As Mucopolissacaridoses (MPS) são um grupo de doenças de armazenamento lisossômico causadas por deficiência de enzimas que catalisam a degradação gradual das glicosaminoglicanas (GAGs). GAGs (anteriormente chamadas de mucopolissacarídeos) são produtos de degradação das proteoglicanas que existem na matriz extracelular e tem efeito proteolítico. A classificação das MPS é baseada na deficiência enzimática específica. A MPS IVA é causada por mutações no gene que codifica a enzima GALNS (Nacetilgalactosamina-6-sulfatase), a qual desempenha um papel crucial na degradação do sulfato de queratano e condroitina-6-sulfatase. As mutações na enzima se resumem em três categorias: interrupção do sítio ativo, alterações no núcleo hidrofóbico e exposição da superfície, onde mutações missense na estrutura podem afetar gravemente a atividade da proteína GALNS, alterando seu núcleo hidrofóbico ou modificando seu enovelamento (folding). Com a falta de tratamentos efetivos, sendo em sua maioria paliativos, e tendo como base a estrutura já resolvida da GLANS selvagem, este trabalho teve como objetivo modelar 3 variantes da enzima GALNs, sendo uma mutação no sítio ativo, uma no núcleo hidrofóbico e uma na superfície. Foi usado o software MODELLER 9.12 para a modelagem comparativa, os softwares Prochek, PROSA II, ERRATv2, Verify3d, ProQ para a avaliação dos modelos, o software NAND 2.10, para simulação de dinâmica molecular e o software Chimera 1.10.1 para cálculo de superfícies eletrostáticas e hidrofobicidade da superfície. Os modelos apresentaram bons resultados segundo os softwares de avaliação e análise visual. Apresentaram poucas diferenças estruturais em relação à estrutura da GALNS selvagem, demonstraram estabilidade em simulação de dinâmica molecular. Entretanto, algumas diferenças foram observadas com relação à distribuição de cargas e hidrofobicidade no sítio ativo do modelo da variante com mutação no sítio ativo. Pôde ser concluído que as 3 mutações analisadas não causaram alterações estruturais significativas, não interferiram na estabilidade estrutural em simulação de dinâmica molecular, entretanto, foi demonstrado que mutações na região do sítio ativo podem interferir na função da enzima. / The Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of lysosomal storage diseases caused by deficiencies in enzymes that catalyze the gradual glycosaminoglycans (GAGs) degradation. GAGs (formerly called mucopolysaccharides) are products of proteoglycan degradation that exist in the extracellular matrix and have proteolytic effect. The classification of MPS is based on the specific enzyme deficiency. MPS IVA is caused by mutations in the gene that encodes the GALNS enzyme (Nacetilgalactosamina-6-sulfatase), which plays a crucial role in the degradation of keratan sulfate and chondroitin-6-sulfatase. Mutations in the enzyme can be summarized in three categories: interruption of the active site, changes in the hydrophobic core and display surface, where missense mutations in the structure can seriously affect the activity of GALNS protein, changing its hydrophobic core or modifying its folding. With the lack of effective treatments, in its most palliative, and based on the wild GALNS structure already determined, this study aimed to model 3 variants of GALNS enzyme, a mutation in the active site, one in the hydrophobic core and a on the surface. 9.12 MODELLER was used for comparative modeling software, the software Prochek, Prose II, ERRATv2, Verify3d, ProQ models for the evaluation of the NAND 2.10 software, for molecular dynamics simulation and software Chimera 1.10.1 calculates electrostatic and hydrophobic surface. The models showed good results according to the evaluation software and visual analysis. Presented few structural differences from the wild GALNS structure and showed stability in molecular dynamics simulation. However, some differences were observed with respect to the charge distribution and hydrophobicity in the active site of the variants of the model with a mutation in the active site. It might be concluded that the three mutations analyzed did not cause significant structural changes and did not affect the structural stability in molecular dynamics simulation, however, it has been shown that mutations in the active site region may interfere with the function of this enzyme.

