementes, composto principalmente por ácidos graxos sintetizados primariamente nos cloroplastos. A determinação do proteoma cloroplastidal de pinhão-manso, submetido a estresse por salinidade e déficit hídrico, revelou alterações provavelmente associadas a mecanismos de regulação gênica, metabólica e fisiológica para adaptação da planta. Este trabalho teve como objetivo a identificação de peptídeos expressos nos cloroplastos de pinhão-manso submetido ao estresse hídrico e salino, através do mapeamento eletroforético (1D e 2D) e espectrometria de massas. Na análise proteômica, as proteínas cloroplastidias foram extraídas, quantificadas e analisadas por eletroforese unidimensional e bidimensional. No tratamento salino, sete fragmentos do perfil eletroforético 1D controle, após duas ou 72 h sob aplicação do estresse foram excisados, digeridos com tripsina e identificados via espectrometria de massas. No tratamento com déficit hídrico, seis fragmentos do perfil eletroforético 1D controle ou sob estresse, assim como 14 spots diferencialmente expressos entre os perfis 2D, foram também analisados via espectrometria de massas. Foram identificadas presumivelmente mais de 35 proteínas, categorizadas em processo de geração de energia, metabolismo de carboidratos e em respostas de defesa a estresses abióticos. O padrão de comportamento dos peptídeos identificados sugere a existência de mecanismos de ajuste fisiológico para tolerância aos fatores de estresse estudados. Estas proteínas podem ser candidatas para investigações futuras de caracterização estrutural e funcional em estratégias de seleção e melhoramento genético para conferir maior tolerância à salinidade e ao déficit hídrico em pinhão-manso.

Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-12T19:11:16Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao_Cinthya_Pacheco_2012.pdf: 4200369 bytes, checksum: 36d135c783fc52253ae99288487195f8 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T19:11:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_Cinthya_Pacheco_2012.pdf: 4200369 bytes, checksum: 36d135c783fc52253ae99288487195f8 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-03-02 / CNPQ; FACEPE / A salinidade dos solos é um fator limitante para o desenvolvimento da cultura da cana-de-açúcar no Brasil, porém as plantas em geral apresentam mecanismos de tolerância variável ao estresse por salinidade. Nestes, pode haver alterações na expressão gênica que se tornam importantes objetos de estudo, que pode ser realizado através de análise proteômica. Assim, o objetivo do trabalho foi identificar peptídeos diferencialmente expressos em plantas de cana-de-açúcar submetidas ao estresse salino. Para tal, foi conduzido experimento em casa de vegetação com quatro variedades de cana-de-açúcar (RB867515, RB92579, RB72454 e RB855536) e duas condições salinas, 0 mM (controle) e 200 mM de NaCl. As coletas foram realizadas após 2 e 72 h da indução ao estresse por sal, tanto para as análises fisiológicas quanto para a análise proteômica. Os parâmetros fisiológicos avaliados foram: vazamento foliar de eletrólitos, potencial hídrico foliar, teor relativo de água, transpiração, fotossíntese e condutância estomática. Para a análise proteômica, as proteínas totais da folha +1 e raízes foram extraídas, quantificadas e analisadas por eletroforese bidimensional. A análise das imagens dos géis foi realizada em programa computacional onde em cada contraste apenas uma variável foi considerada (condição salina ou variedade). Spots diferenciais foram excisados, digeridos com tripsina e somente os de raiz foram identificados via espectrometria de massas. De acordo com os parâmetros fisiológicos, foram selecionadas as variedades RB855536 como a mais sensível à salinidade e a RB867515 como a mais tolerante. Foram observados peptídeos diferencialmente expressos distribuídos nos contrastes em ambas as variáveis (condição salina ou variedade) e órgãos estudados, categorizados por processo biológico e função molecular através de sua ontologia gênica. A variedade tolerante (RB867515) mostrou maior acúmulo de proteínas envolvidas com crescimento, desenvolvimento, metabolismo de carboidratos e energético após 2 h de estresse, indicando que nessas plantas a detecção do fator de estresse parece ativar sinalização para continuar o crescimento radicular, evitando regiões com excesso de íons tóxicos. Por outro lado, foi verificada na variedade sensível a presença dessas proteínas apenas no tratamento após 72 h. Em adição, proteínas envolvidas na metabolização de radicais livres, proteção de proteínas e estabilização de membranas tiveram sua expressão induzida na fase inicial de exposição ao estresse na variedade tolerante, enquanto que na sensível essas proteínas só foram expressas no tratamento após 72 h. Tais resultados sugerem que essas vias de resposta ao estresse são mais eficientes para conferir maior tolerância à salinidade em cana-de-açúcar, e que sua efetividade para a tolerância fenotípica depende da detecção do estresse e ativação precoce da expressão dos genes codificantes.

