Made available in DSpace on 2014-06-12T15:58:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3451_1.pdf: 1766411 bytes, checksum: e0d05ca882fb75834d13a804d6b8f11f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Um grande desafio em Biologia hoje é associar mutações no DNA a várias características dos organismos, especialmente as relacionados com doenças. Muitas investigações sobre mutações que ocorrem no genoma foram realizadas, levando à conclusão de que alterações pontuais que ocorrem em regiões conservadas do DNA, que podem ser transmitidas através de várias gerações, podem ser associadas com a ocorrência de certas características ou doenças. Como consequência, mapear estas alterações e relacioná-las à ocorrência ou propensão de condições específicas é muito desejável. Infelizmente, esta tarefa não é fácil, pois para localizar estas mutações é necessário ter acesso ao haplótipo de um indivíduo, o que é um procedimento muito custoso, considerando a tecnologia corrente. Desta forma, métodos computacionais para inferência de haplótipos a partir de dados genotípicos são altamente necessários. Muitas abordagens foram propostas, mas nenhuma representa uma proposta completamente satisfatória, uma vez que os custos computacionais associados aos procedimentos são proibitivos ou as soluções encontradas são de baixa qualidade. A demanda principal corrente na pesquisa em inferência de haplótipos é que os métodos possam lidar com grandes volumes de dados genotípicos. Devido ao crescimento exponencial do custo das abordagens computacionais exatas, métodos que oferecem soluções rápidas com qualidade aceitável são altamente desejáveis. Nesta dissertação um novo método, chamado HybridPTG, é proposto. É uma abordagem híbrida que usa Cadeias de Markov para reduzir drasticamente a necessidade de passos randômicos (na média necessita de 99,99% menos operações aleatórias que o original PTG), convergindo para boas soluções (soluções similares ou melhores que as do método PTG) em poucos, frequentemente menos de dois, passos, portanto com uma complexidade computacional consideravelmente menor do que abordagens randômicas (tempo de processamento). Diversos experimentos com conjuntos de dados genotípicos de diferentes características foram realizados para comparar HybridPTG aos melhores algoritmos conhecidos, PTG, FastPHASE e Haplorec, mostrando que HybridPTG é um método bastante estável, confiável e eficiente

Este trabalho teve como objetivo a obtenção de embriogênese somática em cultivares brasileiras de bananeira e subsequente conversão dos embriões somáticos em plantas. Estudos desta natureza visam possibilitar trabalhos futuros que envolvam a manipulação genética, para melhoramento desta cultura. O projeto consistiu, primeiramente, na indução de embriogênese somática a partir de ápices vegetativos testando-se: diferentes auxinas (dicamba, picloram, 2,4-D e NAA) em meio MS (Murashige & Skoog, 1962); três meios de cultura com diferentes razões entre nitrogênio nítrico e amoniacal (NO3-: NH4+); e tempo necessário para permanência do explante no meio de indução. Indução foi obtida, porém, embriões somáticos não converteram-se em plantas. Em seguida, estudou-se o efeito do tratamento de maturação, através de cultivo contendo concentração mais elevada de sacarose (60 g/L) ou PEG (polietilenoglicol), na conversão e germinação de embriões somáticos a partir de ápices vegetativos. Alternadamente, foram utilizados explantes de inflorescências masculinas na indução de embriogênese somática. Em todas as etapas foram realizadas análises morfo-anatômicas através de microscopia ótica e eletrônica de varredura. Na indução a partir de ápices vegetativos, as auxinas dicamba e picloram apresentaram formação de estruturas embriogênicas e embriões somáticos, enquanto que as demais apresentaram ausência de resposta embriogênica. Cortes histológicos dos explantes em meio com dicamba, mostraram regiões embriogênicas com formação de pró- embriões e regiões meristemáticas não organizadas, que possivelmente, originaram estruturas monopolares. Os embriões somáticos eram morfologicamente semelhantes aos embriões zigóticos de Musa acuminata, porém, diferenciação de protoderme, ápices meristemáticos e procâmbio, não foram observados. Entre os três diferentes meios de cultura testados na indução (SH, FN-Lite ou 1/2 MS), o meio FN-Lite e 1/2 MS, com razão nitrato:amônio de 4:1 e 2:1, respectivamente, apresentaram melhor qualidade dos embriões somáticos, do que os embriões em meio SH com razão de 9,5:1, e o melhor tempo de indução foi de 4 semanas. Cortes histológicos foram realizados para observação das características dos embriões somáticos formados. O tratamento de maturação dos embriões somáticos favoreceu a conversão dos embriões em plântulas, porém, em baixo percentual. Frequentemente foram observadas, tanto em meio de indução, como de maturação, uma alteração de desenvolvimento dos embriões somáticos, com um crescimento preferencial do ápice radicular, e ausência de desenvolvimento do ápice caulinar. Em explantes de inflorescências masculinas, identificaram-se através de análises morfo-anatômicas, dois tipos de embriões somáticos: um tipo semelhante ao embrião zigótico