Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-01-16T15:52:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1839879 bytes, checksum: d2c436aff7b853ecf204a948d2c41ebc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-16T15:52:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1839879 bytes, checksum: d2c436aff7b853ecf204a948d2c41ebc (MD5) Previous issue date: 2017-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O setor da agroindústria representa a maior fração das divisas na economia brasileira. No entanto, as culturas agronômicas estão sujeitas aos estresses do meio ambiente, incluindo os estresses bióticos (causados por microrganismos, herbívoros ou vírus) e abióticos (disponibilidade de água, nutrientes, presença de agentes estressantes no solo, etc) e eventos de desenvolvimento, como a senescência. No caso de defesa a estresses múltiplos, as plantas ativam uma via de sinalização de morte celular programada (PCD, programmed cell death) mediada pelos fatores de transcrição GmNAC081 e GmNAC030 que pertencem a uma grande família de transfatores específicos de plantas. Foi observado que GmNAC081 está envolvido com o processo de senescência natural e seu silenciamento retarda a senescência foliar e atenua os demais sintomas decorrentes da morte celular programada; porém, o mecanismo bioquímico envolvido não foi totalmente elucidado. Nesta investigação, foi explorada uma abordagem de genômica funcional para avaliar o mecanismo pelo qual GmNAC081 está envolvido em senescência, bem como o efeito da expressão ectópica de GmNAC081 durante o déficit hídrico. As linhagens transgênicas superexpressando o gene GmNAC081 senesceram mais rápido do que as plantas não transformadas. Nas linhagens transgênicas, GmNAC081-1, e GmNAC081-3, a expressão ectópica de GmNAC081 acelerou o amarelecimento foliar que foi associado com maior acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS), comparado com as plantas controles. Enquanto que no estádio V3 (20 dias após germinação), nas linhagens transgênicas, o nível de transcritos de GmNAC081 foi muito superior àqueles de plantas não transformadas BR16, no estádio R7 (80 DAG), a expressão de GmNAC081 endógeno, em BR16, foi induzida pelo processo de senescência, alcançando níveis similares àqueles das linhagens transgênicas. A indução natural de GmNAC081 durante senescência mimetizou o fenótipo da superexpressão do transgene, uma vez que, em clusterização, as sequências expressas durante senescência natural em BR16 agruparam junto com as sequências expressas da linhagem GmNAC081-3 nas plantas em R7. Em contraste, nas plantas em V3, na linhagem transgênica, 1849 e 2813 genes foram induzidos e reprimidos, respectivamente, dos quais 455 genes regulados positivamente e 1200 genes regulados negativamente foram comum ao processo de senescência natural de folhas. Estes resultados indicam que GmNAC081 tem um papel predominante como regulador positivo de senescência foliar natural. Entre os genes regulados positivamente destacam-se alvos diretos de GmNAC081, validando os resultados de RNA-seq. Além disso, foram selecionados adicionais genes candidatos com o potencial de serem modulados por GmNAC081, como JMT, MLO3, NRT1.5, KIN10, KIT1 e SPI, os quais contem sítios de ligação para o gene GmNAC081 nos seus promotores. Estes resultados ampliaram a atividade transcricional de GmNAC081 em escala genômica, identificando um conjunto de possíveis alvos diretos que atuam para estabelecimento do processo de senescência. Também foi avaliado o efeito da superexpressão do gene GmNAC081 em resposta ao déficit hídrico. As plantas superexpressando GmNAC081 foram mais sensitivas ao déficit hídrico, apresentando menor teor de água e menor potencial hídrico, sob o mesmo regime de déficit hídrico, que as plantas não transformadas, o que foi associado com um fenótipo de senescência acelerada induzida por seca. Além disso, os parâmetros fisiológicos de trocas gasosas e de fluorescência monitorados durante o déficit demostraram a maior sensitividade das plantas transgênicas à seca. Coletivamene, os resultados dessa investigação descreveram a atividade transcricional de GmNAC081 em escala genômica e demonstraram que GmNAC081 exerce uma função positiva predominante no estabelecimento de senescência natural e regula negativamente a tolerância de plantas à seca. / In Brazil, the agribusiness contributes considerably to economy. However, the crops are exposed to environmental stresses, including biotic stresses, which are caused by microorganisms, herbivores or viruses, as well as abiotic stresses caused by water deficit, nutrient depravation, presence of stressing agents in the soil, etc. In the case of defense to multiple stresses, the plants activate a programmed cell death (PCD) signaling mediated by GmNAC081 and GmNAC030 proteins, which belong to a large family of plant-specific transcriptional factors. Recently, GmNAC081 has been demonstrated to play a positive role in natural leaf senescence, as GmNAC081 silencing delays leaf senescence and attenuates the hallmarks of PCD, although the underlying mechanism has not been totally elucidated. In this investigation, a functional genomic approach was exploited to evaluate the mechanism by which GmNAC081 mediates senescence, as well as the effect of ectopic expression of GmNAC081 during water deficit. The GmNAC081-overexpressing lines displayed accelerated senescence as compared to wild type, untransformed plants. In the transgenic lines, GmNAC081-1 and GmNAC081-3, the ectopic expression of GmNAC081 accelerated leaf yellowing, which was associated with a greater accumulation of ROS, as compared to control lines. While in V3 plants (20 days after germination (20 DAG)), in the transgenic lines, the transcript levels of GmNAC081 were much greater that those of untransformed plants, BR16, in R7 plants (80 DAG), the expression of endogenous GmNAC081 in BR16 was induced by senescence, reaching similar levels as the transgenic