Seca e ferrugem asiática da soja (FAS) são dois dentre os principais estresses abióticos e bióticos que afetam negativamente a produtividade da soja (Glycine max L. Merrill) no mundo inteiro. A base genética da tolerância à seca e da resistência à FAS não são bem conhecidas e esclarecer como ocorre a resposta a estes estresses em soja é ainda um desafio. Atualmente, sabe-se que as plantas adaptam-se a estes estresses por meio da regulação da expressão gênica em nível transcricional e pós-transcricional. Na via da regulação pós-transcricional, microRNAs (miRNAs) têm sido apontados como importantes reguladores em várias plantas sob estresse biótico e abiótico. Entretanto, em soja, não havia sido relatado qualquer miRNA responsivo a estas condições. Neste contexto, nosso objetivo foi identificar novos miRNAs em soja e, também, caracterizar o padrão de expressão de alguns destes miRNAs durante ambos os estresses, além de buscar detectar genes alvos para estes miRNAs. Deste modo, esta tese foi dividida em capítulos, os quais apresentam os diferentes trabalhos desenvolvidos durante o doutorado. No capítulo III estão relatados os resultados da primeira investigação sobre a adequação de miRNAs como genes normalizadores em plantas. A estabilidade da expressão dos miRNAs foi investigada em diferentes tecidos e genótipos de soja, bem como entre estresses biótico e abiótico. Ao final deste trabalho, foram mostradas evidências de que a estabilidade da expressão de miRNAs pode ser maior que a de genes codificadores de proteínas em análises de RT-qPCR. No capítulo IV está descrita a descoberta de novos miRNAs a partir de bibliotecas de deficiência hídrica e FAS em soja, pelo emprego de sequenciamento de alto desempenho (Solexa). Neste estudo, foram detectados 256 miRNAs. Análises de RT-qPCR foram realizadas para alguns dos novos miRNAs, observando-se alguns miRNAs diferencialmente expressos, indicando evidência molecular para um possível envolvimento de miRNAs em processos responsivos à deficiência hídrica e FAS. Para um dos miRNAs detectado, um novo alvo foi validado, correspondendo a um gene codificador de ascorbato oxidase e possivelmente relacionado com a infecção pelo fungo da ferrugem asiática em genótipo suscetível, dados estes apresentados no capítulo V. Esta tese contribui para o aumento de informações sobre miRNAs de plantas, bem como para o entendimento da regulação gênica em soja sob estresses de deficiência hídrica e FAS. / Drought and Asian Soybean Rust (ASR) are the major abiotic and biotic stresses that negatively affect soybean (Glycine max L. Merrill) productivity around the world. The genetic basis of drought tolerance and ASR resistance are not well understood, and clarification on how the response to these stresses occur in soybean is still a challenge. Currently, it is known that adaptation is achieved through the regulation of gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels. In the way of post-transcriptional regulation, microRNAs (miRNAs) have been found to act as key regulator factors in many other plants under biotic and abiotic stresses. However, in soybean there was no report of miRNAs responsive to these conditions. In this context, our goal was to identify new miRNAs in soybean, characterize some of the miRNA expression patterns during both stresses, and try to detect target genes for the miRNAs. In this way, this thesis was divided in chapters which present the different works that were developed during the PhD period. In chapter three, the suitability of miRNAs as housekeeping genes in plants was investigated. MiRNA expression stability was analysed in different soybean tissues and genotypes as well as after abiotic or biotic stress treatments. It was shown that miRNA expression stability can be higher than the expression stability of protein-coding genes by RT-qPCR analysis. In chapter four, new miRNAs were discovered from Solexa deep sequencing of soybeans submitted to water deficit and rust infection. From these analyses 256 miRNAs were detected. RT-qPCRs were performed for some of the new miRNAs and the identification of differentially expressed miRNAs was observed, provinding molecular evidence for the possible involvement of miRNAs in the process of water deficit- and rust-stress responses. For one of the new miRNAs detected by Solexa sequencing, a new target was validated, which is a gene encoding ascorbate oxidase and that seems to be related with soybean rust infection in the genotype susceptible to the fungus (results were presented in chapter five). The present thesis contributes to improve the information about miRNAs in plantas, as well as to the understanding of soybean gene regulation under water deficit and ASR stresses.

A transformação genética é uma ferramenta importante para o estudo funcional de genes e obtenção de plantas com novas características agronômicas. A introdução de genes pela engenharia genética requer, para sua expressão otimizada, além de genes de interesse, a utilização de seqüências reguladoras da transcrição (promotores) eficazes. A obtenção de sequências promotoras raiz-específicas seria de grande valia para trabalhos de transformação genética de soja com vista à obtenção de resistência a nematóides e fungos, uma vez que permitiria o direcionamento da expressão de proteínas capazes de combater estes patógenos e outras pragas apenas nos órgãos-alvo do ataque, ou seja, raízes. O presente trabalho relata a caracterização inicial de quatro promotores de soja potencialmente raiz-específicos - GmAQP, GmAS2, GmEXT e GmRB7. A obtenção de raízes transformadas por Agrobacterium rhizogenes é uma ferramenta bastante útil para testar promotores e novos genes de interesse. Para a implementação do método de transformação mediada por A. rhizogenes em nosso laboratório, foram necessárias algumas etapas fundamentais, como a escolha de cultivares mais propícias para a transformação. Neste trabalho, foi identificada a cultivar MG/BR 46 Conquista como a que apresenta maior eficiência de transformação e menor tempo para a produção de raízes transgênicas, dois parâmetros fundamentais para tornar a técnica mais eficiente. A metodologia simples, pouco laboriosa e de rápida obtenção de resultados é essencial para atender as demandas da genômica funcional. O método já está bem estabelecido no laboratório e, além da aplicação na análise de promotores, vem sendo utilizado para testar novos genes candidatos para a transformação da soja e para a localização subcelular de proteínas codificadas pelos genes em estudo. Diversos fatores limitam a maior produtividade da soja, sendo as doenças os mais importantes e difíceis de controlar. Entre os fatores abióticos, a falta de água é responsável pela diminuição da produtividade agrícola, além de restringir as latitudes e os solos onde espécies comercialmente importantes podem ser cultivadas. Com o objetivo de aumentar a resistência a estresses abióticos e bióticos foi introduzido em soja o gene SnOLP, que codifica uma osmotina de Solanum nigrum. Foram obtidas três linhagens transgênicas, todas com uma única cópia do transgene. As análises de gerações segregantes confirmaram a integração estável do transgene. A linhagem B1, proveniente da transformação da cultivar Bragg, apresenta melhores resultados, tanto na resposta a estresses bióticos (fungos) quanto abióticos (seca). Os resultados obtidos no presente estudo mostram que existe