de Musa acuminata e, em menor frequência, desenvolveram-se embriões somáticos semelhantes a embriões zigóticos de outras monocotiledôneas, indicando que em um único protocolo de embriogênese somática, é possível ocorrer a formação de diferentes padrões morfológicos de embriões somáticos. / The present work aimed to obtain somatic embryogenesis in Brazilian cultivars of banana and their subsequent conversion into plants. These studies are important for the development of protocols involving genetic manipulation techniques for crop improvement of this species. Initially, the induction of somatic embryogenesis from shoot apices was tested using MS medium (Murashige & Skoog, 1962) supplemented with different auxins (dicamba, picloram, 2,4-D and NAA); three culture media with different ratios of nitric:amoniacal nitrogen (NO3-: NH4+); and length of time in the induction medium. Induction was obtained but the somatic embryos did not convert into plants. Maturation treatments with higher sucrose levels or PEG (polyethylene glicol) were then tested. In addition, the use of male inflorescences were used as explants for somatic embryo induction. During the experiments, morpho-anatomic analyses were performed through light and scanning electron microscopy. When shoot apices were used as explants, the auxins dicamba and picloram showed the formation of embryogenic structures and somatic embryos, while 2,4-D and NAA were not. Explants in medium containing dicamba presented both embryogenic regions with pro-embryos and non-organized meristematic regions, which may have formed unipolar structures. The somatic embryos were morphologically similar to the zygotic embryos of Musa acuminata, however lacked the differentiation of protoderm, meristematic apices and procambium. These somatic embryos did not convert into plants. Among the three different culture media tested for induction (SH, FN-Lite or 1/2 MS), FN- Lite and 1/2 MS provided better quality embryos and four weeks was considered the best period for induction. These two media have a 4:1 and 2:1 NO3-: NH4+ ratio, while SH has a 9,5:1 ratio. Histological sections were done to evaluate the somatic embryos formed. Somatic embryo maturation treatments favored the conversion of embryos into plants, however at low frequency. Frequently, somatic embryos showed the development of the root pole only. This behavior was observed both during induction and maturation. Male inflorescence explants formed two types of somatic embryos: one morphologically resembling the zygotic embryo of Musa acuminate, and less frequently somatic embryos with morphological characteristics of other monocots. This behavior indicates that in one protocol of somatic embryogenesis it is possible to obtain different morphological patterns of somatic embryos.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000438475-Texto+Completo-0.pdf: 1199552 bytes, checksum: 11115a2a9f4a42a185a775b4a566fe5b (MD5) Previous issue date: 2012 / ADULT (acro-dermato-ungueal-tooth) is a human genetic syndrome that manifests clinically by skin and embryonic appendages anomalies. This syndrome pathogenesis was first identified in 2001, but nowadays it is related to more than one mutation in p63 gene. Although described almost 20 years ago (1993) in Germany, this syndrome still have few reports and this is the first brazilian family. We report here the clinical aspects of five members of a family which clinical features corresponded to phenotypic ADULT manifestations. The clinical aspects included athelia/hypotelia, photosensitivity, dystophic nails, tooth anomalies and lacrimal duct obstruction. The adermatoglyphia, manifestation found in all affected members of this family, was not described before. The histologic examination demonstrated flattening of dermal papillae and electron microsopy showed disrupted collagen fibers. The genetic sequencing of blood ssample found a mutation in p63 gene, already known as R298Q. / A ADULT (acro-dermato-ungueal-lacrimal-tooth) é uma síndrome genética humana que se manifesta clinicamente por alterações cutâneas e do desenvolvimento dos apêndices embrionários. Sua etiologia foi identificada inicialmente em 2001, mas atualmente sabe-se que está relacionada a mais de uma mutação no gene p63. Apesar de descrita pela primeira vez há quase duas décadas (1993) na Alemanha, a síndrome ainda é pouco reportada e esta é a primeira família brasileira descrita. Neste trabalho descrevemos os aspectos clínicos de cinco indivíduos de uma mesma família, os quais apresentavam manifestações fenotípicas compatíveis com a síndrome ADULT. Os achados clínicos incluem atelia/hipotelia, fotossensibilidade, distrofia ungueal, anormalidades dentárias e obstrução do ducto lacrimal. A adermatoglifia, manifestação clínica demonstrada em todos os acometidos desta família, não fora descrita anteriormente nos portadores da síndrome. A avaliação histológica por microscopia óptica evidenciou retificação das papilas dérmicas e a análise por microscopia eletrônica mostrou alteração nas fibras colágenas da derme. O sequenciamento genético através de amostras de sangue periférico identificou uma mutação no gene p63, previamente conhecida como R298Q.