O objetivo deste estudo foi avaliar a plataforma OpenArray para testes genéticos em doadores de sangue e determinar as frequências genotípicas e alélicas de alterações pontuais (SNPs) associadas à trombose venosa (G1691A e G20210A), à hiperhomocisteinemia (C677T, A1298C), e à hemocromatose hereditária (C282Y, H63D e S65C) na população de doadores de sangue de São Paulo, Brasil. Foram analisadas 400 amostras de sangue total coletadas de outubro a novembro de 2011. A detecção dos SNPs foi realizada utilizando a tecnologia de microarray em superfície sólida OpenArray. As amostras também foram analisadas utilizando a técnica de PCR em Tempo Real sistema FRET para comparação dos resultados e determinação da acurácia do sistema OpenArray. Observamos que houve 100% de concordância de resultados entre ambas as técnicas para todas as amostras, em todas as variantes pesquisadas, com exceção da mutação C282Y no gene HFE, a qual apresentou 99,75% de concordância. O resultado da amostra em questão foi posteriormente confirmado por sequenciamento direto (Sanger), que confirmou o resultado fornecido pelo método OpenArray. As frequências calculadas para cada SNP foram: FV G1691A 98,8% (G/G), 1,2% (G/A); FII G2021A 99,5% (G/G), 0,5% (G/A); MTHFR C677T 45,5% (C/C), 44,8% (C/T), 9,8% (T/T); MTHFR A1298C 60,3% (A/A), 33,6% (A/C), 6,1% (C/C); HFE C282Y 96%(G/G), 4%(G/A), HFE H63D 78,1%(C/C), 20,3% (C/G), 1,6% (G/G); e HFE S65C 98,1% (A/A), 1,9% (A/T). Esses resultados descrevem as frequências de SNPs associados a doenças e são importantes para aprimorar o conhecimento atual do perfil genético da população de doadores de sangue brasileiros, embora um estudo maior seja necessário para determinar com a maior acurácia a frequência das mutações pesquisadas. Além disso, observamos que a plataforma OpenArray, demonstrou alta taxa de concordância com o método de PCR em Tempo Real sistema FRET. / The aim of this study was to evaluate the OpenArray platform for genetic testing of blood donors and to assess the genotype frequencies of nucleotide-polymorphisms (SNPs) associated with venous thrombosis (G1691A and G20210A), hyperhomocysteinemia (C677T, A1298C), and hereditary hemochromatosis (C282Y, H63D and S65C) in blood donors from Sao Paulo, Brazil. We examined 400 blood donor samples collected from October to November 2011. The SNPs were detected using OpenArray technology. The blood samples were also examined using a real-time PCR-FRET system to compare the results and determine the accuracy of the OpenArray method. We observed 100% agreement in all assays tested, except HFE C282Y, which showed 99.75% agreement. The HFE C282Y assay was further confirmed through direct sequencing, and the results showed that OpenArray analysis was accurate. The calculated frequencies of each SNP were FV G1691A 98.8% (G/G), 1.2% (G/A); FII G2021A 99.5% (G/G), 0.5% (G/A); MTHFR C677T 45.5% (C/C), 44.8% (C/T), 9.8% (T/T); MTHFR A1298C 60.3% (A/A), 33.6% (A/C), 6.1% (C/C); HFE C282Y 96%(G/G), 4%(G/A), HFE H63D 78.1%(C/C), 20.3% (C/G), 1.6% (G/G); and HFE S65C 98.1% (A/A), 1.9% (A/T).Taken together, these results describe the frequencies of SNPs associated with diseases and are important to enhance our current knowledge of the genetic profiles of Brazilian blood donors, although a larger study is needed for a more accurate determination of the frequency of the alleles. Furthermore, the OpenArray platform showed a high concordance rate with standard FRET RT-PCR

Cerca de 10% dos casos de câncer de mama e/ou ovário são caracterizados como hereditários, onde a presença de mutações germinativas no gene de suscetibilidade BRCA1 aumenta o risco de desenvolver esses cânceres durante a vida da mulher. O BRCA1 é um gene supressor tumoral envolvido na resposta de danos ao DNA, controle do ciclo celular, na remodelação da cromatina, ubiquitinação e regulação da transcrição. O presente estudo tem como objetivo central caracterizar as mutações do gene BRCA1 associadas a Síndrome Hereditária do Câncer de Mama e/ou Ovário (HBOC) em pacientes atendidos no Serviço de Aconselhamento Genético do Câncer do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP/USP). Os vinte e dois éxons codificantes do BRCA1 foram analisados utilizando o método de High Resolution Melting (HRM) para triagem de mutações pontuais, seguido pelo sequenciamento de DNA dos casos selecionados para validação. A técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) também foi usada para detectar grandes deleções e duplicações. Uma vez confirmada a mutação, membros da família considerados de alto risco, serão investigados para a mutação específica, a fim de proporcionar-lhes um aconselhamento genético apropriado para a detecção precoce do câncer. No presente estudo, foram investigados 41 pacientes que preencheram os critérios para o teste genético de acordo com NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology v.1.2010. Um total de 21 mutações foram identificadas, duas das quais são patogênicas: a deleção dos éxons 17-18 e a deleção dos éxon 19. Ambas estão localizadas no domínio BRCT do gene BRCA1, essencial para a ligação de fosfoproteínas críticas para a ativação do complexo de reparo do DNA. Outra mutação, a S616del, foi tratada como patogênica, mas apresenta informações controversas em diferentes estudos. O trabalho também identificou uma nova mutação, Val1117Ile. Um estudo de haplótipos das mutações identificadas nos pacientes foi realizado e revelou que um dos haplótipos, denominado de 6, contendo quatro resíduos mutados (871Leu, 1038Gly, 1183Arg e 1613Gly) estava presente em 50% das pacientes. O estudo de associação com 82 indivíduos