potencial para a aplicação do gene SnOLP em estratégias de melhoramento da soja. / Genetic transformation is an important tool for functional studies of genes and generation of plants with new traits. The introduction of genes by genetic engineering requires for its optimal expression, effective transcription regulatory sequences (promoters). Root-specific promoter sequences would be valuable for studies on soybean genetic transformation to obtain nematode and fungal resistance, since they allow the expression of the interest protein in organs usually attacked by diseases - the roots. This thesis reports the initial characterization of four putative root-specific soybean promoters - GmAQP, GmAS2, GmEXT and GmRB7. Transgenic roots transformed by Agrobacterium rhizogenes are useful tool for screening of new promoters and genes of interest. To implement the transformation method mediated by A. rhizogenes in our lab, it was necessary some previous key steps, such as the choice of cultivars more susceptible to the bacteriam infection. MG/BR 46 Conquista cultivar was found to be the most susceptible and can be recommended for A. rhizogenes-mediated transformation experiments. The methodology is simple and fast, essential characteristics to meet the demands of functional genomics. The method is well established in the laboratory and, in addition to analysis of promoters, it has been used to test new genes for soybean transformation and subcellular localization of proteins encoded by the genes under study. Among the many factors that limit soybean yield, diseases are among the most important and difficult to control. Furthermore, the water deficit constrains agricultural productivity, restricting the latitudes and soils where commercially important species can be cultivated. Aiming to obtain increased resistance to abiotic and biotic stresses the osmotin encoding gene (SnOLP) from Solanum nigrum was introduced into soybean cultivars. Three transgenic lines with one transgene copy were obtained. The segregation analysis confirmed the stable integration of SnOLP. In vitro bioassays indicate that B1 transgenic line, derived from Bragg cultivar, was more resistant against economically important pathogenic fungi as well as more tolerant to drought. The results of this study show potential application of SnOLP in strategies for soybean breeding.

A transformação genética é uma ferramenta importante para o estudo funcional de genes e obtenção de plantas com novas características agronômicas. A introdução de genes pela engenharia genética requer, para sua expressão otimizada, além de genes de interesse, a utilização de seqüências reguladoras da transcrição (promotores) eficazes. A obtenção de sequências promotoras raiz-específicas seria de grande valia para trabalhos de transformação genética de soja com vista à obtenção de resistência a nematóides e fungos, uma vez que permitiria o direcionamento da expressão de proteínas capazes de combater estes patógenos e outras pragas apenas nos órgãos-alvo do ataque, ou seja, raízes. O presente trabalho relata a caracterização inicial de quatro promotores de soja potencialmente raiz-específicos - GmAQP, GmAS2, GmEXT e GmRB7. A obtenção de raízes transformadas por Agrobacterium rhizogenes é uma ferramenta bastante útil para testar promotores e novos genes de interesse. Para a implementação do método de transformação mediada por A. rhizogenes em nosso laboratório, foram necessárias algumas etapas fundamentais, como a escolha de cultivares mais propícias para a transformação. Neste trabalho, foi identificada a cultivar MG/BR 46 Conquista como a que apresenta maior eficiência de transformação e menor tempo para a produção de raízes transgênicas, dois parâmetros fundamentais para tornar a técnica mais eficiente. A metodologia simples, pouco laboriosa e de rápida obtenção de resultados é essencial para atender as demandas da genômica funcional. O método já está bem estabelecido no laboratório e, além da aplicação na análise de promotores, vem sendo utilizado para testar novos genes candidatos para a transformação da soja e para a localização subcelular de proteínas codificadas pelos genes em estudo. Diversos fatores limitam a maior produtividade da soja, sendo as doenças os mais importantes e difíceis de controlar. Entre os fatores abióticos, a falta de água é responsável pela diminuição da produtividade agrícola, além de restringir as latitudes e os solos onde espécies comercialmente importantes podem ser cultivadas. Com o objetivo de aumentar a resistência a estresses abióticos e bióticos foi introduzido em soja o gene SnOLP, que codifica uma osmotina de Solanum nigrum. Foram obtidas três linhagens transgênicas, todas com uma única cópia do transgene. As análises de gerações segregantes confirmaram a integração estável do transgene. A linhagem B1, proveniente da transformação da cultivar Bragg, apresenta melhores resultados, tanto na resposta a estresses bióticos (fungos) quanto abióticos (seca). Os resultados obtidos no presente estudo mostram que existe potencial para a aplicação do gene SnOLP em estratégias de melhoramento da soja. / Genetic transformation is an important tool for functional studies of genes and generation of plants with new traits. The introduction of genes by genetic engineering requires for its optimal expression, effective transcription regulatory sequences (promoters). Root-specific promoter sequences would be valuable for studies on soybean genetic transformation to obtain nematode and fungal resistance, since they allow the expression of the interest protein in organs usually attacked by diseases - the roots. This thesis reports the initial characterization of four putative root-specific soybean promoters - GmAQP, GmAS2, GmEXT and GmRB7. Transgenic roots transformed by Agrobacterium rhizogenes are useful tool for screening of new promoters and genes of interest. To implement the transformation method mediated by A. rhizogenes in our lab, it was necessary some previous key steps, such as the choice of cultivars more susceptible to the bacteriam infection. MG/BR 46 Conquista cultivar was found to be the most susceptible and can be recommended for A. rhizogenes-mediated transformation experiments. The methodology is simple and fast, essential characteristics to meet the demands of functional genomics. The method is well established in the laboratory and, in addition to analysis of promoters, it has been used to test new genes for soybean transformation and subcellular localization of proteins encoded by the genes under study. Among the many factors that limit soybean yield, diseases are among the most important and difficult to control. Furthermore, the water deficit constrains agricultural productivity, restricting the latitudes and soils where commercially important species can be cultivated. Aiming to obtain increased resistance to abiotic and biotic stresses the osmotin encoding gene (SnOLP) from Solanum nigrum was introduced into soybean cultivars. Three transgenic lines with one transgene copy were obtained. The segregation analysis confirmed the stable integration of SnOLP. In vitro bioassays indicate that B1 transgenic line, derived from Bragg cultivar, was more resistant against economically important pathogenic fungi as well as more tolerant to drought. The results of this study show potential application of SnOLP in strategies for soybean breeding.