A Gangliosidose GM1 é um Erro Inato do Metabolismo (EIM) causado pela deficiência da enzima B-galactosidase ácida. Essa doença é caracterizada pelo acúmulo de metabólitos não degradados, principalmente gangliosídeo GM1, nos lisossomos de vários tipos celulares. Baseado na idade de início e na atividade residual da enzima, a Gangliosidose GM1 é classificada em três diferentes tipos: infantil, juvenil e adulto. O gene da B-galactosidase ácida (GLB1, GeneBank M27507) está situado no cromossomo 3 e possui mais de 60 kb, contendo 16 exons. Cerca de 50 mutações associadas à doença estão descritas na literatura. No sul do Brasil, há uma alta freqüência dessa doença (1:17.000 nascidos vivos). Neste trabalho, vinte pacientes diagnosticados no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (Brasil) tiveram o gene GLB1 investigado por SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) usando DNA extraído de sangue periférico. Através desta triagem foram encontradas 52 alterações de mobilidade do DNA, indicando a presença de mutações. As amostras relativas aos exons 2 e 15 foram submetidas a sequenciamento direto com seqüenciador ABI31O(Applied Biosystens) utilizado kit BigDye 3.1. Cinco novas mutações no gene GLB1 (F63Y, R38G, Y36S, Y64F e R59C) e duas mutações já descritas (R59H e 1622-1627insG) foram encontradas. Este trabalho possibilitou a genotipagem completa de 6 pacientes e parcial de 5, e direcionou a investigação de mutações, contribuindo diretamente no diagnóstico da enfermidade e permitindo a realização de estudos de correlação genótipo/fenótipo destes pacientes. / GM1 Gangliosidosis is a Iysosomal storage disease caused by r3- galactosidase deficiency. As a result of this defect there is a huge accumulation of GM1 ganglioside in tissues of affected patients. Gangliosides are glycosphingolipids present in high concentration in neural tissues. The localization of these lipids explain in part the neurodegeneration present in patients. The r3-galactosidasegene (GLB1-Gene Bank M27507) is located on chromosome 3 and spands more than 60 kb and it is formed by 16 exons. Over than 45 mutations were found in this gene up to now. In southern Brazil the high frequency of GM1 Gangliosidosis (1:17.000 live born) justify the aim of this work, that is to genotype those patients with GM1 Gangliosidosis, by, fist screening they DNA by SSCP (Single Strand Conformational Polimorphism) and than, sequencing in automated apparatus. The screening of 16 exons from 20 patiens gave us the information that 52 mobility changes of DNA Single Strand were found, suggesting possibility of mutations. Samples from exons 2 and 15 were submitted to direct sequencing in ABI310 (Applied Biosystems) using Big Dye3.1 terminator Kit. Five new mutations were found in GLB1 gene (F63Y, R38G, Y36S, Y64F and R59C) and two mutations described previously (R59H and 1627insG). This investigation gave support to complete genotype 6 patients with GM1 Gangliosidosis, partial genotype 5 patients and gave a good support for future analysis in GLB1 gene to correlate genotype and phenotype easily.

