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Caracterização funcional in vitro de variantes no gene PCSK9 identificadas em pacientes com Hipercolesterolemia Familial / In vitro functional characterization of PCSK9 variants identified in patients with Familial Hypercholesterolemia

Los, Bruna 25 June 2019 (has links)
A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma doença genética do metabolismo das lipoproteínas, caracterizada pelo aumento do colesterol plasmático, transportado principalmente pela lipoproteína de baixa densidade (LDL). A HF é causada principalmente por mutações nos genes LDLR, APOB e PCSK9. As mutações conhecidas na PCSK9 podem levar ao aumento ou diminuição da função proteolítica da proteína, as quais são associadas ao aumento ou diminuição da LDL-c plasmática, respectivamente. Com o projeto genoma humano surgiram novos métodos de sequenciamento, o que resultou em um grande número de novas variantes genéticas relacionadas à HF. Entretanto, os mecanismos pelos quais essas variantes influenciam na concentração do colesterol e sua interferência na resposta terapêutica não estão totalmente elucidados. O objetivo do presente trabalho foi avaliar in vitro o efeito de variantes na região codificadora e reguladora do gene PCSK9 identificadas em pacientes HF utilizando sequenciamento de nova geração. Para a caracterização funcional das variantes na região codificadora da PCSK9, primeiramente foi avaliado o impacto dessas variantes na interação PCSK9-LDLR via Docking molecular. Células HEK293FT foram transfectadas com as diferentes construções da PCSK9, e posteriormente, foram utilizadas em ensaios para avaliar a atividade do LDLR e a internalização de LDL por citometria de fluxo. Para as variantes na região reguladora da PCSK9, foi realizado uma predição in silico do possível efeito de variantes na região 3UTR na ligação de miRNAs. A avalição da interação entre os miRNAs preditos, e a região 3UTR da PCSK9, e o possível impacto nessa interação na presença de variantes na região 3UTR, foi realizada em células HEK293FT transfectadas com um plasmídeo contendo a 3UTR da PCSK9 e um gene repórter da Gaussia luciferase, juntamente com um plasmídeo de expressão contendo os miRNAs de interesse. Foi também estudado o efeito dos miRNAs preditos sobre a expressão, RNAm e proteína, da PCSK9 via RT-qPCR e Western blot, em células HepG2. Foram identificadas 9 variantes na região codificadora da PCSK9, e duas, E32K e R469W, foram selecionadas para os ensaios posteriores. Para a R469W foi observada uma possível alteração conformacional a qual poderia aumentar a afinidade da PCSK9 pelo LDLR. Para a E32K, uma possível associação com HF foi observada em uma família brasileira com ascendência japonesa. As variantes E32K e R469W apresentaram uma redução na atividade do LDLR de 5 e 11%, respectivamente em comparação a PCSK9-WT. Entretanto, não foram observadas reduções estaticamente significativas na atividade do LDLR e na internalização da LDL em células transfectadas com ambas as variantes. Dez variantes foram encontradas na região 3UTR da PCSK9, entre elas três foram selecionadas por impactar a ligação de quatro miRNAs. Nossos dados demonstraram uma redução significativa na expressão da PCSK9 em células HepG2 transfectadas com os miR-4721 e miR-564 (p=0,036 e p=0,010, respectivamente). Porém, não foi observada diferenças na expressão da luciferase em células transfectadas com esses miRNAs, não sendo possível validar a interação miRNA-RNAm. As variantes no gene PCSK9 identificadas no nosso estudo podem não explicar individualmente o fenótipo HF, mas podem contribuir para a severidade da doença juntamente com outras variantes em outros genes. / Familial Hypercholesterolemia (FH) is a genetic disorder of lipoprotein metabolism, characterized by elevated plasma cholesterol levels, mostly carried by low-density lipoprotein (LDL). FH is mainly caused by mutations in three genes, LDLR, APOB, and PCSK9. Gain-of-function mutations in PCSK9 reduce LDL receptor levels, resulting in high levels of LDL cholesterol in the plasma. Loss-of-function mutations lead to higher levels of the LDL receptor, resulting in lower LDL cholesterol levels. The Human Genome Project led to a faster technological development related to sequencing methods, which allowed identifying many novel variants associated with FH. However, the mechanisms by which these variants influence cholesterol levels and their interference in therapeutic response are not fully understood. The aim of the present study was to perform an in vitro characterization of the effect of PCSK9 variants identified in FH patients using Next-Generation Sequencing. For the functional characterization of variants in the coding region of PCSK9, the impact of these variants on PCSK9-LDLR interaction was evaluated by molecular docking. HEK293FT cells were transiently transfected with different