Seca e ferrugem asiática da soja (FAS) são dois dentre os principais estresses abióticos e bióticos que afetam negativamente a produtividade da soja (Glycine max L. Merrill) no mundo inteiro. A base genética da tolerância à seca e da resistência à FAS não são bem conhecidas e esclarecer como ocorre a resposta a estes estresses em soja é ainda um desafio. Atualmente, sabe-se que as plantas adaptam-se a estes estresses por meio da regulação da expressão gênica em nível transcricional e pós-transcricional. Na via da regulação pós-transcricional, microRNAs (miRNAs) têm sido apontados como importantes reguladores em várias plantas sob estresse biótico e abiótico. Entretanto, em soja, não havia sido relatado qualquer miRNA responsivo a estas condições. Neste contexto, nosso objetivo foi identificar novos miRNAs em soja e, também, caracterizar o padrão de expressão de alguns destes miRNAs durante ambos os estresses, além de buscar detectar genes alvos para estes miRNAs. Deste modo, esta tese foi dividida em capítulos, os quais apresentam os diferentes trabalhos desenvolvidos durante o doutorado. No capítulo III estão relatados os resultados da primeira investigação sobre a adequação de miRNAs como genes normalizadores em plantas. A estabilidade da expressão dos miRNAs foi investigada em diferentes tecidos e genótipos de soja, bem como entre estresses biótico e abiótico. Ao final deste trabalho, foram mostradas evidências de que a estabilidade da expressão de miRNAs pode ser maior que a de genes codificadores de proteínas em análises de RT-qPCR. No capítulo IV está descrita a descoberta de novos miRNAs a partir de bibliotecas de deficiência hídrica e FAS em soja, pelo emprego de sequenciamento de alto desempenho (Solexa). Neste estudo, foram detectados 256 miRNAs. Análises de RT-qPCR foram realizadas para alguns dos novos miRNAs, observando-se alguns miRNAs diferencialmente expressos, indicando evidência molecular para um possível envolvimento de miRNAs em processos responsivos à deficiência hídrica e FAS. Para um dos miRNAs detectado, um novo alvo foi validado, correspondendo a um gene codificador de ascorbato oxidase e possivelmente relacionado com a infecção pelo fungo da ferrugem asiática em genótipo suscetível, dados estes apresentados no capítulo V. Esta tese contribui para o aumento de informações sobre miRNAs de plantas, bem como para o entendimento da regulação gênica em soja sob estresses de deficiência hídrica e FAS. / Drought and Asian Soybean Rust (ASR) are the major abiotic and biotic stresses that negatively affect soybean (Glycine max L. Merrill) productivity around the world. The genetic basis of drought tolerance and ASR resistance are not well understood, and clarification on how the response to these stresses occur in soybean is still a challenge. Currently, it is known that adaptation is achieved through the regulation of gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels. In the way of post-transcriptional regulation, microRNAs (miRNAs) have been found to act as key regulator factors in many other plants under biotic and abiotic stresses. However, in soybean there was no report of miRNAs responsive to these conditions. In this context, our goal was to identify new miRNAs in soybean, characterize some of the miRNA expression patterns during both stresses, and try to detect target genes for the miRNAs. In this way, this thesis was divided in chapters which present the different works that were developed during the PhD period. In chapter three, the suitability of miRNAs as housekeeping genes in plants was investigated. MiRNA expression stability was analysed in different soybean tissues and genotypes as well as after abiotic or biotic stress treatments. It was shown that miRNA expression stability can be higher than the expression stability of protein-coding genes by RT-qPCR analysis. In chapter four, new miRNAs were discovered from Solexa deep sequencing of soybeans submitted to water deficit and rust infection. From these analyses 256 miRNAs were detected. RT-qPCRs were performed for some of the new miRNAs and the identification of differentially expressed miRNAs was observed, provinding molecular evidence for the possible involvement of miRNAs in the process of water deficit- and rust-stress responses. For one of the new miRNAs detected by Solexa sequencing, a new target was validated, which is a gene encoding ascorbate oxidase and that seems to be related with soybean rust infection in the genotype susceptible to the fungus (results were presented in chapter five). The present thesis contributes to improve the information about miRNAs in plantas, as well as to the understanding of soybean gene regulation under water deficit and ASR stresses.