lines. The natural induction of GmNAC081 during senescence mimicked the phenotype of transgene overexpression because the expressed sequences during natural senescence in BR16 clustered together with the expressed sequences of the GmNAC081-3 line in plants at R7. In contrast, in V3 plants, in the transgenic line, 1849 and 2813 genes were induced and repressed, respectively; among those, 455 up-regulated genes and 1200 downregulated genes were common to the process of leaf senescence. These results indicate that GmNAC081 plays a major role as a positive regulator of natural leaf senescence. Among the up-regulated genes, direct targets of GmNAC081 were highlighted, validating the results of RNA-seq. Furthermore, additional candidate genes were selected with the potential to be modulated directly by GmNAC081, including JMT, MLO3, NRT1.5, KIN10, KIT1 e SPI, which contain GmNAC081 binding sites on their promoter. These results amplified the transcriptional activity of GmNAC081, as they identified a set of possible direct target genes, which function in the onset of senescence. The effect of GmNAC081 overexpression in response to water deficit was also examined. GmNAC081-overexpressing plants were more sensitive to water stress, as they displayed a lower water potential and relative water content than untransformed plants under the same regime of water deficit, which was associated with a drought-induced accelerated senescence phenotype. Furthermore, gas exchange and fluorescence physiological parameters during water deficit confirmed the greater sensitivity of transgenic lines to drought. Collectively, our results described the widegenomics transcriptional activity of GmNAC081, demonstrating that GmNAC081 plays a major positive role in leaf senescence and a negative role in water deficit tolerance.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-04-11T17:03:14Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1099922 bytes, checksum: 4c4509be233e17026dd5d46967dd54c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T17:03:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1099922 bytes, checksum: 4c4509be233e17026dd5d46967dd54c3 (MD5) Previous issue date: 2017-07-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A técnica de condicionamento osmótico é empregada visando diminuir o período entre a semeadura e a emergência de plântulas em campo, bem como favorecer o desempenho das sementes frente às condições de estresse. Nesse contexto, o objetivo do estudo foi avaliar a tolerância ao estresse térmico durante a germinação de sementes de girassol osmocondicionadas com diferentes níveis de vigor. Para isso, foram utilizados três lotes de sementes de girassol do cultivar Helio 250. Inicialmente, as sementes foram avaliadas pelos testes de germinação e de vigor para caracterização dos lotes. Em seguida, foram osmocondicionadas com PEG 6000 a -2,0 MPa, a 15 °C por 8 h e submetidas aos testes de qualidade fisiológica e atividade enzimática em três temperaturas: 15 °C (sub ótima), 25 °C (ótima) e 35 °C (supra ótima). Pelos testes de qualidade fisiológica, os lotes 1, 2 e 3 foram classificados em três níveis diferentes de vigor, sendo alto, médio e baixo vigor, respectivamente. O condicionamento osmótico favoreceu o desempenho das sementes do lote de menor vigor quanto à germinação e emergência de plântulas em todas as temperaturas avaliadas. Houve efeito positivo na velocidade de germinação das sementes dos lotes de médio e baixo vigor, avaliada pela primeira contagem de germinação e índice de velocidade de emergência, em todas as temperaturas. O comprimento de plântulas não foi afetado pelo condicionamento osmótico, ao passo que houve efeito positivo na massa seca de plântulas em todas as temperaturas nos lotes de melhor qualidade fisiológica. De maneira geral, as atividades das enzimas antioxidantes (SOD, CAT, POX e APX) aumentaram com o condicionamento osmótico, efeito observado principalmente nas sementes de menor vigor, nas temperaturas sub e supra ótima. O condicionamento osmótico das sementes de girassol foi eficiente para melhorar o desempenho do lote de menor vigor sob temperatura sub e supra ótima, favorecendo o aumento da atividade das enzimas do sistema antioxidante. / Priming technique is used to reduce the period between sowing and emergence of seedlings in field, as well improve the performance of seeds under stress conditions. The objective of the study was to evaluate the thermal stress tolerance during the germination of osmoprimed sunflower seeds with different level of vigor. Three lots of sunflower seeds of Helio 250 cultivar were used. Firstly, seeds were evaluated by germination and vigor tests to characterize lots. Then, they were primed with PEG 6000 -2,0 MPa at 15 °C for 8 h and submitted to physiological quality tests and enzymatic activity evaluations under three temperatures: 15 °C (sub optimal), 25 °C (optimum) and 35 °C (supra optimal). Based on the physiological quality tests, lots 1, 2 and 3 were classified into three different levels of vigor, such as high, medium and low vigor, respectively. Priming improved the germination and seedling emergence of the lower vigor seeds at all evaluated temperatures. There was a positive effect on seed germination and speed of the germination for medium and low vigor seed lots, evaluated by the first count germination and emergence speed index at all temperatures. Seedling length was not affected by priming while there was a positive effect of priming on seedling dry weight at all temperatures in the lots of higher physiological quality. In general, activity of antioxidative enzymes (SOD, CAT, POX and APX) increased with priming and this effect was observed mainly in seeds of lower vigor, in sub and supra optimal temperatures. Priming of sunflower seeds was efficient to improve the performance of the lower vigor lot under sub and supra optimal temperature, promoting increases in the activity of antioxidant system enzymes.