A Gangliosidose GM1 é um Erro Inato do Metabolismo (EIM) causado pela deficiência da enzima B-galactosidase ácida. Essa doença é caracterizada pelo acúmulo de metabólitos não degradados, principalmente gangliosídeo GM1, nos lisossomos de vários tipos celulares. Baseado na idade de início e na atividade residual da enzima, a Gangliosidose GM1 é classificada em três diferentes tipos: infantil, juvenil e adulto. O gene da B-galactosidase ácida (GLB1, GeneBank M27507) está situado no cromossomo 3 e possui mais de 60 kb, contendo 16 exons. Cerca de 50 mutações associadas à doença estão descritas na literatura. No sul do Brasil, há uma alta freqüência dessa doença (1:17.000 nascidos vivos). Neste trabalho, vinte pacientes diagnosticados no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (Brasil) tiveram o gene GLB1 investigado por SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) usando DNA extraído de sangue periférico. Através desta triagem foram encontradas 52 alterações de mobilidade do DNA, indicando a presença de mutações. As amostras relativas aos exons 2 e 15 foram submetidas a sequenciamento direto com seqüenciador ABI31O(Applied Biosystens) utilizado kit BigDye 3.1. Cinco novas mutações no gene GLB1 (F63Y, R38G, Y36S, Y64F e R59C) e duas mutações já descritas (R59H e 1622-1627insG) foram encontradas. Este trabalho possibilitou a genotipagem completa de 6 pacientes e parcial de 5, e direcionou a investigação de mutações, contribuindo diretamente no diagnóstico da enfermidade e permitindo a realização de estudos de correlação genótipo/fenótipo destes pacientes. / GM1 Gangliosidosis is a Iysosomal storage disease caused by r3- galactosidase deficiency. As a result of this defect there is a huge accumulation of GM1 ganglioside in tissues of affected patients. Gangliosides are glycosphingolipids present in high concentration in neural tissues. The localization of these lipids explain in part the neurodegeneration present in patients. The r3-galactosidasegene (GLB1-Gene Bank M27507) is located on chromosome 3 and spands more than 60 kb and it is formed by 16 exons. Over than 45 mutations were found in this gene up to now. In southern Brazil the high frequency of GM1 Gangliosidosis (1:17.000 live born) justify the aim of this work, that is to genotype those patients with GM1 Gangliosidosis, by, fist screening they DNA by SSCP (Single Strand Conformational Polimorphism) and than, sequencing in automated apparatus. The screening of 16 exons from 20 patiens gave us the information that 52 mobility changes of DNA Single Strand were found, suggesting possibility of mutations. Samples from exons 2 and 15 were submitted to direct sequencing in ABI310 (Applied Biosystems) using Big Dye3.1 terminator Kit. Five new mutations were found in GLB1 gene (F63Y, R38G, Y36S, Y64F and R59C) and two mutations described previously (R59H and 1627insG). This investigation gave support to complete genotype 6 patients with GM1 Gangliosidosis, partial genotype 5 patients and gave a good support for future analysis in GLB1 gene to correlate genotype and phenotype easily.

A Gangliosidose GM1 é um Erro Inato do Metabolismo (EIM) causado pela deficiência da enzima B-galactosidase ácida. Essa doença é caracterizada pelo acúmulo de metabólitos não degradados, principalmente gangliosídeo GM1, nos lisossomos de vários tipos celulares. Baseado na idade de início e na atividade residual da enzima, a Gangliosidose GM1 é classificada em três diferentes tipos: infantil, juvenil e adulto. O gene da B-galactosidase ácida (GLB1, GeneBank M27507) está situado no cromossomo 3 e possui mais de 60 kb, contendo 16 exons. Cerca de 50 mutações associadas à doença estão descritas na literatura. No sul do Brasil, há uma alta freqüência dessa doença (1:17.000 nascidos vivos). Neste trabalho, vinte pacientes diagnosticados no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (Brasil) tiveram o gene GLB1 investigado por SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) usando DNA extraído de sangue periférico. Através desta triagem foram encontradas 52 alterações de mobilidade do DNA, indicando a presença de mutações. As amostras relativas aos exons 2 e 15 foram submetidas a sequenciamento direto com seqüenciador ABI31O(Applied Biosystens) utilizado kit BigDye 3.1. Cinco novas mutações no gene GLB1 (F63Y, R38G, Y36S, Y64F e R59C) e duas mutações já descritas (R59H e 