As plantas, por serem organismos sésseis, enfrentam persistentemente perturbações ambientais adversas denominadas estresses abióticos, sendo as mais importantes, a seca, a salinidade do solo, as temperaturas extremas e a presença de metais pesados. Em resposta, as plantas desenvolveram mecanismos de tolerância, resistência e prevenção para minimizar a influência do estresse, utilizando estratégias de curto prazo para readaptar rápida e eficientemente seu metabolismo. Neste sentido, os pequenos RNAs não codificantes (sncRNAs) são fortes candidatos para realizar este tipo de regulação. Através do sequenciamento de nova geração revelou-se o papel dos sncRNAs na regulação da expressão gênica em nível transcricional e póstranscricional. Dentre os sncRNAs, os microRNAs (miRNAs) são os mais conhecidos e os fragmentos derivados dos RNAs transportadores (tRFs) são os mais novos e com maiores perspectivas de descobertas futuras. Os miRNAs desempenham papéis regulatórios essenciais tanto no crescimento das plantas quanto no desenvolvimento e resposta ao estresse, enquanto os tRFs, em sua maioria, têm sido associados a respostas de estresse. Eugenia uniflora L., “pitanga” ou a cereja brasileira é uma árvore frutífera nativa da América do Sul que pertence à família Myrtaceae. Ela cresce em diferentes ambientes; florestas, restingas e ambientes áridos e semi-áridos no nordeste brasileiro, sendo uma espécie versátil em termos de adaptabilidade e que desempenha um papel fundamental na manutenção da vegetação costeira arbustiva. Além disso, é muito conhecida por suas propriedades medicinais que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes nas folhas e frutos. E. uniflora representa uma fonte fascinante da biodiversidade do germoplasma e tem um grande potencial como fonte de genes para o melhoramento genético. Portanto, a compreensão dos mecanismos que conferem tolerância ao estresse nesta planta é de particular importância. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é a identificação de sncRNAs (miRNAs e tRFs) por ferramentas de bioinformática e análise do padrão de expressão destes sob condições de estresse abiótico (seca e salinidade), bem como avaliação dos genes envolvidos nesta resposta. No capítulo 1, bibliotecas de DNA, pequenos RNAs (sRNAs) e RNAseq de folhas foram usadas para identificar pre-miRNAs, miRNAs maduros e potenciais alvos destes miRNAs, respectivamente. A montagem de novo do genoma permitiu identificar 38 miRNAs conservados e 28 novos miRNAs. Após a avaliação da expressão destes, 11 conservados, entre eles miR156 e miR170, mostraram variação significativa nas condições de restinga e de estresse induzido por PEG. A maioria deles foram previamente descritos em processos de estresse em outras espécies. 14 novos miRNAs foram avaliados em diferentes tecidos de pitanga mostrando variação significativa no padrão de expressão. Os alvos destes últimos miRNAs foram preditos e validados por RTqPCR. Eles correspondem a genes de fatores de transcrição e outros genes como transferases ou ATPases e demonstraram o padrão esperado oposto à expressão dos miRNAs. No capítulo 2, as mesmas bibliotecas foram usadas para identificar tRFs conservados na família das Myrtaceae. Para isso, os tRNAs de Eucalyptus grandis e E. uniflora foram anotados e os tRNAs comuns foram utilizados para o ancoramento dos sRNAs. 479 tRFs foram identificados em pitanga, na maioria com 18 nucleotídeos (nt). Um conjunto de 11 tRFs conservados em ambas espécies, assim como seus alvos, foram avaliados em condições de estresse salino e seca demonstrando diferenças significativas dependendo do tipo de estresse. Os alvos identificados correspondem a genes previamente descritos como envolvidos em estresse salino e seca para outras espécies. O presente trabalho apresenta fortes evidências do envolvimento dos miRNAs em processos de desenvolvimento e estresse, assim como dos tRFs na resposta à seca e estresse salino presente em E. uniflora. Além disso, os dados produzidos poderão ser utilizados em estudos funcionais mais aprofundados que servirão para melhor compreensão dos mecanismos de tolerância presentes nesta importante planta. / Plants being sessile organisms, persistently face adverse environmental perturbations termed as abiotic stresses, most important being drought, soil salinity, extreme temperatures, and heavy metals. They developed several strategies such as tolerance, resistance, and avoidance to minimize stress influence, thus require short-term strategies to quickly and efficiently readapt their metabolism. In this sense, small non coding RNAs are strong candidates to do this kind of fine tune regulation. Next generation sequencing technologies have revealed the key role of these sncRNAs in the transcriptional and posttranscriptional gene-expression regulation. Among the myriad of new sncRNAs, miRNAs are the most known ones and the fragments derived from tRNAs (tRFs) are the newest but with high perspective ones. The miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. In the case of tRFs, they are mainly involved in stress response. Eugenia uniflora L., ‘pitanga’ or Brazilian cherry is a fruit tree native to South America that belongs to Myrtaceae family. It grows in several different harsh environments, including forests, restingas, near the beach, and arid and semiarid environments in the Brazilian northeast. This species is very versatile in terms of adaptability and plays a fundamental role in the maintenance of the shrubby coastal vegetation. However, this species is best-known because its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites with known biological activities present in their leaves and fruits. E. uniflora is a fascinating reservoir of germplasm biodiversity and has great potential as a source of genes for plant breeding. Therefore, understanding the mechanisms conferring stress tolerance will be very useful. In this sense, the objective of this work is to identify sncRNAs (miRNAs and tRFs) by bioinformatic tools and to analyze their expression pattern under stress conditions as well as the genes involved in that response. In chapter 1, DNA, small RNA (sRNA) and RNAseq libraries from leaves were used to identify pre-miRNAs, mature miRNAs and potential targets of these miRNAs, respectively. De novo assembly of the genome identified 38 conserved miRNAs and 28 novel miRNAs. After evaluating their expression pattern, 11 11 conserved miRNAs, including miR156 and miR170, showed significant variation in the natural (restinga habitat) and PEG induced stress. Most of them were previously reported in stress processes. 14 novel miRNAs were evaluated in different tissues of pitanga showing significant variation in the expression pattern. The targets of the last miRNAs were predicted and validated by RT-qPCR. They were transcription factor genes and other genes such as transferases or ATPases and showed the expected opposite pattern to miRNA expression. In Chapter 2, the same libraries were used to identify conserved tRFs in the Myrtaceae family. To do this, the tRNAs of Eucalyptus grandis and E. uniflora were annotated and sRNAs mapped into them. 479 tRFs were identified in pitanga with predominance of those with 18 nucleotide length. 11 conserved tRFs in both species, as well as their targets, were evaluated under saline and drought stress conditions showing significant differences depending on the stress type. The targets were genes previously involved in saline and drought stress for other species. The present work shows strong evidences of the involvement of the miRNAs in the development and stress, as well as the tRFs in the tolerance to drought and saline stress of E. uniflora. In addition, the data could be used in more detailed functional studies that will serve to corroborate and better understand the mechanism of tolerance present in this important plant.