A ascorbato peroxidase (APX) é uma das principais enzimas do sistema de detoxificação de espécies reativas de oxigênio (ERO) em plantas, catalisando a conversão do peróxido de hidrogênio em água usando o ascorbato como doador de elétrons. No arroz, oito genes codificam APX. O presente estudo teve como objetivo avaliar o papel das enzimas de APXs em arroz, através da determinação das localizações subcelulares das diferentes isoformas, do estudo da expressão gênica e da caracterização detalhada do efeito do silenciamento das isoformas cloroplastídicas (chlAPXs) no metabolismo da planta, em condições normais e na resposta à estresses abióticos. A expressão diferencial das diferentes isoformas de APXs em condições de estresses abióticos varia entre as espécies e com a intensidade e duração do estresse. A localização subcelular de OsAPX1 e OsAPX2 no citosol, OsAPX3 e OsAPX4 nos peroxissomos, OsAPX5 no cloroplasto/mitocôndria, OsAPX6 na mitocôndria e OsAPX7 no cloroplasto foram confirmadas em protoplastos de arroz. Plantas duplamente silenciadas para os genes OsAPX7/OsAPX8 não apresentam alterações fenotípicas, no entanto possuem alterações no metabolismo antioxidante sob condições normais de crescimento. Análises proteômicas dessas plantas revelaram que várias rotas importantes foram afetadas, especialmente proteínas envolvidas com processos fotossintéticos. Plantas silenciadas submetidas a estresse de alta luz (HL) e metil viologênio (MV) mostraram que as chlAPXs são importantes na proteção antioxidante em arroz. Alterações como fotodanos, fotoinibição e bloqueio do transporte de elétrons foram observadas nas plantas silenciadas submetidas a estresses abióticos, gerando grandes distúrbios na atividade fotoquímica. No entanto, sob alta luz as chlAPXs parecem não serem essenciais para a proteção de fotodanos, fotoinibição e danos oxidativos dirigidos pela alta luz no fotossistema II. Plantas silenciadas e não-transformadas (NT) exibem diferenças na fotossíntese sob condições normais de crescimento, bem como quando submetidas a estresses abióticos. / Ascorbate peroxidase (APX) is a major enzyme of the Reactive Oxygen Species (ROS) detoxification system in plants, catalyzing the conversion of hydrogen peroxide into water using ascorbate as electron donor. In rice eight genes encode APX. This study aimed to evaluate the role of APX enzymes in rice, through subcellular localization of the different isoforms, the study of gene expression and detailed characterization of chloroplastic APXs (chlAPXs) silencing in plant metabolism under normal conditions and in response to abiotic stresses. The differential expression of the different isoforms of APXs under abiotic stress conditions varies among species, and depends on the intensity and duration of stress. The subcellular localization of OsAPX1 and OsAPX2 in cytosol, OsAPX3 and OsAPX4 in peroxisomes, OsAPX5 in cloroplast/mitochondria, OsAPX6 in mitochondria and OsAPX7 in chloroplast were confirmed in rice protoplasts. Double silenced plants in OsAPX7/OsAPX8 genes did not show phenotypic changes; however presented alterations in the antioxidant metabolism under normal growth conditions. Proteomic analysis revealed that in theses plants several important pathways were affected, especially proteins involved with photosynthetic process. Silenced plants subjected to high light (HL) and methyl viologen (MV) stresses show that the chlAPXs are important in the antioxidant protection in rice. Alterations such photodamage, photoinhibition and obstruction of the electron transport were observed in silenced plants subjected to abiotic stresses, generating great disturbances in photochemical activity. However, under high light the chlAPXs appear not be essential to the protection of photodamage, photoinhibition and oxidative damage triggered by HL in photosystem II (PSII). Silenced and non-transformed (NT) plants exhibit differences in photosynthesis under normal growth conditions, as well as, when subjected to abiotic stress.

Soja, uma cultura conhecida por sua importância econômica e nutricional, tem sido objeto de vários estudos que avaliam o impacto e as respostas efetivas das plantas aos estresses abióticos. O estresse salino é um dos principais estresses ambientais e afeta negativamente o crescimento e o rendimento das culturas, incluindo a soja. A edição de RNA é um processo pelo qual as sequências de nucleotídeos podem ser alteradas, revertendo mutações que podem mudar as sequências de proteínas para manter suas funções conservadas. As proteínas pentatricopeptide repeat (PPRs) são trans-elementos de edição caracterizados por reconhecer cis-elementos específicos de RNA e realizar a reação de edição. Vários estudos descreveram estes trans-elementos e seus sítios de edição cognatos, mas nem todas as proteínas que compõem o complexo de edição foram identificadas. A perda de eventos de edição de plastídios, resultante de mutações em fatores de edição de RNA ou através de interferência por estresse, leva a alterações de desenvolvimento, de fisiologia e da fotossíntese. O objetivo do presente trabalho é caracterizar os sítios de edição e os fatores associados à edição de RNA em Glycine max e a influência de estresses abióticos no processo de edição de RNA em cloroplastos. No capítulo 1, um método é apresentado para triar a edição de RNA de cloroplasto usando bibliotecas públicas de sRNAs de Arabidopsis, soja e arroz. Entre os sítios de edição previstos, 40,57, 34,78 e 25,31% foram confirmados utilizando sRNAs de Arabidopsis, soja e arroz, respectivamente. A análise de SNPs revelou alterações de C-to-U de 58,2, 43,9 e 37,5% nas respectivas espécies e identificou conhecidas e possíveis novas edições de RNA de adenosina para inosina (A-to-I) em tRNAs. O método e os dados revelam o potencial do uso de sRNA como uma fonte confiável para identificar novos e confirmar sítios de edição conhecidos. No capítulo 2, o processo de edição de RNA foi avaliado em cloroplastos de plantas de soja sob estresse salino. A abordagem de bioinformática utilizando bibliotecas de sRNAs e mRNAs foi empregada para detectar sítios específicos que mostram diferenças na taxa de edição. RT-qPCR foi usado para medir a taxa de edição nos sítios selecionados. Observamos diferenças nas taxas de edição nos transcritos dos genes ndhA, ndhB, rps14 e rps16 ao comparar os dados das bibliotecas controle e das tratadas com NaCl. Os ensaios de RT-qPCR 9 demonstraram um aumento na edição dos genes selecionados. Esses aumentos podem ser uma resposta para manter a homeostase das funções das proteínas do cloroplasto em resposta ao estresse salino. No capítulo 3, para identificar os fatores relacionados aos sítios de edição analisados, sondas biotiniladas de RNA foram projetadas com base nos sítios de edição de RNA de plastídio de soja para realizar um isolamento proteico específico do fator de edição. Proteínas que interagiram com as sondas foram isoladas através da ligação das sondas à biotina e foram identificadas utilizando