1622-1627insG) foram encontradas. Este trabalho possibilitou a genotipagem completa de 6 pacientes e parcial de 5, e direcionou a investigação de mutações, contribuindo diretamente no diagnóstico da enfermidade e permitindo a realização de estudos de correlação genótipo/fenótipo destes pacientes. / GM1 Gangliosidosis is a Iysosomal storage disease caused by r3- galactosidase deficiency. As a result of this defect there is a huge accumulation of GM1 ganglioside in tissues of affected patients. Gangliosides are glycosphingolipids present in high concentration in neural tissues. The localization of these lipids explain in part the neurodegeneration present in patients. The r3-galactosidasegene (GLB1-Gene Bank M27507) is located on chromosome 3 and spands more than 60 kb and it is formed by 16 exons. Over than 45 mutations were found in this gene up to now. In southern Brazil the high frequency of GM1 Gangliosidosis (1:17.000 live born) justify the aim of this work, that is to genotype those patients with GM1 Gangliosidosis, by, fist screening they DNA by SSCP (Single Strand Conformational Polimorphism) and than, sequencing in automated apparatus. The screening of 16 exons from 20 patiens gave us the information that 52 mobility changes of DNA Single Strand were found, suggesting possibility of mutations. Samples from exons 2 and 15 were submitted to direct sequencing in ABI310 (Applied Biosystems) using Big Dye3.1 terminator Kit. Five new mutations were found in GLB1 gene (F63Y, R38G, Y36S, Y64F and R59C) and two mutations described previously (R59H and 1627insG). This investigation gave support to complete genotype 6 patients with GM1 Gangliosidosis, partial genotype 5 patients and gave a good support for future analysis in GLB1 gene to correlate genotype and phenotype easily.

O câncer colorretal é um dos tipos de tumores mais frequentes no mundo. A atual dificuldade na avaliação correta da resposta ao tratamento torna necessário o desenvolvimento de novas abordagens de detecção tumoral. Atualmente, o sequenciamento genômico em larga escala permite um estudo mais compreensivo das alterações estruturais e de sequência presentes no tumor. A aplicação destas abordagens de maneira personalizada permite o desenvolvimento de biomarcadores tumor específicos que podem facilitar a avaliação de resposta ao tratamento e a presença de doença residual, bem como revelar alterações de sequência em genes capazes de servir de novos alvos terapêuticos. Neste estudo foi desenvolvida uma metodologia eficiente para a identificação de biomarcadores baseados na existência de variações estruturais em genomas de tumores de reto, eliminando a necessidade de sequenciamento do genoma normal do mesmo paciente e diminuindo portanto o custo da abordagem. Os biomarcadores encontrados para cada um dos seis pacientes foram utilizados para avaliar a presença de doença residual após o tratamento através da detecção de DNA tumoral circulante nas amostras de plasma coletadas em momentos diferentes do tratamento. O sequenciamento em baixa cobertura personalizado é portanto uma alternativa viável e promissora para avaliar a resposta ao tratamento em pacientes com tumores de reto. Na segunda parte do estudo, a análise de linhagens celulares de tumores colorretais revelou uma grande quantidade de mutações pontuais somáticas (SNVs e InDels) em genes codificadores para proteínas de superfície celular (surfaceoma). Estas alterações no surfaceoma indicam potenciais novos alvos para drogas e vias regulatórias alteradas neste tipo de tumor. Além disso, estas mutações pontuais também são responsáveis pela geração de epítopos com potencial imunogênico e estes novos epítopos podem ser aplicados como vacinas antitumorais personalizadas e já haviam sido propostos como uma alternativa terapêutica. A presença de novos epítopos, principalmente nas linhagens com elevadas taxas de mutação (resultante da instabilidade de microssatélites e mutações em genes de reparo de DNA tipo mismatch ou POLE), sugerem também um potencial uso de drogas moduladoras do sistema imune em pacientes com tumores que apresentam estas mesmas características. Portanto, o estudo de alterações genômicas em tumores primários e linhagens de câncer colorretal permitiu a detecção de variações estruturais que foram utilizadas como biomarcadores personalizados em pacientes com tumores de reto assim como a identificação de genes contendo