Seca e ferrugem asiática da soja (FAS) são dois dentre os principais estresses abióticos e bióticos que afetam negativamente a produtividade da soja (Glycine max L. Merrill) no mundo inteiro. A base genética da tolerância à seca e da resistência à FAS não são bem conhecidas e esclarecer como ocorre a resposta a estes estresses em soja é ainda um desafio. Atualmente, sabe-se que as plantas adaptam-se a estes estresses por meio da regulação da expressão gênica em nível transcricional e pós-transcricional. Na via da regulação pós-transcricional, microRNAs (miRNAs) têm sido apontados como importantes reguladores em várias plantas sob estresse biótico e abiótico. Entretanto, em soja, não havia sido relatado qualquer miRNA responsivo a estas condições. Neste contexto, nosso objetivo foi identificar novos miRNAs em soja e, também, caracterizar o padrão de expressão de alguns destes miRNAs durante ambos os estresses, além de buscar detectar genes alvos para estes miRNAs. Deste modo, esta tese foi dividida em capítulos, os quais apresentam os diferentes trabalhos desenvolvidos durante o doutorado. No capítulo III estão relatados os resultados da primeira investigação sobre a adequação de miRNAs como genes normalizadores em plantas. A estabilidade da expressão dos miRNAs foi investigada em diferentes tecidos e genótipos de soja, bem como entre estresses biótico e abiótico. Ao final deste trabalho, foram mostradas evidências de que a estabilidade da expressão de miRNAs pode ser maior que a de genes codificadores de proteínas em análises de RT-qPCR. No capítulo IV está descrita a descoberta de novos miRNAs a partir de bibliotecas de deficiência hídrica e FAS em soja, pelo emprego de sequenciamento de alto desempenho (Solexa). Neste estudo, foram detectados 256 miRNAs. Análises de RT-qPCR foram realizadas para alguns dos novos miRNAs, observando-se alguns miRNAs diferencialmente expressos, indicando evidência molecular para um possível envolvimento de miRNAs em processos responsivos à deficiência hídrica e FAS. Para um dos miRNAs detectado, um novo alvo foi validado, correspondendo a um gene codificador de ascorbato oxidase e possivelmente relacionado com a infecção pelo fungo da ferrugem asiática em genótipo suscetível, dados estes apresentados no capítulo V. Esta tese contribui para o aumento de informações sobre miRNAs de plantas, bem como para o entendimento da regulação gênica em soja sob estresses de deficiência hídrica e FAS. / Drought and Asian Soybean Rust (ASR) are the major abiotic and biotic stresses that negatively affect soybean (Glycine max L. Merrill) productivity around the world. The genetic basis of drought tolerance and ASR resistance are not well understood, and clarification on how the response to these stresses occur in soybean is still a challenge. Currently, it is known that adaptation is achieved through the regulation of gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels. In the way of post-transcriptional regulation, microRNAs (miRNAs) have been found to act as key regulator factors in many other plants under biotic and abiotic stresses. However, in soybean there was no report of miRNAs responsive to these conditions. In this context, our goal was to identify new miRNAs in soybean, characterize some of the miRNA expression patterns during both stresses, and try to detect target genes for the miRNAs. In this way, this thesis was divided in chapters which present the different works that were developed during the PhD period. In chapter three, the suitability of miRNAs as housekeeping genes in plants was investigated. MiRNA expression stability was analysed in different soybean tissues and genotypes as well as after abiotic or biotic stress treatments. It was shown that miRNA expression stability can be higher than the expression stability of protein-coding genes by RT-qPCR analysis. In chapter four, new miRNAs were discovered from Solexa deep sequencing of soybeans submitted to water deficit and rust infection. From these analyses 256 miRNAs were detected. RT-qPCRs were performed for some of the new miRNAs and the identification of differentially expressed miRNAs was observed, provinding molecular evidence for the possible involvement of miRNAs in the process of water deficit- and rust-stress responses. For one of the new miRNAs detected by Solexa sequencing, a new target was validated, which is a gene encoding ascorbate oxidase and that seems to be related with soybean rust infection in the genotype susceptible to the fungus (results were presented in chapter five). The present thesis contributes to improve the information about miRNAs in plantas, as well as to the understanding of soybean gene regulation under water deficit and ASR stresses.