espectrometria de massa. Entre os peptídeos detectados, cinco corresponderam a proteínas PPR. A comparação dos genes de Arabidopsis com as proteínas PPR da soja permitiu a identificação dos homólogos mais próximos. O presente estudo representa a primeira identificação do conjunto de sítios de edição de RNA, de fatores associados aos sítios de edição de RNA e a caracterização dos efeitos do estresse abiótico na edição de RNA em Glycine max. / Soybean, a crop known by its economic and nutritional importance, has been the subject of several studies that assess the impact and the effective plant responses to abiotic stresses. Salt stress is one of the main environmental stresses and negatively impacts crop growth and yield. RNA editing is a process whereby nucleotide sequences can be altered, reverting mutations that could change protein sequences to maintain their conserved functions. Pentatricopeptide repeat proteins are editing trans-elements characterized by recognize specific RNA cis-elements and perform the editing reaction. Several studies have described these trans-elements and their cognate editing sites, but not all proteins that compose the editing complex were identified. The loss of plastid editing events, resulting from mutations in RNA editing factors or through stress interference, leads to developmental, physiological and photosynthetic alterations. The aim of the present work is to characterize the editing sites and factors associated with RNA editing in Glycine max and the influence of abiotic stresses on the process of RNA editing in chloroplasts. In chapter 1, a method is presented to screen chloroplast RNA editing using public sRNA libraries from Arabidopsis, soybean and rice. Among the predicted editing sites, 40.57, 34.78, and 25.31% were confirmed using sRNAs from Arabidopsis, soybean and rice, respectively. SNP analysis revealed 58.2, 43.9, and 37.5% new C-to-U changes in the respective species and identified known and new putative adenosine to inosine (A-to-I) RNA editing in tRNAs. The method and data reveal the potential of sRNA as a reliable source to identify new and confirm known editing sites. In chapter 2, RNA editing process was evaluated in the chloroplast of soybean plants under salt stress. Bioinformatics approach using sRNA and mRNA libraries was employed to detect specific sites showing differences in editing efficiency. RT-qPCR was used to measure editing efficiency at selected sites. We observed differences in ndhA, ndhB, rps14 and rps16 editing rates between control and salt-treated libraries. RT-qPCR assays demonstrated an increase in editing efficiency of selected genes. These increases can be a response to keep the homeostasis of chloroplast protein functions in response to NaCl stress. In chapter 3, to identify the trans-acting factors of editing sites analyzed, we have designed RNA biotinylated probes based in soybean plastid RNA editing sites to perform 11 specific isolation of proteins associated to editosomes. Proteins that interacted with the probes were isolated by binding the probes to biotin and were identified using mass spectrometry. Among the detected peptides, five corresponded to PPR proteins. Comparison of Arabidopsis genes to the soybean PPR proteins allow identification of the closest related homologs. The present study represents the first identification of RNA editing sites set, associated factors to RNA editing sites and characterization of effects from abiotic stress in RNA editing in Glycine max.

Soja, uma cultura conhecida por sua importância econômica e nutricional, tem sido objeto de vários estudos que avaliam o impacto e as respostas efetivas das plantas aos estresses abióticos. O estresse salino é um dos principais estresses ambientais e afeta negativamente o crescimento e o rendimento das culturas, incluindo a soja. A edição de RNA é um processo pelo qual as sequências de nucleotídeos podem ser alteradas, revertendo mutações que podem mudar as sequências de proteínas para manter suas funções conservadas. As proteínas pentatricopeptide repeat (PPRs) são trans-elementos de edição caracterizados por reconhecer cis-elementos específicos de RNA e realizar a reação de edição. Vários estudos descreveram estes trans-elementos e seus sítios de edição cognatos, mas nem todas as proteínas que compõem o complexo de edição foram identificadas. A perda de eventos de edição de plastídios, resultante de mutações em fatores de edição de RNA ou através de interferência por estresse, leva a alterações de desenvolvimento, de fisiologia e da fotossíntese. O objetivo do presente trabalho é caracterizar os sítios de edição e os fatores associados à edição de RNA em Glycine max e a influência de estresses abióticos no processo de edição de RNA em cloroplastos. No capítulo 1, um método é apresentado para triar a edição de RNA de cloroplasto usando bibliotecas públicas de sRNAs de Arabidopsis, soja e arroz. Entre os sítios de edição previstos, 40,57, 34,78 e 25,31% foram confirmados utilizando sRNAs de Arabidopsis, soja e arroz, respectivamente. A análise de SNPs revelou alterações de C-to-U de 58,2, 43,9 e 37,5% nas respectivas espécies e identificou conhecidas e possíveis novas edições de RNA de adenosina para inosina (A-to-I) em tRNAs. O método e os dados revelam o potencial do uso de sRNA como uma fonte confiável para identificar novos e confirmar sítios de edição conhecidos. No capítulo 2, o processo de edição de RNA foi avaliado em cloroplastos de plantas de soja sob estresse salino. A abordagem de bioinformática utilizando bibliotecas de sRNAs e mRNAs foi empregada para detectar sítios específicos que mostram diferenças na taxa de edição. RT-qPCR foi usado para medir a taxa de edição nos sítios selecionados. Observamos diferenças nas taxas de edição nos transcritos dos genes ndhA, ndhB, rps14 e rps16 ao comparar os dados das bibliotecas controle e das tratadas com NaCl. Os ensaios de RT-qPCR 9 demonstraram um aumento na edição dos genes selecionados. Esses aumentos podem ser uma resposta para manter a homeostase das funções das proteínas do cloroplasto em resposta ao estresse salino. No capítulo 3, para identificar os fatores relacionados aos sítios de edição analisados, sondas biotiniladas de RNA foram projetadas com base nos sítios de edição de RNA de plastídio de soja para realizar um isolamento proteico específico do fator de edição. Proteínas que interagiram com as sondas foram isoladas através da ligação das sondas à biotina e foram identificadas utilizando espectrometria de massa. Entre os peptídeos detectados, cinco corresponderam a proteínas PPR. A comparação dos genes de Arabidopsis com as proteínas PPR da soja permitiu a identificação dos homólogos mais próximos. O presente estudo representa a primeira identificação do conjunto de sítios de edição de RNA, de fatores associados aos sítios de edição de RNA e a caracterização dos efeitos do estresse abiótico na edição de RNA em Glycine max. / Soybean, a crop known by its economic and nutritional