mutações pontuais em linhagens celulares de câncer colorretal, que revelam potenciais novos alvos terapêuticos a serem explorados na clínica / Colorectal cancer is one of the more frequent tumor types in the world. To select the appropriate treatment course, it is necessary to develop more precise diagnostic approaches. The current availability of high throughput genome sequencing methods allows for a comprehensive characterization of the structural and sequence alterations present in each tumor. The use of tumor genome sequencing in a personalized setting can result in tumor specific biomarkers that help evaluate response to treatment and the presence of residual disease, improving the clinical management of these patients, and also reveal sequence alterations in genes capable of serving as new therapeutic targets. In this study we developed an efficient bioinformatics pipeline to identify biomarkers based on the existing structural alterations in rectal tumor genomes, eliminating the need to sequence the matched normal genome and therefore reducing the cost for this approach. The biomarkers found for each of the six patients were used to evaluate the presence of residual disease after treatment through the detection of circulating tumor DNA in plasma samples collected at different points during the treatment. Sequencing tumor genomes with low coverage is therefore a viable and promising alternative to follow up rectal cancer patient\'s response to treatment. In the second part of this study, the analysis of colorectal cancer cell lines revealed a large quantity of point mutations (SNVs and InDels) in genes coding for proteins located in the cell surface (surfaceome). These alterations in the surfaceome indicate potential new drug targets and altered pathways in this type of tumor. Furthermore, these point mutations are also responsible for the generation of new epitopes with immunogenic potential and these new epitopes can be applied as personalized tumor vaccines and had previously been proposed as a therapeutic alternative. The presence of new epitopes, especially in the cell lines with elevated mutation rates (resulting from MSI and mutations in DNA mismatch-repair genes or POLE), suggests a potential use of immune checkpoint target drugs in patients with tumors that share these genetic characteristics. With a large-scale bioinformatics approach, we detected new tumor epitopes resulting from point mutations, present in most of the cell lines used. The analysis of gene expression data puts into perspective both the somatic mutations found and which targets are promising as well as the development of therapies based on vaccines derived from tumor epitopes. In conclusion, the study of genomic alterations in primary tumors and colorectal cancer cell lines allowed the detection of structural variations that were used as personalized biomarkers in patients with rectal tumors as well as the identification of genes containing point mutations in colorectal cancer cell lines, that reveal potential new therapeutic targets to be explored in the clinical setting.

We aimed to characterize well-know PIDs, novel genetic defects and immunopathological mechanisms in Brazilian patients with susceptibility to mycobacterial diseases. The patients developed different mycobacterial diseases and M. tuberculosis was the most frequent species. Molecular and genetic analysis revealed mutations in different genes: RAG1 (P1), CD40LG (P2, P3, P4), NEMO (P5), NCF1 (P6), TLR2 (P7) IL-12Rb2 (P8), IL-12Rb1 (P9), TLR10 (P10), DKC1(P11), SOCS-1(P12) and IRAK2 (P13). Finally, MDMs from patients phagocytose normally but were unable to appropriately control intracellular M. tuberculosis growth in comparison to MDMs from healthy subjects. We concluded that the Brazilian patients have heterogeneous mutations previously associated with susceptibility to mycobacterial diseases and novel genetic variations were identified suggesting novel PIDs. In addition, the inability of MDMs to control the intracellular growth of M. tuberculosis indicates this contributes to patients´ susceptibility to mycobacterial infections. / Objetivamos identificar novos defeitos genéticos e mecanismos imunopatológicos em pacientes brasileiros com suscetibilidade a infecções por micobactérias. Os pacientes foram investigados se portadores de imunodeficiencias previamente caracterizadas tais como