saudáveis, mostrou diferença significativa (p=0,026) nos pacientes, sugerindo assim um risco aumentado de HBOC. Adicionalmente, foi analisada a mutação germinativa R337H no gene p53 para os casos suspeitos de Síndrome de Li-Fraumeni. Em síntese, o presente estudo contribui com a identificação de uma nova mutação não-sinônina no gene BRCA1 e sugere que o haplótipo 871Leu-1038Gly-1183Arg-1613Gly possa conferir risco aumentado do câncer de mama e/ou ovário em pacientes diagnosticados com HBOC. / About 10% of cases of breast and/or ovary cancer are characterized as hereditary, where the presence of germline mutations in susceptibility BRCA1 gene increases the risk of developing these cancers during womans lifetime. BRCA1 is a tumor suppressor gene involved in DNA damage response, cell cycle control, chromatin remodeling, ubiquitination and transcriptional regulation. The present study aims to characterize BRCA1 gene mutations associated with Hereditary Breast/Ovary Cancer Syndrome (HBOC) in patients from the Cancer Genetic Counseling Service of the General Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo (HCFMRP-USP). The twenty two coding exons of BRCA1 were analyzed using High Resolution Melting (HRM) method for the screening of point mutations, followed by DNA sequencing of the cases selected to validation. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) technique was also used to detect gross deletions and duplications. Once confirmed the mutation, family members most at risk will be analyzed for the specific mutation in order to provide them with an appropriate genetic counseling for early detection of cancer. In the present study, we investigated 41 patients that fulfilled the criteria for genetic testing according to NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology v.1.2010. A total of 21 mutations were identified, two of them are pathogenic: a deletion of exons 17-18 and a deletion of exon 19. Both of them are located in the BRCT domain of BRCA1 gene, impairing the binding of essential phosphoproteins critical to the activation of DNA repair complex. Another mutation, S616del, shows controversial information about its pathogenesis in different studies.The present study also describes a new mutation, Val1117Ile. A study of haplotypes of the mutations identified in patients was performed and revealed that one of the haplotypes, called 6, containing four mutated residues (871Leu, 1038Gly, and 1183Arg 1613Gly) was present in 50% of patients. The association study with 82 healthy subjects showed a significant difference (p = 0.026) in patients, thus suggesting an increased risk for HBOC. Additionally, the germline mutation R337H on p53 gene was also analyzed in the present study for suspected cases of Li-Fraumeni Syndrome. In summary, this study contributes to the identification of a new missense mutation in the BRCA1 gene and suggests that the haplotype-871Leu-1038Gly 1183Arg-1613Gly may confer increased risk of breast cancer and / or ovarian cancer in patients diagnosed with HBOC.

Esta tese aborda diversos temas em evolução molecular, usando extensivamente o formalismo de funções geratrizes para obter resultados analíticos sempre que possível. Em primeiro lugar, apresenta-se a solução exata para o comportamento dinâmico de uma população infinita de seqüências infinitamente longas (não há mutações reversas) evoluindo sob a ação de mutações deletérias em um relevo adaptativo multiplicativo ou truncado. Além disso, foi estudado o comportamento de uma população submetida a sucessivas diluições de intensidades arbitrárias, como ocorre em alguns protocolos de evolução experimental. Foram obtidas expressões matemáticas que, em princípio, podem ser úteis na caracterização de populações reais de microorganismos. Demonstrou-se também que um processo estocástico de ramificação multidimensional generalizado é uma excelente ferramenta para analisar numericamente os efeitos da degeneração mutacional (especificamente, de um fenômeno denominado catraca de Muller) em populações sob variadas condições de crescimento exponencial. Finalmente, simulações foram extensivamente utilizadas para analisar a história evolutiva de populações finitas e averiguar a possibilidade de certas grandezas, como certas medidas da topologia de árvores genealógicas, serem empregadas na elaboração de testes estatísticos capazes de detectar as marcas deixadas pela seleção natural. / This thesis discusses some topics of molecular evolution, extensively using generating function methods to find analytical results whenever possible. In first place, it gives the exact solution for the dynamics of an infinite population of infinitely long sequences (no back mutations) evolving under the action of deleterious mutations on either multiplicative or truncated fitness landscapes. In addition, the behavior of a population subject to successive dilutions of arbitrary intensity, just like some experimental evolution protocols, is found. The mathematical expressions, in principle, may prove useful in characterizing real populations of microor¬ganisms. It was also demonstrated that a generalized multidimensional branching process is a nice tool in numerically studying mutational degeneration effects (specifically a pheno¬menon called Muller\'s ratchet) in populations under a wide variety of exponential growth settings. Finally, the evolutionary history of finite populations was studied by simulations to probe the viability of certain statistic, like some topological measures in genealogical trees, being incorporated in statistical tests to detect the fingerprints of natural selection.