PCSK9 constructs, and the amount of cell surface LDLR and LDL internalization were determined by flow cytometry. For the variants in PCSK9 3UTR region, an in silico prediction of PCSK9 3UTR variants in miRNA seed regions and target sites was performed. To determine whether the predicted miRNAs directly interact with PCSK9 3UTR region, HEK293FT cells were co-transfected with a vector containing a PCSK9 3\'UTR region and a Gaussia luciferase reporter gene, together with an expression plasmid containing the miRNAs of interest. The effect of the predicted miRNAs on the expression of PCSK9 was evaluated using RT-qPCR and Western blot in HepG2 cells transiently transfected with miRNA mimics. Nine missense variants were identified in PCSK9 gene. E32K e R469W were chosen for further analysis. For R469W, a possible conformational change was observed that could increase the affinity of PCSK9 for LDLR, when compared to the wild-type. For E32K, a possible association with FH in a Brazilian family with Japanese ancestry was observed. E32K and R469W had a 5% and 11% decreased level of cell surface LDLR, respectively, as compared with WT-PCSK9. However, no significant reduction in the number of cell surface LDLR and LDL internalization was observed in transfected cells for both variants. Ten variants were found in PCSK9 3\'UTR region, of which three were selected for affecting the binding of four miRNAs. Our data demonstrated a significant downregulation of PCSK9 in cells transfected with miR-4721 and miR-564 miRNA mimics, compared to cells transfected with a scramble control (p=0,036 and p=0,010, respectively). However, no differences in luciferase expression were observed in cells transfected with these miRNAs, therefore, it was not possible to experimentally validate miRNA-mRNA interaction. PCSK9 variants found in our study may not fully explain FH phenotype but may contribute to the severity of the disease together with other variants in other genes.
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Identificação de mutações no gene do receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDLR) em pacientes com hipercolesterolemia familiar / Identification of mutation in the low density lipoprotein receptor gene (LDLR) in familial hypercholesterolemia patients

Vasconcelos, Karina Alves da Silva 15 January 2015 (has links)
Hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença autossômica dominante, caracterizada por elevados níveis plasmáticos da lipoproteína de baixa densidade (LDL), desenvolvimento de xantoma tendíneo e arco corneal, além do aumento do risco de doença coronariana e acidente vascular cerebral prematuros. Frequentemente subdiagnosticada, estima-se que apenas 10% dos 400.000 indivíduos com HF no Brasil têm conhecimento da própria doença; afetando, desta forma, a qualidade e a expetativa de vida dos pacientes. Mutações no gene do receptor da LDL (LDLR) são consideradas as alterações genéticas mais frequentes para o desenvolvimento da hipercolesterolemia familiar, pois comprometem a capacidade de remoção das partículas de LDL circulantes, promovendo seu aumento em níveis plasmáticos. Já foram descritas mais de 1600 mutações diferentes no gene LDLR associadas ao fenótipo da HF; entretanto, ainda é difícil determinar em muitas delas o efeito deletério na atividade do receptor. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar funcionalmente mutações no gene LDLR não descritas na literatura para determinar sua patogenicidade na hipercolesterolemia familiar. Foi avaliada a atividade residual de LDLR através da captação de LDL marcado com fluoróforo lipofílico em cultura de linfócitos T dos pacientes portadores das mutações analisadas após estimulação dos linfócitos T por mitógenos específicos. As mutações Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr foram consideradas patogênicas por acarretarem diminuição da atividade residual do receptor de LDL. As mutações Glu 602X e His388ProfsX53 confirmaram sua patogenicidade e podem ser considerados como controle positivo para futuros ensaios funcionais. Estudos que esclareçam os mecanismos moleculares da HF e da relação genótipo/fenótipo abrem perspectivas para o desenvolvimento de terapias mais específicas na redução dos níveis de colesterol e, consequentemente, da morbidade e mortalidade associadas às doenças cardiovasculares. / Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder characterized by elevated plasma levels of low-density lipoprotein (LDL), and development of corneal arcus tendinous xanthoma, and increased risk of coronary heart disease and premature stroke. Often misdiagnosed, it is estimated that only 10% of the 400.000 patients with FH in Brazil has knowledge of the disease itself, affecting in this way the quality and life expectancy of patients. Mutations in the LDL receptor (LDLR) are considered the most frequent genetic alterations for