SCID, deficiência de CD40L, MSMD, defeitos na sinalização via TLRs e CGD. A análise genética foi realizada por sequenciamento Sanger e \'\'whole exome sequencing\'\' para identificar possíveis novas imunodeficiências primárias. Além disso a função dos macrófagos dos pacientes foi avaliada. Infecções por diferentes espécies de micobactérias foram apresentadas pelos pacientes, sendo M. tuberculosis a espécie mais frequentemente identificada. Mutações em diferentes genes foram encontradas: RAG1 (P1), CD40LG (P2, P3, P4), NEMO (P5), NCF1 (P6), TLR2 (P7), IL-12Rb2 (P8), IL-12Rb1 (P9), IRAK2 (P10), SOCS-1 (P11) e TLR10 (P12). MDMs dos pacientes fagocitaram normalmente M. tuberculosis, porém reduzida capacidade em inibir o crescimento da M. tuberculosis foi observada. Concluímos que os pacientes estudados possuem defeitos moleculares heterogêneos e que os MDMs desses indivíduos apresentam falhas no controle do crescimento da M. tuberculosis. Nossos dados sugerem que esses são fatores subjacentes à susceptibilidade a infecções por micobactérias nesses indivíduos.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:39:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Francisco Weliton Rodrigues.pdf: 26774271 bytes, checksum: c81af1f8ff9812886fda32632000dc44 (MD5) Previous issue date: 2008-09-29 / Pterygium is a disease of unknown origin and pathogenesis that can be vision threatening. Several researchers believe that pterygium is UV-related and that abnormal expression of p53 protein and infection with human papillomavirus (HPV) are risk factors for pterygium, but their experiments have been inconclusive. We investigated its relation with p53 protein expression, p53 gene codon 72 polymorphism and infection with HPV DNA. Pterygial samples were obtained from 36 patients; 21 normal conjunctival samples were used as controls. Expression of p53 protein was studied by Immunohistochemistry, using the antibody DO-7. Analysis for the p53 genotype was made with PCR, using specific primers for the arginine and proline alleles, and an analysis for HPV was made of the pterygium patients and control group. Fourteen of the 36 pterygia specimens were positive for abnormal p53 expression. Thirty one of the patients were heterozygotic and three were homozygotic for the proline allele; two were homozygotic for the arginine allele; in the control group 12 of 21 were heterozygotic and seven of these 21 were homozygotic for the proline allele; two were homozygotic for the arginine allele. Twenty-one of the pterygia patients were positive for HPV; HPV type 1 was found in nine of these, type 2 in seven and both types in five. Only two of the 21 controls had HPV; both had type 16. We suggest that abnormal expression of p53, p53 codon 72 polymorphisms and HPV DNA are required cofactors for the development of pterygium. / O pterígio é uma doença de origem e patogênese desconhecida que pode comprometer a visão. Vários pesquisadores acreditam que o pterígio está relacionado à luz UV e a expressão anormal da proteína p53, além da presença do papilomavírus humano (HPV), como fatores de risco para o seu desenvolvimento, mas os resultados são inconclusivos. Investigamos a expressão da proteína p53, o polimorfismo do codon 72 do gene TP53 e a presença do HPV. Amostras de pterígio foram obtidas de 36 pacientes e 21 escleras normais formaram o grupo controle. A expressão de p53 foi analisada por imunohistoquímica usando anticorpo DO-7. Análise do genótipo de p53 foi realizada por PCR com primers específicos para os alelos arginina e prolina e a presença do HPV foi analisada nos dois grupos. Quatorze amostras de pterígio (39%) foram positivas para expressão anormal de p53. O polimorfismo foi observado em 31 (86%) amostras heterozigotas, 03 (8%) homozigotas para prolina e 02 (6%) homozigotas para arginina, enquanto que no grupo controle foi observado 12 (57%) amostras heterozigotas, 07 (33%) homozigotas para prolina e 02 (10%) homozigotas para arginina. 21 pterígios (59%) foram positivos para HPV e o tipo 01 foi encontrado em 43% (9/21), tipo 02 em 34% (7/21) e os dois tipos simultaneamente em 23% (5/21) amostras do gruppo pterígio. O grupo controle mostrou 9.5% (2/21) amostras positivas para HPV e o tipo 16 nas duas amostras. Nossos dados sugerem que a expressão anormal de p53, o polimorfismo do codon 72 e a presença do HPV podem estar relacionados com o desenvolvimento do pterígio.