A mitocôndria é a organela citoplasmática responsável pelo maior sistema produtor de energia, a fosforilação oxidativa (OXPHOS). Foi proposto que em células tumorais a hiper-regulação da glicólise em condições normais de oxigênio (Efeito Warburg), está associada a defeitos na OXPHOS e pode regular o fenótipo tumoral, por exemplo, o potencial metastático da célula por meio da indução de vias pseudohipóxicas durante a normóxia. Estudos recentes mostraram que vários tipos de tumores possuem mutações somáticas em seu genoma mitocondrial, o que pode alterar as funções da OXPHOS levando a troca de metabolismo energético nas células tumorais e induzindo a tumorigênese. Diante disto, o presente trabalho avaliou a instabilidade do genoma mitocondrial em etapas bem definidas da progressão do câncer colorretal. O DNA genômico foi extraído de amostras de adenoma, adenocarcinoma, tecido adjacente e sangue periférico de nove pacientes diagnosticados com Câncer colorretal. O genoma mitocondrial foi amplificado e sequenciado para que fossem feitas as buscas por mutações nas amostras de sangue periférico, adenomas e adenocarcinoma. Foi também medido o número de cópias relativas do mtDNA. Foram encontradas um total de 233 mutações, das quais 162 foram em comum entre os três tecidos avaliados. As amostras de adenocarcinoma foram as que apresentaram uma maior média de mutações por amostra (44,6), seguidas dos adenoma (40,2) e do sangue periférico (34). As amostras de adenocarcinoma apresentaram uma maior instabilidade do mtDNA refletidas a partir de um maior número de mutações somáticas (tanto do tipo InDel como mutações de uma única base), mutações não sinônimas com maior patogenicidade, maior número de mutações em heteroplasmia e com taxa de heteroplasmia elevada. Já as amostras de adenoma apresentaram instabilidade dos seus mtDNA intermediários entre o tecido não tumoral e tumoral, refletindo bem a etapa de modificação celular no qual esses tecidos se encontram. Na análise do número de cópias relativas, as amostras de adenocarcinoma tiveram diminuição no número de cópias relativas quando comparadas com tecido adjacente (p= 0,01) e com adenomas (p= 0,04). Em síntese, o presente trabalho sugere que a instabilidade do genoma mitocondrial parece ter um papel importante no desenvolvimento de tumores colorretais. / The mitochondrion is a cytoplasmic organelle responsible for the major energy producing system, which is the oxidative phosphorylation enzyme pathway (OXPHOS). It was proposed that glycolysis up-regulation during normal oxygen conditions (Warburg effect) may induce defects in the mitochondrial respiration and regulate tumoral phenotypes, for example, metastatic potential through the induction of pseudohipoxic pathways during normoxia. Recent studies have shown that many kinds of tumors have mtDNA somatic mutations, which could alter the OXPHOS functions, leading to changes in glucose metabolismo and improvind tumorigenesis. This study analyzed the mitochondrial genome instability of well defined stages of colorectal cancer. Genomic DNA was extracted from adenoma, adenocarcinoma, adjacente tissue and peripheral blood of patients diagnosed with Colorectal cancer. The mitochondrial genome was amplified and sequenced for mutations screening in adenoma, adenocarcinoma e blood samples. It was also analyzed the relative mtDNA copy number. It was find a total of 233 mutations, which 162 were in common among the three analyzed tissues. The adenocarcinoma samples presented a greater mutation mean per sample (44.6) followed by adenomas samples (40.2) and blood samples (34). The adenocarcinoma samples also shown a greater mitochondrial genome instability refleted by increased of somatic mutations (InDels and single nucleotide variation), non sinonimous mutations with higher patogenicity, increased number of heteroplasmatic mutations and higher heteroplasmatic levels. The adenoma samples showed intermadiate instability of its mtDNA, which well reflects the intermediate stage of cellular modifications of this tissue. The mtDN copy number analysis shown that the adenocarcinoma samples presented decreased number of mtDNA content when compared with adjacente tissue (p= 0.01) and adenoma samples (p= 0.04). In summary the presente study suggests that the mitochondrial genomic instability seems to play an importante role in colorectal tumorigenesis.

Hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença autossômica dominante, caracterizada por elevados níveis plasmáticos da lipoproteína de baixa densidade (LDL), desenvolvimento de xantoma tendíneo e arco corneal, além do aumento do risco de doença coronariana e acidente vascular cerebral prematuros. Frequentemente subdiagnosticada, estima-se que apenas 10% dos 400.000 indivíduos com HF no Brasil têm conhecimento da própria doença; afetando, desta forma, a qualidade e a expetativa de vida dos pacientes. Mutações no gene do receptor da LDL (LDLR) são consideradas as alterações genéticas mais frequentes para o desenvolvimento da hipercolesterolemia familiar, pois comprometem a capacidade de remoção das partículas de LDL circulantes, promovendo seu aumento em níveis plasmáticos. Já foram descritas mais de 1600 mutações diferentes no gene LDLR associadas ao fenótipo da HF; entretanto, ainda é difícil determinar em muitas delas o efeito deletério na atividade do receptor. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar funcionalmente mutações no gene LDLR não descritas na literatura para determinar sua patogenicidade na hipercolesterolemia familiar. Foi avaliada a atividade residual de LDLR através da captação de LDL marcado com fluoróforo lipofílico em cultura de linfócitos T dos pacientes portadores das mutações analisadas após estimulação dos linfócitos T por mitógenos específicos. As mutações Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr foram consideradas patogênicas por acarretarem diminuição da atividade residual do receptor de LDL. As mutações Glu 602X e His388ProfsX53 confirmaram sua patogenicidade e podem ser considerados como controle positivo para futuros ensaios funcionais. Estudos que esclareçam os mecanismos moleculares da HF e da relação genótipo/fenótipo abrem perspectivas para o desenvolvimento de terapias mais específicas na redução dos níveis de colesterol e, consequentemente, da morbidade e mortalidade associadas às doenças cardiovasculares. / Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder characterized by elevated plasma levels of low-density lipoprotein (LDL), and development of corneal arcus tendinous xanthoma, and increased risk of coronary heart disease and premature stroke. Often misdiagnosed, it is estimated that only 10% of the 400.000 patients with FH in Brazil has knowledge of the disease itself, affecting in this way the quality and life expectancy of patients. Mutations in the LDL receptor (LDLR) are considered the most frequent genetic alterations for the development of familial hypercholesterolemia because compromise the ability of removal of circulating LDL particles, promoting its increase in plasma levels. Have been described over 1600 different mutations in the LDLR gene associated with the phenotype of FH, however, it is still difficult to determine in many of the deleterious effects on receptor activity. The aim of this study was to identify mutations in the LDLR gene and functionally characterize mutations not described in the literature to determine its pathogenicity in familial hypercholesterolemia. The residual activity of LDLR was evaluated by raising LDL labeled with lipophilic fluorophore in cultured T lymphocytes of patients with the analyzed mutations after stimulation of T lymphocytes by specific mitogen. The substitution mutations Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr were considered pathogenic because it causes decrease of the residual activity of the LDL receptor in T lymphocytes. The His388ProfsX53 and Glu602X mutations confirmed their pathogenicity and can be considered as positive control for future functional assays. Studies to clarify the molecular mechanisms of HF and genotype/ phenotype open perspectives for the development of more specific therapies for reducing cholesterol levels, and therefore the morbidity and mortality associated with cardiovascular diseases.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-18T15:37:16Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AnaliseConformacionalEnzima.pdf: 2962750 bytes, checksum: a3dc63037d6a89e63bf949b46941a41e (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-11-14T14:05:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AnaliseConformacionalEnzima.pdf: 2962750 bytes, checksum: a3dc63037d6a89e63bf949b46941a41e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-14T14:05:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AnaliseConformacionalEnzima.pdf: 2962750 bytes, checksum: a3dc63037d6a89e63bf949b46941a41e (MD5) Previous issue date: 2017 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Vírus da imunodeficiência humana (HIV), causador da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), é um retrovírus que possui glicoproteínas altamente virulentas que invadem o linfócito TCD4+ através de seus receptores CCR4 e CXCR5. O ciclo biológico do HIV é mediado pelas enzimas protease, transcriptase e integrase. A HIV-1 protease é uma enzima que está presente na fase final do ciclo biológico, onde ocorre a maturação do vírus e é um importante alvo farmacológico. O objetivo principal deste projeto é verificar os efeitos das mutações D30N, I84A e M46I na enzima protease HIV-1 e na formação do complexo com o inibidor nelfinavir através de técnicas de dinâmica molecular e bioinformática. Os resultados baseados nas análises estruturais mostraram diferenças estruturais entre os sistemas estudados. O sistema 1OHR apresentou uma conformação fechada, os sistemas D30N e D30N_I84A_M46I apresentaram conformação semi-aberta e o sistema D30N_I84A apresentou conformação aberta, em que o último apresentou menor valor de energia livre e maior instabilidade nas análises de RMSD, porém a maior flutuação de resíduos de aminoácidos. As análises teóricas mostraram a importância na resistência da dupla mutação D30N_I84A e a capacidade de reestruturação conformacional da mutação M46I e capacidade catalítica. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV), which causes acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), is a retrovirus that has highly virulent glycoproteins that invade the CD4 + T lymphocyte through its CCR4 and CXCR5 receptors. The biological cycle of HIV is mediated by the protease, transcriptase and integrase enzymes. HIV-1 protease is an enzyme that is present in the final phase of the biological cycle, where virus maturation occurs, and is an important pharmacological target. The main objective of this project is to verify the effects of the D30N, I84A and M46I mutations on the HIV-1 protease enzyme and the complex formation with the nelfinavir inhibitor through molecular dynamics and bioinformatics techniques. The results based on the structural analyzes showed structural differences between the studied systems. The 1OHR system presented a closed conformation, the systems D30N and D30N_I84A_M46I presented semi-open conformation and the D30N_I84A system presented open conformation, in which the latter presented lower free energy value and greater instability in the RMSD analyzes, however the greater flotation of residues Of amino acids. The theoretical analyzes showed the importance in the resistance of the double mutation D30N_I84A and the conformational restructuring capacity of the M46I mutation and catalytic capacity.