As plantas, por serem organismos sésseis, enfrentam persistentemente perturbações ambientais adversas denominadas estresses abióticos, sendo as mais importantes, a seca, a salinidade do solo, as temperaturas extremas e a presença de metais pesados. Em resposta, as plantas desenvolveram mecanismos de tolerância, resistência e prevenção para minimizar a influência do estresse, utilizando estratégias de curto prazo para readaptar rápida e eficientemente seu metabolismo. Neste sentido, os pequenos RNAs não codificantes (sncRNAs) são fortes candidatos para realizar este tipo de regulação. Através do sequenciamento de nova geração revelou-se o papel dos sncRNAs na regulação da expressão gênica em nível transcricional e póstranscricional. Dentre os sncRNAs, os microRNAs (miRNAs) são os mais conhecidos e os fragmentos derivados dos RNAs transportadores (tRFs) são os mais novos e com maiores perspectivas de descobertas futuras. Os miRNAs desempenham papéis regulatórios essenciais tanto no crescimento das plantas quanto no desenvolvimento e resposta ao estresse, enquanto os tRFs, em sua maioria, têm sido associados a respostas de estresse. Eugenia uniflora L., “pitanga” ou a cereja brasileira é uma árvore frutífera nativa da América do Sul que pertence à família Myrtaceae. Ela cresce em diferentes ambientes; florestas, restingas e ambientes áridos e semi-áridos no nordeste brasileiro, sendo uma espécie versátil em termos de adaptabilidade e que desempenha um papel fundamental na manutenção da vegetação costeira arbustiva. Além disso, é muito conhecida por suas propriedades medicinais que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes nas folhas e frutos. E. uniflora representa uma fonte fascinante da biodiversidade do germoplasma e tem um grande potencial como fonte de genes para o melhoramento genético. Portanto, a compreensão dos mecanismos que conferem tolerância ao estresse nesta planta é de particular importância. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é a identificação de sncRNAs (miRNAs e tRFs) por ferramentas de bioinformática e análise do padrão de expressão destes sob condições de estresse abiótico (seca e salinidade), bem como avaliação dos genes envolvidos nesta resposta. No capítulo 1, bibliotecas de DNA, pequenos RNAs (sRNAs) e RNAseq de folhas foram usadas para identificar pre-miRNAs, miRNAs maduros e potenciais alvos destes miRNAs, respectivamente. A montagem de novo do genoma permitiu identificar 38 miRNAs conservados e 28 novos miRNAs. Após a avaliação da expressão destes, 11 conservados, entre eles miR156 e miR170, mostraram variação significativa nas condições de restinga e de estresse induzido por PEG. A maioria deles foram previamente descritos em processos de estresse em outras espécies. 14 novos miRNAs foram avaliados em diferentes tecidos de pitanga mostrando variação significativa no padrão de expressão. Os alvos destes últimos miRNAs foram preditos e validados por RTqPCR. Eles correspondem a genes de fatores de transcrição e outros genes como transferases ou ATPases e demonstraram o padrão esperado oposto à expressão dos miRNAs. No capítulo 2, as mesmas bibliotecas foram usadas para identificar tRFs conservados na família das Myrtaceae. Para isso, os tRNAs de Eucalyptus grandis e E. uniflora foram anotados e os tRNAs comuns foram utilizados para o ancoramento dos sRNAs. 479 tRFs foram identificados em pitanga, na maioria com 18 nucleotídeos (nt). Um conjunto de 11 tRFs conservados em ambas espécies, assim como seus alvos, foram avaliados em condições de estresse salino e seca demonstrando diferenças significativas dependendo do tipo de estresse. Os alvos identificados correspondem a genes previamente descritos como envolvidos em estresse salino e seca para outras espécies. O presente trabalho apresenta fortes evidências do envolvimento dos miRNAs em processos de desenvolvimento e estresse, assim como dos tRFs na resposta à seca e estresse salino presente em E. uniflora. Além disso, os dados produzidos poderão ser utilizados em estudos funcionais mais aprofundados que servirão para melhor compreensão dos mecanismos de tolerância presentes nesta importante planta. / Plants being sessile organisms, persistently face adverse environmental perturbations termed as abiotic stresses, most important being drought, soil salinity, extreme temperatures, and heavy metals. They developed several strategies such as tolerance, resistance, and avoidance to minimize stress influence, thus require short-term strategies to quickly and efficiently readapt their metabolism. In this sense, small non coding RNAs are strong candidates to do this kind of fine tune regulation. Next generation sequencing technologies have revealed the key role of these sncRNAs in the transcriptional and posttranscriptional gene-expression regulation. Among the myriad of new sncRNAs, miRNAs are the most known ones and the fragments derived from tRNAs (tRFs) are the newest but with high perspective ones. The miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. In the case of tRFs, they are mainly involved in stress response. Eugenia uniflora L., ‘pitanga’ or Brazilian cherry is a fruit tree native to South America that belongs to Myrtaceae family. It grows in several different harsh environments, including forests, restingas, near the beach, and arid and semiarid environments in the Brazilian northeast. This species is very versatile in terms of adaptability and plays a fundamental role in the maintenance of the shrubby coastal vegetation. However, this species is best-known because its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites with known biological activities present in their leaves and fruits. E. uniflora is a fascinating reservoir of germplasm biodiversity and has great potential as a source of genes for plant breeding. Therefore, understanding the mechanisms conferring stress tolerance will be very useful. In this sense, the objective of this work is to identify sncRNAs (miRNAs and tRFs) by bioinformatic tools and to analyze their expression pattern under stress conditions as well as the genes involved in that response. In chapter 1, DNA, small RNA (sRNA) and RNAseq libraries from leaves were used to identify pre-miRNAs, mature miRNAs and potential targets of these miRNAs, respectively. De novo assembly of the genome identified 38 conserved miRNAs and 28 novel miRNAs. After evaluating their expression pattern, 11 11 conserved miRNAs, including miR156 and miR170, showed significant variation in the natural (restinga habitat) and PEG induced stress. Most of them were previously reported in stress processes. 14 novel miRNAs were evaluated in different tissues of pitanga showing significant variation in the expression pattern. The targets of the last miRNAs were predicted and validated by RT-qPCR. They were transcription factor genes and other genes such as transferases or ATPases and showed the expected opposite pattern to miRNA expression. In Chapter 2, the same libraries were used to identify conserved tRFs in the Myrtaceae family. To do this, the tRNAs of Eucalyptus grandis and E. uniflora were annotated and sRNAs mapped into them. 479 tRFs were identified in pitanga with predominance of those with 18 nucleotide length. 11 conserved tRFs in both species, as well as their targets, were evaluated under saline and drought stress conditions showing significant differences depending on the stress type. The targets were genes previously involved in saline and drought stress for other species. The present work shows strong evidences of the involvement of the miRNAs in the development and stress, as well as the tRFs in the tolerance to drought and saline stress of E. uniflora. In addition, the data could be used in more detailed functional studies that will serve to corroborate and better understand the mechanism of tolerance present in this important plant.