importance, has been the subject of several studies that assess the impact and the effective plant responses to abiotic stresses. Salt stress is one of the main environmental stresses and negatively impacts crop growth and yield. RNA editing is a process whereby nucleotide sequences can be altered, reverting mutations that could change protein sequences to maintain their conserved functions. Pentatricopeptide repeat proteins are editing trans-elements characterized by recognize specific RNA cis-elements and perform the editing reaction. Several studies have described these trans-elements and their cognate editing sites, but not all proteins that compose the editing complex were identified. The loss of plastid editing events, resulting from mutations in RNA editing factors or through stress interference, leads to developmental, physiological and photosynthetic alterations. The aim of the present work is to characterize the editing sites and factors associated with RNA editing in Glycine max and the influence of abiotic stresses on the process of RNA editing in chloroplasts. In chapter 1, a method is presented to screen chloroplast RNA editing using public sRNA libraries from Arabidopsis, soybean and rice. Among the predicted editing sites, 40.57, 34.78, and 25.31% were confirmed using sRNAs from Arabidopsis, soybean and rice, respectively. SNP analysis revealed 58.2, 43.9, and 37.5% new C-to-U changes in the respective species and identified known and new putative adenosine to inosine (A-to-I) RNA editing in tRNAs. The method and data reveal the potential of sRNA as a reliable source to identify new and confirm known editing sites. In chapter 2, RNA editing process was evaluated in the chloroplast of soybean plants under salt stress. Bioinformatics approach using sRNA and mRNA libraries was employed to detect specific sites showing differences in editing efficiency. RT-qPCR was used to measure editing efficiency at selected sites. We observed differences in ndhA, ndhB, rps14 and rps16 editing rates between control and salt-treated libraries. RT-qPCR assays demonstrated an increase in editing efficiency of selected genes. These increases can be a response to keep the homeostasis of chloroplast protein functions in response to NaCl stress. In chapter 3, to identify the trans-acting factors of editing sites analyzed, we have designed RNA biotinylated probes based in soybean plastid RNA editing sites to perform 11 specific isolation of proteins associated to editosomes. Proteins that interacted with the probes were isolated by binding the probes to biotin and were identified using mass spectrometry. Among the detected peptides, five corresponded to PPR proteins. Comparison of Arabidopsis genes to the soybean PPR proteins allow identification of the closest related homologs. The present study represents the first identification of RNA editing sites set, associated factors to RNA editing sites and characterization of effects from abiotic stress in RNA editing in Glycine max.

A ascorbato peroxidase (APX) é uma das principais enzimas do sistema de detoxificação de espécies reativas de oxigênio (ERO) em plantas, catalisando a conversão do peróxido de hidrogênio em água usando o ascorbato como doador de elétrons. No arroz, oito genes codificam APX. O presente estudo teve como objetivo avaliar o papel das enzimas de APXs em arroz, através da determinação das localizações subcelulares das diferentes isoformas, do estudo da expressão gênica e da caracterização detalhada do efeito do silenciamento das isoformas cloroplastídicas (chlAPXs) no metabolismo da planta, em condições normais e na resposta à estresses abióticos. A expressão diferencial das diferentes isoformas de APXs em condições de estresses abióticos varia entre as espécies e com a intensidade e duração do estresse. A localização subcelular de OsAPX1 e OsAPX2 no citosol, OsAPX3 e OsAPX4 nos peroxissomos, OsAPX5 no cloroplasto/mitocôndria, OsAPX6 na mitocôndria e OsAPX7 no cloroplasto foram confirmadas em protoplastos de arroz. Plantas duplamente silenciadas para os genes OsAPX7/OsAPX8 não apresentam alterações fenotípicas, no entanto possuem alterações no metabolismo antioxidante sob condições normais de crescimento. Análises proteômicas dessas plantas revelaram que várias rotas importantes foram afetadas, especialmente proteínas envolvidas com processos fotossintéticos. Plantas silenciadas submetidas a estresse de alta luz (HL) e metil viologênio (MV) mostraram que as chlAPXs são importantes na proteção antioxidante em arroz. Alterações como fotodanos, fotoinibição e bloqueio do transporte de elétrons foram observadas nas plantas silenciadas submetidas a estresses abióticos, gerando grandes distúrbios na atividade fotoquímica. No entanto, sob alta luz as chlAPXs parecem não serem essenciais para a proteção de fotodanos, fotoinibição e danos oxidativos dirigidos pela alta luz no fotossistema II. Plantas silenciadas e não-transformadas (NT) exibem diferenças na fotossíntese sob condições normais de crescimento, bem como quando submetidas a estresses abióticos. / Ascorbate peroxidase (APX) is a major enzyme of the Reactive Oxygen Species (ROS) detoxification system in plants, catalyzing the conversion of hydrogen peroxide into water using ascorbate as electron donor. In rice eight genes encode APX. This study aimed to evaluate the role of APX enzymes in rice, through subcellular localization of the different isoforms, the study of gene expression and detailed characterization of chloroplastic APXs (chlAPXs) silencing in plant metabolism under normal conditions and in response to abiotic stresses. The differential expression of the different isoforms of APXs under abiotic stress conditions varies among species, and depends on the intensity and duration of stress. The subcellular localization of OsAPX1 and OsAPX2 in cytosol, OsAPX3 and OsAPX4 in peroxisomes, OsAPX5 in cloroplast/mitochondria, OsAPX6 in mitochondria and OsAPX7 in chloroplast were confirmed in rice protoplasts. Double silenced plants in OsAPX7/OsAPX8 genes did not show phenotypic changes; however presented alterations in the antioxidant metabolism under normal growth conditions. Proteomic analysis revealed that in theses plants several important pathways were affected, especially proteins involved with photosynthetic process. Silenced plants subjected to high light (HL) and methyl viologen (MV) stresses show that the chlAPXs are important in the antioxidant protection in rice. Alterations such photodamage, photoinhibition and obstruction of the electron transport were observed in silenced plants subjected to abiotic stresses, generating great disturbances in photochemical activity. However, under high light the chlAPXs appear not be essential to the protection of photodamage, photoinhibition and oxidative damage triggered by HL in photosystem II (PSII). Silenced and non-transformed (NT) plants exhibit differences in photosynthesis under normal growth conditions, as well as, when subjected to abiotic stress.

Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-10T19:47:28Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Definitiva completa corrigida Rebeca.pdf: 9019274 bytes, checksum: 67e0a3de6025215bb0dc15d5ec51bb9e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-10T19:47:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Definitiva completa corrigida Rebeca.pdf: 9019274 bytes, checksum: 67e0a3de6025215bb0dc15d5ec51bb9e (MD5) Previous issue date: 2012 / CNPQ / Moringa oleifera é uma arbórea, tolerante à seca e a solos pobres, no semiárido nordestino, compreendendo uma alternativa para os sertanejos que vivem a nível de subsistência. É principalmente utilizada na limpeza de água por apresentarem propriedades coagulantes e floculantes. As sementes apresentam destacado valor comercial contendo alto teor de óleo com qualidades ímpares para produção de biocombustível. Estudos recentes indicam que quando a planta sofre uma exposição prévia a um estresse, ela tem a capacidade de responder mais rápido e com mais vigor a um evento de estresse recorrente, esse fenômeno é conhecido como endurecimento (hardening). Isso implica que as plantas tem a capacidade de memória (stress imprint). O objetivo do trabalho foi avaliar se plantas jovens de Moringa oleifera são capazes de carregar na memória estresses hídricos recorrentes ocorridos desde a germinação das sementes até o porte de plantas jovens e com isso apresentar maior tolerância à seca. As sementes foram germinadas em baixos potenciais osmóticos 0,0; - 0,1; - 0,2; - 0,3; - 0,4 e - 0,5 MPa. Foram utilizadas plantas jovens com 50 dias após a emergência, originadas da germinação de três potenciais osmóticos 0,0; - 0,3 e - 0,4 MPa. Para cada tratamento de germinação houve dois regimes hídricos: as irrigadas (100% da capacidade de pote) e as estressadas (10% da capacidade de pote), totalizando seis tratamentos. Foram realizados dois ciclos de déficit hídrico intercalados por 10 dias de reidratação. Foram analisados os parâmetros de germinação, trocas gasosas, bioquímica, enzimática e biometria. As sementes de M. oleifera não germinaram em potenciais osmóticos menores que - 0,4 MPa. As plantas jovens de M. oleifera foram tolerantes aos ciclos recorrentes de seca em decorrência do alto o conteúdo hídrico relativo (CHR), da alta eficiência do uso de água (EUA), da manutenção no conteúdo de clorofila, da síntese de novos aminoácidos, além do aumento da atividade de enzimas antioxidantes e de carotenóides. Após o primeiro ciclo a taxa fotossintética foi recuperada rapidamente, indicando a preservação do metabolismo mesofílico. As plantas estressadas provenientes do tratamento - 0,3 e - 0,4 MPa apresentaram maior tolerância ao déficit hídrico do que as plantas estressadas provenientes do tratamento 0,0 MPa. Sugerindo que as sementes submetidas a um estresse prévio, no período germinativo, tem a capacidade de adquirir memória à seca, possibilitando à M. oleifera uma maior tolerância a ciclos recorrentes.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-06T19:10:05Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertacao-CinthyaPacheco.pdf: 4196314 bytes, checksum: 681027684434d14d4010bb477d291988 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-06T19:10:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertacao-CinthyaPacheco.pdf: 4196314 bytes, checksum: 681027684434d14d4010bb477d291988 (MD5) Previous issue date: 2012-03-02 / A salinidade dos solos é um fator limitante para o desenvolvimento da cultura da cana-de-açúcar no Brasil, porém as plantas em geral apresentam mecanismos de tolerância variável ao estresse por salinidade. Nestes, pode haver alterações na expressão gênica que se tornam importantes objetos de estudo, que pode ser realizado através de análise proteômica. Assim,o objetivo do trabalho foi identificar peptídeos diferencialmente expressos em plantas de cana-de-açúcar submetidas ao estresse salino. Para tal, foi conduzido experimento em casa de vegetação com quatro variedades de cana-de-açúcar (RB867515, RB92579, RB72454 e RB855536) e duas condições salinas, 0 mM (controle) e 200 mM de NaCl. As coletas foram realizadas após 2 e 72 h da indução ao estresse por sal, tanto para as análises fisiológicas quanto para a análise proteômica. Os parâmetros fisiológicos avaliados foram: vazamento foliar de eletrólitos, potencial hídrico foliar, teor relativo de água, transpiração, fotossíntese e condutância estomática. Para a análise proteômica,as proteínas totais da folha +1 e raízes foram extraídas, quantificadas e analisadas por eletroforese bidimensional. A análise das imagens dos géis foi realizada em programa computacional onde em cada contraste apenas uma variável foi considerada (condição salina ou variedade). Spots diferenciais foram excisados, digeridos com tripsina e somente os de raiz foram identificados via espectrometria de massas. De acordo com os parâmetros fisiológicos, foram selecionadas as variedades RB855536 como a mais sensível à salinidade e a RB867515 como a mais tolerante. Foram observados peptídeos diferencialmente expressos distribuídos nos contrastes em ambas as variáveis (condição salina ou variedade) e órgãos estudados, categorizados por processo biológico e função molecular através de sua ontologia gênica.A variedade tolerante (RB867515) mostrou maior acúmulo de proteínas envolvidas com crescimento, desenvolvimento, metabolismo de carboidratos e energético após 2 h de estresse,indicando que nessas plantas a detecção do fator de estresse parece ativar sinalização para continuar o crescimento radicular, evitando regiões com excesso de íons tóxicos. Por outro lado, foi verificada na variedade sensível a presença dessas