the development of familial hypercholesterolemia because compromise the ability of removal of circulating LDL particles, promoting its increase in plasma levels. Have been described over 1600 different mutations in the LDLR gene associated with the phenotype of FH, however, it is still difficult to determine in many of the deleterious effects on receptor activity. The aim of this study was to identify mutations in the LDLR gene and functionally characterize mutations not described in the literature to determine its pathogenicity in familial hypercholesterolemia. The residual activity of LDLR was evaluated by raising LDL labeled with lipophilic fluorophore in cultured T lymphocytes of patients with the analyzed mutations after stimulation of T lymphocytes by specific mitogen. The substitution mutations Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr were considered pathogenic because it causes decrease of the residual activity of the LDL receptor in T lymphocytes. The His388ProfsX53 and Glu602X mutations confirmed their pathogenicity and can be considered as positive control for future functional assays. Studies to clarify the molecular mechanisms of HF and genotype/ phenotype open perspectives for the development of more specific therapies for reducing cholesterol levels, and therefore the morbidity and mortality associated with cardiovascular diseases.
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Identificação de mutações no gene do receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDLR) em pacientes com hipercolesterolemia familiar / Identification of mutation in the low density lipoprotein receptor gene (LDLR) in familial hypercholesterolemia patients

Karina Alves da Silva Vasconcelos 15 January 2015 (has links)
Hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença autossômica dominante, caracterizada por elevados níveis plasmáticos da lipoproteína de baixa densidade (LDL), desenvolvimento de xantoma tendíneo e arco corneal, além do aumento do risco de doença coronariana e acidente vascular cerebral prematuros. Frequentemente subdiagnosticada, estima-se que apenas 10% dos 400.000 indivíduos com HF no Brasil têm conhecimento da própria doença; afetando, desta forma, a qualidade e a expetativa de vida dos pacientes. Mutações no gene do receptor da LDL (LDLR) são consideradas as alterações genéticas mais frequentes para o desenvolvimento da hipercolesterolemia familiar, pois comprometem a capacidade de remoção das partículas de LDL circulantes, promovendo seu aumento em níveis plasmáticos. Já foram descritas mais de 1600 mutações diferentes no gene LDLR associadas ao fenótipo da HF; entretanto, ainda é difícil determinar em muitas delas o efeito deletério na atividade do receptor. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar funcionalmente mutações no gene LDLR não descritas na literatura para determinar sua patogenicidade na hipercolesterolemia familiar. Foi avaliada a atividade residual de LDLR através da captação de LDL marcado com fluoróforo lipofílico em cultura de linfócitos T dos pacientes portadores das mutações analisadas após estimulação dos linfócitos T por mitógenos específicos. As mutações Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr foram consideradas patogênicas por acarretarem diminuição da atividade residual do receptor de LDL. As mutações Glu 602X e His388ProfsX53 confirmaram sua patogenicidade e podem ser considerados como controle positivo para futuros ensaios funcionais. Estudos que esclareçam os mecanismos moleculares da HF e da relação genótipo/fenótipo abrem perspectivas para o desenvolvimento de terapias mais específicas na redução dos níveis de colesterol e, consequentemente, da morbidade e mortalidade associadas às doenças cardiovasculares. / Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder characterized by elevated plasma levels of low-density lipoprotein (LDL), and development of corneal arcus tendinous xanthoma, and increased risk of coronary heart disease and premature stroke. Often misdiagnosed, it is estimated that only 10% of the 400.000 patients with FH in Brazil has knowledge of the disease itself, affecting in this way the quality and life expectancy of patients. Mutations in the LDL receptor (LDLR) are considered the most frequent genetic alterations for the development of familial hypercholesterolemia because compromise the ability of removal of circulating LDL particles, promoting its increase in plasma levels. Have been described over 1600 different mutations in the LDLR gene associated with the phenotype of FH, however, it is still difficult to determine in many of the deleterious effects on receptor activity. The aim of this study was to identify mutations in the LDLR gene and functionally characterize mutations not described in the literature to determine its pathogenicity in familial hypercholesterolemia. The residual activity