Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são proteínas integrais de membrana caracterizados por possuírem sete alfa-hélices transmembranares. Esses receptores são importantes alvos de estudos biomédicos e aproximadamente 40% dos medicamentos atualmente comercializados agem sobre estes receptores. O receptor de Angiotensina II do tipo 1 (AT1) é um GPCR e o principal mediador do Sistema Renina-Angiotensina que tem como principal efetor o octopeptídeo Angiotensina II (AngII). Recentemente foi descrito que as mutações A244S e I103T-A244S no receptor AT1 podem estar relacionadas com a predisposição à fibrilação atrial. Neste trabalho foi realizada a construção, caracterização bioquímica e farmacológica destes mutantes, bem como do mutante I103T, com o objetivo de compreender como a funcionalidade desses receptores mutantes poderiam contribuir para a predisposição à fibrilação atrial. Os mutantes I103T e I103T-A244S revelaram ser mais eficientes e potentes que o receptor selvagem em aumentar os níveis de cálcio intracelular em resposta à AngII. Todos os mutantes estudados apresentaram baixa eficiência quanto à ativação da via das MAPKs e apresentaram comportamento diferente do receptor selvagem quando bloqueados com o antagonista Losartan, seletivo para o receptor AT1 e muito usado na clínica como medicamento anti-hipertensivo. Esses dados ressaltam a relevância do estudo tanto em termos de melhor compreender as bases moleculares da relação entre as mutações e a doença, bem como possível prevenção ao uso de medicamentos que possam interagir e agir diferentemente em receptores com essas mutações. / G-protein coupled receptors (GPCRs) are integral membrane proteins characterized by having seven transmembrane alpha-helices. These receptors are important targets of biomedical studies and approximately 40% of currently marketed drugs act on such receptors. The angiotensin II type 1 receptor (AT1) is a GPCR and the main mediator of the Renin-Angiotensin System whose main effector is the octapeptide Angiotensin II (Ang II). It was recently described that I103T and A244S mutations in the AT1 receptor may be related to the susceptibility to atrial fibrillation. In this study we carried out the construction of these mutants and their biochemical and functional characterization. The I103T and I103T/A244S mutants were shown to be more efficient and potent than the wild-type receptor on the increase of intracellular calcium levels. All mutants showed lower efficcacy for MAPK pathway activation and showed different behavior when compared to the wild-type receptor after antagonism with Losartan. These data highlight the relevance of the present study concerning a better understanding of the molecular basis of cardiovascular diseases and showing that conventional therapies for certain diseases may lead to adverse effects on patients carrying point mutations on the receptor sequence.

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são proteínas integrais de membrana caracterizados por possuírem sete alfa-hélices transmembranares. Esses receptores são importantes alvos de estudos biomédicos e aproximadamente 40% dos medicamentos atualmente comercializados agem sobre estes receptores. O receptor de Angiotensina II do tipo 1 (AT1) é um GPCR e o principal mediador do Sistema Renina-Angiotensina que tem como principal efetor o octopeptídeo Angiotensina II (AngII). Recentemente foi descrito que as mutações A244S e I103T-A244S no receptor AT1 podem estar relacionadas com a predisposição à fibrilação atrial. Neste trabalho foi realizada a construção, caracterização bioquímica e farmacológica destes mutantes, bem como do mutante I103T, com o objetivo de compreender como a funcionalidade desses receptores mutantes poderiam contribuir para a predisposição à fibrilação atrial. Os mutantes I103T e I103T-A244S revelaram ser mais eficientes e potentes que o receptor selvagem em aumentar os níveis de cálcio intracelular em resposta à AngII. Todos os mutantes estudados apresentaram baixa eficiência quanto à ativação da via das MAPKs e apresentaram comportamento diferente do receptor selvagem quando bloqueados com o antagonista Losartan, seletivo para o receptor AT1 e muito usado na clínica como medicamento anti-hipertensivo. Esses dados ressaltam a relevância do estudo tanto em termos de melhor compreender as bases moleculares da relação entre as mutações e a doença, bem como possível prevenção ao uso de medicamentos que possam interagir e agir diferentemente em receptores com essas mutações. / G-protein coupled receptors (GPCRs) are integral membrane proteins characterized by having seven transmembrane alpha-helices. These receptors are important targets of biomedical studies and approximately 40% of currently marketed drugs act on such receptors. The angiotensin II type 1 receptor (AT1) is a GPCR and the main mediator of the Renin-Angiotensin System whose main effector is the octapeptide Angiotensin II (Ang II). It was recently described that I103T and A244S mutations in the AT1 receptor may be related to the susceptibility to atrial fibrillation. In this study we carried out the construction of these mutants and their biochemical and functional characterization. The I103T and I103T/A244S mutants were shown to be more efficient and potent than the wild-type receptor on the increase of intracellular calcium levels. All mutants showed lower efficcacy for MAPK pathway activation and showed different behavior when compared to the wild-type receptor after antagonism with Losartan. These data highlight the relevance of the present study concerning a better understanding of the molecular basis of cardiovascular diseases and showing that conventional therapies for certain diseases may lead to adverse effects on patients carrying point mutations on the receptor sequence.