proteínas apenas no tratamento após 72 h. Em adição, proteínas envolvidas na metabolização de radicais livres, proteção de proteínas e estabilização de membranas tiveram sua expressão induzida na fase inicial de exposição ao estresse na variedade tolerante, enquanto que na sensível essas proteínas só foram expressas no tratamento após 72 h. Tais resultados sugerem que essas vias de resposta ao estresse são mais eficientes para conferir maior tolerância à salinidade em cana-de-açúcar, e que sua efetividade para a tolerância fenotípica depende da detecção do estresse e ativação precoce da expressão dos genes codificantes. / Soil salinity is a limiting factor to sugarcanecrop development in Brazil, although in general plants present variable mechanisms of tolerance to salinity stress. In these, gene expression changes become important study focus, that can be performed through proteomic analysis. Thus, the objective of this work was to identify differentially expressed peptides in sugarcane plants submitted to salinity stress. For that, a greenhouse experiment was established with four sugarcane varieties (RB867515, RB92579, RB72454 and RB855536) and two salt conditions, 0mM (control) and 200 mM NaCl. Harvests occurred after 2 and 72 h of stress induction by salt, for physiological analyses as well as for proteomics.The evaluated physiological parameters were: leaf electrolytes leakage, leaf water potential, relative water content, transpiration, photosynthesisand stomatal conductance. In proteomic analysis, total proteins from leaf and roots were extracted, quantified and analysed through bidimensional electrophoresis. Gel images analyses were done computational program,where in each contrast only one variable was considered (salinity conditionor variety). Differential spotswere excised, digested by trypsin and only the root-derived were identified via mass spectrometry.According to the physiological parameters, were selected the varieties RB855536 as the most sensitive to salinity, and the RB867515 as the most tolerant. Differentially expressed peptides were observed distributed in the contrasts in both variables (salinity condition or variety) and sampled organs, organised in gene ontology categories by biologicalprocess and molecular function. Tolerant variety (RB867515) showed the highest accumulation of proteins involved in growth, development, carbohydrate and energy metabolism after 2 h of stress, indicating that in such plants the detection of stressing factor seems to activate signaling pathways towards keeping root growth, avoiding regions with toxic ions excess. On the other hand, the presence of these proteins in the sensitive variety was verified only in treatment after 72 h.In addition, proteins involved in free radicals metabolization, protein protection and membrane stabilization had their expression induced in the initial phase of stress exposure in tolerant variety, while in sensitive one these proteins were expressed only in treatment after 72h. Such results suggest that these stress response pathways are more efficient to confer higher tolerance to salinity in sugarcane, and their effectiveness for phenotypical tolerance depends on stress detection and early activation of the coding genes expression.

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:35:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_9513_Ana Paula Câmara da Silva 2016.pdf: 1448368 bytes, checksum: 2155c11e7e1ddbea3cfad80bc3ebe79d (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / CÂMARA, Ana Paula. Influência de distúrbios abióticos na qualidade da madeira de eucalipto para produção de celulose. 2016. Dissertação (Mestrado em Ciências Florestais) Universidade Federal do Espírito Santo, Jerônimo Monteiro ES. Orientador: Prof. D. Sc. José Tarcísio da Silva Oliveira, Coorientadora: Profª. D. Sc. Graziela Baptista Vidaurre. A sustentabilidade produtiva da eucaliptocultura é ameaçada quando ocorrem doenças e desordens de crescimento, que podem ser de origem abiótica e, comprometer a qualidade da madeira, decorrentes das adversas condições ambientais. Com isso, teve-se por objetivo avaliar a influência de diferentes níveis de distúrbios abióticos na madeira de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla para produção de polpa celulósica e, agrupá-los de acordo com as similaridades das variáveis. Foram coletadas árvores aos 7 anos de idade, nos municípios de Imperatriz e Vila Nova dos Martírios, Maranhão, Brasil e, classificadas conforme severidade dos sintomas visualmente observados. Os resultados das caracterizações dendrométrica, anatômica, química e densidade, bem como parâmetros de polpação Kraft da madeira foram comparados, e permitiram concluir que a intensidade dos sintomas de distúrbios alterou a qualidade da madeira para celulose. Destaca-se que, para o nível mais severo de distúrbio, foram obtidos os melhores resultados para variáveis dendrométricas, densidade básica, diâmetro vascular, fibras e consumo específico de madeira. Não foram observadas diferenças significativas nos teores de lignina e pentosanas em função da ocorrência do distúrbio abiótico. A utilização de técnicas de análise multivariada permitiu identificar a variabilidade das propriedades da madeira, tendo as características das fibras, o comprimento e espessura de parede, maior importância em pontuar as divergências dos níveis de distúrbio abiótico. Com o agrupamento, formaram-se dois grupos: um com junção dos níveis I e II de distúrbio abiótico e outro, com o nível III, sendo possível inferir que a homogeneização dos materiais, conforme o agrupamento, tende a melhorar o volume e a densidade de madeira produção de polpa celulósica.