A ?-talassemia, uma hemoglobinopatia, é caracterizada como um distúrbio hereditário monogênico onde a síntese das cadeias globínicas ? está alterada. Devido desiquilíbrio na relação entre as cadeias ? e ? produzidas, observa-se um excesso de cadeias ? livres, determinante da fisiopatologia da doença. As manifestações observadas são eritropoese ineficaz, hemólise extramedular, anemia, expansão medular, esplenomegalia, deformidades ósseas e acúmulo de ferro. Clinicamente classifica-se como ?-talassemia major (BTM) a forma mais grave da doença, devido à ausência de cadeias ? (?0) ou redução acentuada (?+) acarretando em dependência de transfusões sanguíneas periódicas, para sobrevivência. O traço ?-talassêmico (BTT) antes vistos como assintomáticos, também apresentam alterações, inclusive acúmulo de ferro e eritropoese ineficaz, mas não são dependentes de transfusão e tampouco passam por acompanhamento médico. Extremamente heterogênea, apresenta diversos fenótipos e mais de 300 alterações moleculares causadoras de ?-talassemia já foram descritas em todo mundo. O objetivo deste estudo foi identificar as mutações de ?-talassemia em Ribeirão Preto-SP e procurar associar tais alterações à avaliação hematológica e do status férrico, na tentativa de estabelecer uma relação genótipo-fenótipo. Para tanto, 27 BTM, 23 BTT e 28 controles foram recrutados no Ambulatório de Hemoglobinopatias, do HC/FMRP-USP de Ribeirão Preto. Por meio de PCR-Alelo Específico, pesquisamos as quatro mutações mais comuns no Brasil: CD39 (CAG->TAG), IVS1-110 (G->A), IVS1-6 (T->C) e IVS1-1 (G ->A). A distribuição foi 64% CD39, 26% IVS1-110 e 4% IVS1-6. A análise de covariância e comparação múltiplas, entre os grupos formados e o controle, revelou alterações hematológicas e no status férrico. Os pacientes BTM com a mutação CD39, em sua forma heterozigota ou homozigota, e heterozigotos para a IVS1-110, revelaram anemia grave e intensa sobrecarga de ferro. Os BTT heterozigotos para CD39 demonstraram comprometimento do metabolismo ferro e/ou eritropoese. A adoção de medidas paliativas e de monitoramento aos BTT faz-se necessária, uma vez que, alterações apresentadas associam-se a desordens graves, mas quando não negligenciadas podem ser facilmente prevenidas. A metodologia adotada demonstrou-se eficaz para a pesquisa das mutações estudadas. Embora tenhamos conseguido observar uma relação genótipo-fenótipo, um estudo multicêntrico da população brasileira proporcionará a identificação de mais relações, principalmente nos fenótipos menos prevalentes em nossa região, contribuindo para a compreensão da heterogeneidade da ?-talassemia. / The ?-thalassemia, one haemoglobinopathies, is characterized as a monogenic hereditary disorder where the synthesis of ? globin chains is modified. Due to imbalance in the relationship between production of ? and ? chains, there is an excess of free ? chain that determines the pathophysiology of the disease. Manifestations observed are ineffective erythropoiesis, extra medullary hemolysis, anemia, bone marrow expansion, splenomegaly, bone deformities and iron accumulation. Clinically is classified as ?-thalassemia major (BTM), the most severe form of the disease, as a result of the absence of ? chains (?0) or very large reduction of these (?+) resulting in dependence on regular blood transfusions to survive. The ?-thalassemia trait (BTT) before seen as asymptomatic, also show changes, including iron accumulation and ineffective erythropoiesis, despite of that they aren\'t dependent on transfusion nor undergo medical care. It is extremely heterogeneous, presents several phenotypes and more than 300 molecular changes that causing ?-thalassemia have been described worldwide. The purpose of this study was to identify ?-thalassemia mutations in Ribeirao Preto-Brazil and to explore changes in hematological evaluation and iron status in an attempt to establish a genotype-phenotype relationship. Therefore, a group of 27 BTM, 23 BTT and 28 controls were recruited from the outpatient clinic of hemoglobinopathies, from The Clinical Hospital of Medical School of Ribeirao Preto (HC / FMRP-USP), Brazil. Adopting the technique ARMS (Amplification Refractory Mutation System), we searched for the four most common mutations in Brazil: CD39 (CAG -> TAG), IVS1-110 (G -> A), IVS1-6 (T -> C) and IVS1-1 (G -> A). The distribution was 64% presents CD39 mutation, followed by IVS1-110 e IVS1-6, with 26% and 4% respectively. Covariance Analysis and multiple comparison between the studies groups and control, showed differences in hematological parameters and in iron status either. The BTM heterozygous or homozygous for CD39 mutation and heterozygous for IVS1-110 revealed severe anemia and iron overload. The BTT heterozygous for CD39 showed impairment of iron metabolism and / or erythropoiesis. It is necessary the monitorization of the BTT patients is necessary, since changes presented by them are associated with serious disorders, the adoption of mitigation measures which when are not neglected can be easily prevented. The methodology proved to be effective for the investigation of mutations studied. While we were able to observe a genotype-phenotype relationship, a multicenter study of the Brazilian population will provide the identification of more relations, especially in less prevalent phenotypes in our region, contributing to the understanding of the heterogeneity of ?-thalassemia.