A troponina I (TnI) é a sub-unidade inibitória do complexo troponina, responsável pela regulação da contração do músculo esquelético. Foi demonstrado que sua ação inibitória sobre a Mg2+ATPase da actomiosina, deve-se principalmente à região entre os resíduos 96 e 116 (região do peptídeo inibitório). Para estudar o mecanismo de inibição a nível molecular, produzimos três mutantes na região do peptídeo inibitório através de mutações sítio-dirigidas. Substituímos os resíduos lisina 105 por ácido glutâmico (K105E), fenilalanina 106 por tirosina (F106Y) e arginina 113 por ácido glutâmico (R113E). As troponinas I mutantes foram expressas em E.coli, purificadas e ensaiadas em sua atividade inibitória, interações com os outros componentes do complexo regulatório e sua capacidade regulatória. Os resultados obtidos indicam que a mutação na posição 105 alterou a interação da proteína com a tropomiosina, diminuindo sua atividade inibitória e afinidade pela actina-tropomiosina. A substituição na posição 113 alterou a interação da proteína com a actina e com a actina-tropomiosina, também diminuindo a atividade inibitória na presença de tropomiosina e inviabilizando a inibição na ausência de tropomiosina. Já a substituição na posição 106 não produziu alteração detectável. Concluímos que o resíduo 105 faz parte do sítio de ligação da troponina I ao complexo actina-tropomiosina e que o resíduo 113 participa diretamente do mecanismo de inibição. Desta forma, definimos duas interfaces de interação da troponina I com o filamento de actina-tropomiosina, necessárias a ligação da troponina I ao filamento e inibição da ATPase. / Troponin I (TnI) is the inhibitory subunit of the troponin complex, responsible for the regulation of skeletal muscle contraction. It has been demonstrated that TnI\'s inhibitory action on Mg2+ATPase of actomyosin is due principally to the region between residues 96 and 116 (the inhibitory region). To study the inhibitory mechanism at the molecular level, we produced three mutants of the inhibitory region by site-directed mutagenesis. We substituted lysine 105 for glutamic acid (K105E), phenylalanine 106 for tyrosine (F106Y) and arginine 113 for glutamic acid (R113E). The TnI mutants were expressed in E. coli, purified and analyzed for their inhibitory activity, interaction with other components of the regulatory complex and regulatory capacity. The results indicate that the mutation in K105E modified the interaction of TnI with tropomyosin, reduced its inhibitory activity and actin-tropomyosin affinity. The mutant R113E displayed modified interaction with actin and actin-tropomyosin, reduced inhibitory activity in the presence of tropomyosin and essentially no inhibitory activity in the absence of tropomyosin. The mutant F106Y behaved essentially like wild-type TnI. We conclude that residue 105 is part of the site by which troponin I binds to the actin-tropomyosin and that residue 113 participates directly in the inhibitory mechanism. In this way, we have defined two interfaces between troponin I and the actin-tropomyosin which are necessary for binding TnI to the filament and to inhibit the actomyosin ATPase.

A troponina I (TnI) é a sub-unidade inibitória do complexo troponina, responsável pela regulação da contração do músculo esquelético. Foi demonstrado que sua ação inibitória sobre a Mg2+ATPase da actomiosina, deve-se principalmente à região entre os resíduos 96 e 116 (região do peptídeo inibitório). Para estudar o mecanismo de inibição a nível molecular, produzimos três mutantes na região do peptídeo inibitório através de mutações sítio-dirigidas. Substituímos os resíduos lisina 105 por ácido glutâmico (K105E), fenilalanina 106 por tirosina (F106Y) e arginina 113 por ácido glutâmico (R113E). As troponinas I mutantes foram expressas em E.coli, purificadas e ensaiadas em sua atividade inibitória, interações com os outros componentes do complexo regulatório e sua capacidade regulatória. Os resultados obtidos indicam que a mutação na posição 105 alterou a interação da proteína com a tropomiosina, diminuindo sua atividade inibitória e afinidade pela actina-tropomiosina. A substituição na posição 113 alterou a interação da proteína com a actina e com a actina-tropomiosina, também diminuindo a atividade inibitória na presença de tropomiosina e inviabilizando a inibição na ausência de tropomiosina. Já a substituição na posição 106 não produziu alteração detectável. Concluímos que o resíduo 105 faz parte do sítio de ligação da troponina I ao complexo actina-tropomiosina e que o resíduo 113 participa diretamente do mecanismo de inibição. Desta forma, definimos duas interfaces de interação da troponina I com o filamento de actina-tropomiosina, necessárias a ligação da troponina I ao filamento e inibição da ATPase. / Troponin I (TnI) is the inhibitory subunit of the troponin complex, responsible for the regulation of skeletal muscle contraction. It has been demonstrated that TnI\'s inhibitory action on Mg2+ATPase of actomyosin is due principally to the region between residues 96 and 116 (the inhibitory region). To study the inhibitory mechanism at the molecular level, we produced three mutants of the inhibitory region by site-directed mutagenesis. We substituted lysine 105 for glutamic acid (K105E), phenylalanine 106 for tyrosine (F106Y) and arginine 113 for glutamic acid (R113E). The TnI mutants were expressed in E. coli, purified and analyzed for their inhibitory activity, interaction with other components of the regulatory complex and regulatory capacity. The results indicate that the mutation in K105E modified the interaction of TnI with tropomyosin, reduced its inhibitory activity and actin-tropomyosin affinity. The mutant R113E displayed modified interaction with actin and actin-tropomyosin, reduced inhibitory activity in the presence of tropomyosin and essentially no inhibitory activity in the absence of tropomyosin. The mutant F106Y behaved essentially like wild-type TnI. We conclude that residue 105 is part of the site by which troponin I binds to the actin-tropomyosin and that residue 113 participates directly in the inhibitory mechanism. In this way, we have defined two interfaces between troponin I and the actin-tropomyosin which are necessary for binding TnI to the filament and to inhibit the actomyosin ATPase.