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são proteínas integrais de membrana caracterizados por possuírem sete alfa-hélices transmembranares. Esses receptores são importantes alvos de estudos biomédicos e aproximadamente 40% dos medicamentos atualmente comercializados agem sobre estes receptores. O receptor de Angiotensina II do tipo 1 (AT1) é um GPCR e o principal mediador do Sistema Renina-Angiotensina que tem como principal efetor o octopeptídeo Angiotensina II (AngII). Recentemente foi descrito que as mutações A244S e I103T-A244S no receptor AT1 podem estar relacionadas com a predisposição à fibrilação atrial. Neste trabalho foi realizada a construção, caracterização bioquímica e farmacológica destes mutantes, bem como do mutante I103T, com o objetivo de compreender como a funcionalidade desses receptores mutantes poderiam contribuir para a predisposição à fibrilação atrial. Os mutantes I103T e I103T-A244S revelaram ser mais eficientes e potentes que o receptor selvagem em aumentar os níveis de cálcio intracelular em resposta à AngII. Todos os mutantes estudados apresentaram baixa eficiência quanto à ativação da via das MAPKs e apresentaram comportamento diferente do receptor selvagem quando bloqueados com o antagonista Losartan, seletivo para o receptor AT1 e muito usado na clínica como medicamento anti-hipertensivo. Esses dados ressaltam a relevância do estudo tanto em termos de melhor compreender as bases moleculares da relação entre as mutações e a doença, bem como possível prevenção ao uso de medicamentos que possam interagir e agir diferentemente em receptores com essas mutações. / G-protein coupled receptors (GPCRs) are integral membrane proteins characterized by having seven transmembrane alpha-helices. These receptors are important targets of biomedical studies and approximately 40% of currently marketed drugs act on such receptors. The angiotensin II type 1 receptor (AT1) is a GPCR and the main mediator of the Renin-Angiotensin System whose main effector is the octapeptide Angiotensin II (Ang II). It was recently described that I103T and A244S mutations in the AT1 receptor may be related to the susceptibility to atrial fibrillation. In this study we carried out the construction of these mutants and their biochemical and functional characterization. The I103T and I103T/A244S mutants were shown to be more efficient and potent than the wild-type receptor on the increase of intracellular calcium levels. All mutants showed lower efficcacy for MAPK pathway activation and showed different behavior when compared to the wild-type receptor after antagonism with Losartan. These data highlight the relevance of the present study concerning a better understanding of the molecular basis of cardiovascular diseases and showing that conventional therapies for certain diseases may lead to adverse effects on patients carrying point mutations on the receptor sequence.

A hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença autossômica dominante causada por mutações no gene do receptor de LDL (LDLR) (cromossomo 19p13.1 - p13.3), que alteram parcialmente ou totalmente a função do LDLR. A HF é também uma das doenças genéticas mais comuns com freqüências estimadas de heterozigotos e homozigotos de 1/500 e 1/1.000.000, respectivamente. Manifesta-se com altos níveis de LDL colesterol, arco corneal, xantomas tendíneos e sintomas prematuros de doença coronariana.. A grande heterogeneidade observada na manifestação clínica desta doença pode ser explicada, ao menos parcialmente, pelo amplo espectro de mutações no gene do LDLR. O presente estudo teve por objetivo a caracterização molecular do gene LDLR em pacientes com HF do Rio Grande do Sul (RS), Brasil. Para isso, foram obtidas amostras de DNA de 40 indivíduos provenientes de cinco macrorregiões do Estado, representando seis diferentes populações de ascendência européia, para a realização do seqüenciamento direto do gene do LDLR, com posterior análise por meio das ferramentas de bioinformática. Quinze mutações pontuais foram identificadas no gene do LDLR, a saber: c.408C>T (D115D), c.1616C>T (P518L), c.1773C>T (N570N) e c.2243A>G (D727G) na região codificadora, IVS6+36G>A, IVS6+171G>A, IVS11+56C>T, IVS11- 69G>T, IVS11-55A>C, IVS15-136A>G, IVS16+46C>T e IVS17-42A>G na região intrônica, e *52G>A, *105T>G e *141G>A na região 3\'-UTR. Destas, oito ainda não foram descritas na literatura (três situadas nos exons, quatro nos introns e uma na região 3\'-UTR). A mutação*52G>A foi previamente identificada em pacientes com HF da região Sudeste do Brasil, sugerindo que possa exercer um importante efeito na patogênese da HF em pacientes brasileiros. Em relação às macrorregiões do RS, os portugueses, italianos e espanhóis apresentaram o maior número de mutações dentre os grupos étnicos analisados. Assim, os resultados obtidos confirmam que existe um amplo de espectro de mutações no gene do LDLR. As mutações nas regiões intrônicas precisam ser investigadas sobre seu efeito potencial no desenvolvimento de HF. Considerando que este é o primeiro estudo que teve por objetivo a caracterização molecular de pacientes com HF no RS, novos estudos que visem a elucidação das bases moleculares da HF devem ser realizados, a fim de obter uma melhor caracterização genética desta doença no Brasil. / Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder caused by mutations in the low-density lipoprotein receptor (LDLR) gene (chromosome 19p13.1 - p13.3), which alter partially or totally the LDLR function. FH is also one of the most common inherited disorders with frequencies of heterozygotes and homozygotes estimated to be 1/500 and 1/1.000.000, respectively. Affected individuals display high levels of LDL cholesterol, arcus corneae, tendon xanthomas and premature symptomatic coronary heart disease. The extensive heterogeneity observed in the clinical manifestation of this disorder may be explained, at least partially, by the broad spectrum of mutations identified in the LDLR gene. The present study had as the main goal the molecular characterization of the LDLR gene in patients with FH from Rio Grande do Sul (RS) State, Brazil. For this, DNA samples were obtained from 40 individuals living in five macroregions of RS, representing six different isolated populations of European ascendancy. The LDLR gene was subjected to the direct sequencing with further analysis through bioinformatics tools. Fifteen punctual mutations were identified in the LDLR gene, namely: c.408C>T (D115D), c.1616C>T (P518L), c.1773C>T (N570N) and c.2243A>G (D727G) in the coding region, IVS6+36G>A, IVS6+171G>A, IVS11+56C>T, IVS11-69G>T, IVS11-55A>C, IVS15-136A>G, IVS16+46C>T and IVS17-42A>G in the intronic region, and *52G>A, *105T>G and *141G>A in the 3\'-UTR region. Of these, eight were not yet described in the literature (three situated in exons, four in introns and one in 3\'- UTR region). The *52G>A mutation was previously identified in FH patients from Southeast Brazil, suggesting that it can exert an important effect in the pathogenesis of FH in Brazilian patients. In relation to the macroregions of Rio Grande do Sul, Portuguese, Italian and Spanish subjects carried the highest number of mutations among the ethnic groups analyzed. Thus, the results obtained confirm the existence of a broad spectrum of mutations in the LDLR gene. The mutations in intronic regions need to be investigated in relation to its potential effect in the development of FH. Taking into account that this is the first study that had as the goal the molecular characterization of FH patients in RS, further studies aimed at elucidating the molecular bases of FH should be performed, in order to obtain the better characterization of this disease in Brazil.