Soja, uma cultura conhecida por sua importância econômica e nutricional, tem sido objeto de vários estudos que avaliam o impacto e as respostas efetivas das plantas aos estresses abióticos. O estresse salino é um dos principais estresses ambientais e afeta negativamente o crescimento e o rendimento das culturas, incluindo a soja. A edição de RNA é um processo pelo qual as sequências de nucleotídeos podem ser alteradas, revertendo mutações que podem mudar as sequências de proteínas para manter suas funções conservadas. As proteínas pentatricopeptide repeat (PPRs) são trans-elementos de edição caracterizados por reconhecer cis-elementos específicos de RNA e realizar a reação de edição. Vários estudos descreveram estes trans-elementos e seus sítios de edição cognatos, mas nem todas as proteínas que compõem o complexo de edição foram identificadas. A perda de eventos de edição de plastídios, resultante de mutações em fatores de edição de RNA ou através de interferência por estresse, leva a alterações de desenvolvimento, de fisiologia e da fotossíntese. O objetivo do presente trabalho é caracterizar os sítios de edição e os fatores associados à edição de RNA em Glycine max e a influência de estresses abióticos no processo de edição de RNA em cloroplastos. No capítulo 1, um método é apresentado para triar a edição de RNA de cloroplasto usando bibliotecas públicas de sRNAs de Arabidopsis, soja e arroz. Entre os sítios de edição previstos, 40,57, 34,78 e 25,31% foram confirmados utilizando sRNAs de Arabidopsis, soja e arroz, respectivamente. A análise de SNPs revelou alterações de C-to-U de 58,2, 43,9 e 37,5% nas respectivas espécies e identificou conhecidas e possíveis novas edições de RNA de adenosina para inosina (A-to-I) em tRNAs. O método e os dados revelam o potencial do uso de sRNA como uma fonte confiável para identificar novos e confirmar sítios de edição conhecidos. No capítulo 2, o processo de edição de RNA foi avaliado em cloroplastos de plantas de soja sob estresse salino. A abordagem de bioinformática utilizando bibliotecas de sRNAs e mRNAs foi empregada para detectar sítios específicos que mostram diferenças na taxa de edição. RT-qPCR foi usado para medir a taxa de edição nos sítios selecionados. Observamos diferenças nas taxas de edição nos transcritos dos genes ndhA, ndhB, rps14 e rps16 ao comparar os dados das bibliotecas controle e das tratadas com NaCl. Os ensaios de RT-qPCR 9 demonstraram um aumento na edição dos genes selecionados. Esses aumentos podem ser uma resposta para manter a homeostase das funções das proteínas do cloroplasto em resposta ao estresse salino. No capítulo 3, para identificar os fatores relacionados aos sítios de edição analisados, sondas biotiniladas de RNA foram projetadas com base nos sítios de edição de RNA de plastídio de soja para realizar um isolamento proteico específico do fator de edição. Proteínas que interagiram com as sondas foram isoladas através da ligação das sondas à biotina e foram identificadas utilizando espectrometria de massa. Entre os peptídeos detectados, cinco corresponderam a proteínas PPR. A comparação dos genes de Arabidopsis com as proteínas PPR da soja permitiu a identificação dos homólogos mais próximos. O presente estudo representa a primeira identificação do conjunto de sítios de edição de RNA, de fatores associados aos sítios de edição de RNA e a caracterização dos efeitos do estresse abiótico na edição de RNA em Glycine max. / Soybean, a crop known by its economic and nutritional importance, has been the subject of several studies that assess the impact and the effective plant responses to abiotic stresses. Salt stress is one of the main environmental stresses and negatively impacts crop growth and yield. RNA editing is a process whereby nucleotide sequences can be altered, reverting mutations that could change protein sequences to maintain their conserved functions. Pentatricopeptide repeat proteins are editing trans-elements characterized by recognize specific RNA cis-elements and perform the editing reaction. Several studies have described these trans-elements and their cognate editing sites, but not all proteins that compose the editing complex were identified. The loss of plastid editing events, resulting from mutations in RNA editing factors or through stress interference, leads to developmental, physiological and photosynthetic alterations. The aim of the present work is to characterize the editing sites and factors associated with RNA editing in Glycine max and the influence of abiotic stresses on the process of RNA editing in chloroplasts. In chapter 1, a method is presented to screen chloroplast RNA editing using public sRNA libraries from Arabidopsis, soybean and rice. Among the predicted editing sites, 40.57, 34.78, and 25.31% were confirmed using sRNAs from Arabidopsis, soybean and rice, respectively. SNP analysis revealed 58.2, 43.9, and 37.5% new C-to-U changes in the respective species and identified known and new putative adenosine to inosine (A-to-I) RNA editing in tRNAs. The method and data reveal the potential of sRNA as a reliable source to identify new and confirm known editing sites. In chapter 2, RNA editing process was evaluated in the chloroplast of soybean plants under salt stress. Bioinformatics approach using sRNA and mRNA libraries was employed to detect specific sites showing differences in editing efficiency. RT-qPCR was used to measure editing efficiency at selected sites. We observed differences in ndhA, ndhB, rps14 and rps16 editing rates between control and salt-treated libraries. RT-qPCR assays demonstrated an increase in editing efficiency of selected genes. These increases can be a response to keep the homeostasis of chloroplast protein functions in response to NaCl stress. In chapter 3, to identify the trans-acting factors of editing sites analyzed, we have designed RNA biotinylated probes based in soybean plastid RNA editing sites to perform 11 specific isolation of proteins associated to editosomes. Proteins that interacted with the probes were isolated by binding the probes to biotin and were identified using mass spectrometry. Among the detected peptides, five corresponded to PPR proteins. Comparison of Arabidopsis genes to the soybean PPR proteins allow identification of the closest related homologs. The present study represents the first identification of RNA editing sites set, associated factors to RNA editing sites and characterization of effects from abiotic stress in RNA editing in Glycine max.