of LDLR was evaluated by raising LDL labeled with lipophilic fluorophore in cultured T lymphocytes of patients with the analyzed mutations after stimulation of T lymphocytes by specific mitogen. The substitution mutations Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr were considered pathogenic because it causes decrease of the residual activity of the LDL receptor in T lymphocytes. The His388ProfsX53 and Glu602X mutations confirmed their pathogenicity and can be considered as positive control for future functional assays. Studies to clarify the molecular mechanisms of HF and genotype/ phenotype open perspectives for the development of more specific therapies for reducing cholesterol levels, and therefore the morbidity and mortality associated with cardiovascular diseases.
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Quando a tradução (re)conta a história: análise textual e tradução comentada de interrogatórios da \'Rosa Branca\' / When translation (re)tells History: text analysis and commented translation of interrogations of the White Rose

Schäfer, Anna Carolina 12 August 2015 (has links)
O presente trabalho tem por objetivo produzir uma tradução comentada, do alemão para o português, de uma seleção de documentos emblemáticos da resistência alemã ao Nacional-Socialismo. O corpus constitui-se especificamente de registros escritos dos interrogatórios (em alemão: Verhörprotokolle, protocolos de interrogatório) conduzidos em fevereiro de 1943 pela Polícia Secreta Nazista com os irmãos Hans e Sophie Scholl. Ambos eram integrantes do grupo A Rosa Branca, formado sobretudo por estudantes da Universidade de Munique que se opuseram ao regime nacional-socialista através da produção e distribuição de panfletos, nos quais lançavam críticas incisivas ao regime e à postura apática da população alemã perante os crimes cometidos pelo Estado. Tendo em vista o objetivo geral do trabalho e a conjuntura histórica em que se insere o corpus, partiu-se na análise e tradução dos protocolos de uma base teórica interdisciplinar, pautada tanto em elementos da pesquisa historiográfica quanto em pressupostos dos Estudos Funcionais da Tradução sobretudo no modelo de análise textual e tradução de Christiane Nord (1988, 2009) , da Linguística Textual e da Análise do Discurso. Para a tradução comentada dos protocolos, produto final deste trabalho, previu-se desde o início uma função documental, a qual justifica diversas microdecisões tomadas ao longo do processo tradutório. Elas vão desde a opção por reproduzir a formatação original dos textos de partida em alemão até a busca por reconstituir seu pano de fundo histórico por meio de comentários e imagens, inseridos propositalmente na margem direita e não no rodapé ou no fim da tradução. Espera-se, assim, que os textos traduzidos possam ser consultados, lidos e analisados como documentos e testemunhos sobre a resistência alemã ao Nacional-Socialismo, tema ainda pouco divulgado e estudado no Brasil. / This study aims to produce a commented translation from German into Portuguese of a selection of iconic documents of the German resistance to the National Socialism. The corpus is specifically consisted of written records of the interrogations (in German: Verhörprotokolle, interrogation protocols) conducted in February 1943 by the Nazi Secret Police with the brothers Hans and Sophie Scholl. Both were members of the group The White Rose, mostly comprised of students from the University of Munich who opposed the National Socialist regime by producing and distributing pamphlets in which they released incisive criticism to the government and apathetic posture of the German population before the crimes committed by it. Bearing in mind the overall aim of the work and the historical context to which the corpus belongs, an interdisciplinary theoretical basis was used in the analysis and translation of the protocols, based both in the historical research elements and on suppositions of the Functional Translation Studies especially in the model for translation-oriented text analysis by Christiane Nord (1988, 2009) , Text Linguistics and Discourse Analysis. For the commented translation of the protocols, the end product of this research, a documentary function was envisaged from the beginning, which justifies different micro decisions taken throughout the translation process, ranging from the choice of reproducing the original formatting of the source texts in German to the search for reconstituting the historical background of the source texts by means of comments and images intentionally inserted on the right edge of the page, and not in footnotes or at the end of the translation. It is, therefore, expected that the translated texts can be consulted, read and analyzed as documents and testimonies of the German resistance to the National Socialism, a subject still little publicized and studied in Brazil.