As manifestações bucais da AIDS têm sido relacionadas a diversas características clínicas da infecção pelo HIV como decréscimo de células T CD4+, aumento de carga viral e falha terapêutica, entre outras. Os avanços recentes da medicina mostram que a falha terapêutica, nesses pacientes, está diretamente vinculada a mutações na transcriptase reversa (TR) e na protease (PR). O objetivo deste estudo foi descrever, em pacientes HIV+ apresentando falha terapêutica, o perfil de mutações do vírus e o perfil de resistência a antirretrovirais, e correlacioná-los as manifestações bucais da imunodeficiência. Foram acessados prontuários, laudos de genotipagem e informações de bancos de dados digitais de pacientes com AIDS, que se submeteram a genotipagem no Centro de Referência e Treinamento em Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS (CRT-DST/AIDS), entre 2003 e 2010. Os dados foram transferidos para o Epiinfo, onde foi construído um banco de dados informatizado para posterior análise estatística. O evento lesões orais foi escolhido como variável dependente. Calculou-se o odds ratio para cada variável independente, utilizando intervalo de confiança de 95%. Foram cruzados dados sobre mutações encontradas no vírus e resistência às medicações com a presença e tipo de manifestações bucais. O teste de Bartlett foi utilizado para testar a normalidade dos dados. Para variáveis sem distribuição normal foram aplicados os testes de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis. Para comparação entre frequências e proporções, foi utilizado o Teste de Exato de Fisher ou o Qui quadrado. O nível de significância foi estabelecido como 0,05 ou 5%. A análise de características sociocomportamentais e clínico laboratoriais permitiu verificar que a presença de lesões orais pode ser relacionada estatisticamente a baixas taxas de CD4 (p<0,05), faixa de carga viral (p=0,048) e ao uso prévio de mais de cinco esquemas antirretrovirais diferentes (p=0,021). Verificou-se maior prevalência de lesões virais (75%) e bacterianas (66,7%) do que de lesões fúngicas (37,3%) apenas em pacientes que apresentavam resistência a inibidores de protease (IP) (p=0,02). Foram encontradas 146 mutações diferentes nos pacientes que apresentavam lesões orais, dentre essas, quatro (101E, 20T, 188L, 93L) apresentaram correlação negativa com a presença de lesões orais (respectivamente, p=0,01, p=0,01, p=0,03, p=0,03) e oito (215Y, 118I, 20R, 44D, 71I, 82I E 84V) apresentaram correlação positiva (respectivamente p=0,04, p=0,05, p=0,03, p=0,01, p=0,01, p=0,04, p=0,0004). Subsequentemente, as mutações que apresentaram correlação positiva com a presença de lesões orais foram avaliadas para verificar se sua presença estaria realmente associada a resistência aos ARVs (aos quais seriam supostamente resistentes). Foram excluídas dessa avaliação as mutações 71I e 82I, por apresentarem uma quantidade extremamente pequena de ocorrências. Todas as mutações apresentaram correlação estatística positiva para a resistência aos respectivos antirretrovirais (p<0,05). Em pacientes HIV+, que apresentavam falha terapêutica e manifestações bucais, foram identificadas as mutações 84V e 20R na PR e as mutações 215Y, 44D e 118I na TR e a presença dessas mutações foi associada a resistência a inibidores de protease e inibidores de transcriptase reversa nucleosídeos, respectivamente. / Oral manifestation of AIDS have been associated with several clinical characteristics of HIV infection such as reduction in T CD4+ cells, increase in viral load and treatment failure, among others. Recent advances have shown that treatment failure in these patients is directly linked to mutations in reverse transcriptases (RT) and in proteases (PR). The objective of the present study was to describe the profile of virus mutations and of resistance to antiretroviral drugs in HIV+ patients in treatment failure, and to correlate mutations to the oral manifestations of the immunodeficiency. Patient charts, genotyping results and information from digital databases of AIDS patients, who underwent genotyping at the Sexually Transmissible Diseases and AIDS Training and Reference Center (CRT-DST/AIDS) between 2003 and 2010, were accessed. Data were transferred to the Epiinfo program, in which a computerized database was built for statistical analysis. The event oral lesions was chosen as a dependent variable. Odds ratio for each independent variable was calculated, using a 95% confidence interval. Data found on virus mutations and drug resistance was analyzed to check for correlation with presence and type of oral manifestations. The Bartlett test was used to test normality of data. Mann-Whitney or Kruskal-Wallis tests were used for variables without a normal distribution. The Fisher Exact or Chi-square Tests were used to compare frequencies and proportions. A 0.05 or 5% significance level was established. The analysis of socio-behavioral and clinical-laboratorial characteristics allowed concluding that the presence of oral lesions may be related to statistically low CD4 rates (p<0.05), viral load range (p=0.048) and previous use of more than five different antiretroviral regimens (p=0.021). A higher prevalence of viral (75%) and bacterial (66.7%) lesions in relation to fungal lesions (37.3%) was observed only in patients who were resistant to protease inhibitors (PI) (p=0.02). We found 146 different mutations in patients with oral lesions, among which, four (101E, 20T, 188L, 93L) with a negative correlation with the presence of oral lesions (p=0.01, p=0.01, p=0.03, p=0.03, respectively) and eight (215Y, 118I, 20R, 44D, 71I, 82I E 84V) with a positive correlation (p=0.04, p=0.05, p=0.03, p=0.01, p=0.01, p=0.04, p=0.0004, respectively). Subsequently, mutations with a positive correlation with the presence of oral lesions were assessed to check if their presence would really be associated with resistance to ARVs (to which they supposedly would be resistant to). Mutations 71I and 82I were excluded from this assessment because they had an extremely low frequency. All mutations had a statistically positive correlation for resistance to their respective antiretroviral drugs (p<0.05). Mutations 84V and 20R were identified in PR, and mutations 215Y, 44D and 118I in TR of HIV+ in patients undergoing treatment failure and presenting oral manifestations. Moreover, the presence of these mutations was associated with resistance to protease inhibitors and to nucleoside reverse transcriptase inhibitors, respectively.