A transformação genética é uma ferramenta importante para o estudo funcional de genes e obtenção de plantas com novas características agronômicas. A introdução de genes pela engenharia genética requer, para sua expressão otimizada, além de genes de interesse, a utilização de seqüências reguladoras da transcrição (promotores) eficazes. A obtenção de sequências promotoras raiz-específicas seria de grande valia para trabalhos de transformação genética de soja com vista à obtenção de resistência a nematóides e fungos, uma vez que permitiria o direcionamento da expressão de proteínas capazes de combater estes patógenos e outras pragas apenas nos órgãos-alvo do ataque, ou seja, raízes. O presente trabalho relata a caracterização inicial de quatro promotores de soja potencialmente raiz-específicos - GmAQP, GmAS2, GmEXT e GmRB7. A obtenção de raízes transformadas por Agrobacterium rhizogenes é uma ferramenta bastante útil para testar promotores e novos genes de interesse. Para a implementação do método de transformação mediada por A. rhizogenes em nosso laboratório, foram necessárias algumas etapas fundamentais, como a escolha de cultivares mais propícias para a transformação. Neste trabalho, foi identificada a cultivar MG/BR 46 Conquista como a que apresenta maior eficiência de transformação e menor tempo para a produção de raízes transgênicas, dois parâmetros fundamentais para tornar a técnica mais eficiente. A metodologia simples, pouco laboriosa e de rápida obtenção de resultados é essencial para atender as demandas da genômica funcional. O método já está bem estabelecido no laboratório e, além da aplicação na análise de promotores, vem sendo utilizado para testar novos genes candidatos para a transformação da soja e para a localização subcelular de proteínas codificadas pelos genes em estudo. Diversos fatores limitam a maior produtividade da soja, sendo as doenças os mais importantes e difíceis de controlar. Entre os fatores abióticos, a falta de água é responsável pela diminuição da produtividade agrícola, além de restringir as latitudes e os solos onde espécies comercialmente importantes podem ser cultivadas. Com o objetivo de aumentar a resistência a estresses abióticos e bióticos foi introduzido em soja o gene SnOLP, que codifica uma osmotina de Solanum nigrum. Foram obtidas três linhagens transgênicas, todas com uma única cópia do transgene. As análises de gerações segregantes confirmaram a integração estável do transgene. A linhagem B1, proveniente da transformação da cultivar Bragg, apresenta melhores resultados, tanto na resposta a estresses bióticos (fungos) quanto abióticos (seca). Os resultados obtidos no presente estudo mostram que existe potencial para a aplicação do gene SnOLP em estratégias de melhoramento da soja. / Genetic transformation is an important tool for functional studies of genes and generation of plants with new traits. The introduction of genes by genetic engineering requires for its optimal expression, effective transcription regulatory sequences (promoters). Root-specific promoter sequences would be valuable for studies on soybean genetic transformation to obtain nematode and fungal resistance, since they allow the expression of the interest protein in organs usually attacked by diseases - the roots. This thesis reports the initial characterization of four putative root-specific soybean promoters - GmAQP, GmAS2, GmEXT and GmRB7. Transgenic roots transformed by Agrobacterium rhizogenes are useful tool for screening of new promoters and genes of interest. To implement the transformation method mediated by A. rhizogenes in our lab, it was necessary some previous key steps, such as the choice of cultivars more susceptible to the bacteriam infection. MG/BR 46 Conquista cultivar was found to be the most susceptible and can be recommended for A. rhizogenes-mediated transformation experiments. The methodology is simple and fast, essential characteristics to meet the demands of functional genomics. The method is well established in the laboratory and, in addition to analysis of promoters, it has been used to test new genes for soybean transformation and subcellular localization of proteins encoded by the genes under study. Among the many factors that limit soybean yield, diseases are among the most important and difficult to control. Furthermore, the water deficit constrains agricultural productivity, restricting the latitudes and soils where commercially important species can be cultivated. Aiming to obtain increased resistance to abiotic and biotic stresses the osmotin encoding gene (SnOLP) from Solanum nigrum was introduced into soybean cultivars. Three transgenic lines with one transgene copy were obtained. The segregation analysis confirmed the stable integration of SnOLP. In vitro bioassays indicate that B1 transgenic line, derived from Bragg cultivar, was more resistant against economically important pathogenic fungi as well as more tolerant to drought. The results of this study show potential application of SnOLP in strategies for soybean breeding.