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Quando a tradução (re)conta a história: análise textual e tradução comentada de interrogatórios da \'Rosa Branca\' / When translation (re)tells History: text analysis and commented translation of interrogations of the White Rose

Anna Carolina Schäfer 12 August 2015 (has links)
O presente trabalho tem por objetivo produzir uma tradução comentada, do alemão para o português, de uma seleção de documentos emblemáticos da resistência alemã ao Nacional-Socialismo. O corpus constitui-se especificamente de registros escritos dos interrogatórios (em alemão: Verhörprotokolle, protocolos de interrogatório) conduzidos em fevereiro de 1943 pela Polícia Secreta Nazista com os irmãos Hans e Sophie Scholl. Ambos eram integrantes do grupo A Rosa Branca, formado sobretudo por estudantes da Universidade de Munique que se opuseram ao regime nacional-socialista através da produção e distribuição de panfletos, nos quais lançavam críticas incisivas ao regime e à postura apática da população alemã perante os crimes cometidos pelo Estado. Tendo em vista o objetivo geral do trabalho e a conjuntura histórica em que se insere o corpus, partiu-se na análise e tradução dos protocolos de uma base teórica interdisciplinar, pautada tanto em elementos da pesquisa historiográfica quanto em pressupostos dos Estudos Funcionais da Tradução sobretudo no modelo de análise textual e tradução de Christiane Nord (1988, 2009) , da Linguística Textual e da Análise do Discurso. Para a tradução comentada dos protocolos, produto final deste trabalho, previu-se desde o início uma função documental, a qual justifica diversas microdecisões tomadas ao longo do processo tradutório. Elas vão desde a opção por reproduzir a formatação original dos textos de partida em alemão até a busca por reconstituir seu pano de fundo histórico por meio de comentários e imagens, inseridos propositalmente na margem direita e não no rodapé ou no fim da tradução. Espera-se, assim, que os textos traduzidos possam ser consultados, lidos e analisados como documentos e testemunhos sobre a resistência alemã ao Nacional-Socialismo, tema ainda pouco divulgado e estudado no Brasil. / This study aims to produce a commented translation from German into Portuguese of a selection of iconic documents of the German resistance to the National Socialism. The corpus is specifically consisted of written records of the interrogations (in German: Verhörprotokolle, interrogation protocols) conducted in February 1943 by the Nazi Secret Police with the brothers Hans and Sophie Scholl. Both were members of the group The White Rose, mostly comprised of students from the University of Munich who opposed the National Socialist regime by producing and distributing pamphlets in which they released incisive criticism to the government and apathetic posture of the German population before the crimes committed by it. Bearing in mind the overall aim of the work and the historical context to which the corpus belongs, an interdisciplinary theoretical basis was used in the analysis and translation of the protocols, based both in the historical research elements and on suppositions of the Functional Translation Studies especially in the model for translation-oriented text analysis by Christiane Nord (1988, 2009) , Text Linguistics and Discourse Analysis. For the commented translation of the protocols, the end product of this research, a documentary function was envisaged from the beginning, which justifies different micro decisions taken throughout the translation process, ranging from the choice of reproducing the original formatting of the source texts in German to the search for reconstituting the historical background of the source texts by means of comments and images intentionally inserted on the right edge of the page, and not in footnotes or at the end of the translation. It is, therefore, expected that the translated texts can be consulted, read and analyzed as documents and testimonies of the German resistance to the National Socialism, a subject still little publicized and studied in Brazil.

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